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 à
 
 


 à
   
à
  

 
 à
! "hydroxybutyrate- -lactate), P(3HB- -LA), podría ser sintetizado en la
recombinación de (à# $
H16), expresando el (

à à propionate) CoA
transferasa (Pctà) gen, el cual permitia la generación de (%)-lactyl-CoA en la celula,



^L1-Blue fue usado en todos los procedimientos de clonacion estándar y fue usado como la cepa
hospedadora para el screening mutagenico de PhaC16-19 and Pctà, y para la síntesis de PLA.

 ! pSYL105 fue tratado con !HI y  RI para obtener  
PHA biosynthesis
operón (à! ), el cual fue insertado en pBluescript II KS(&) resultando pCnCAB..
 Ol gen  
à pCnCAB fue reemplazado por el gen à6-19 en los sitios !
BI
and '(I.
½ Ol gen à6-19 es amplificado en PCR usando los primers 619C1F1,619C1R2 y el DNA
genómico de   sp.
[ On el sitio interno de !
BI, dentro de à6-19 fue removido sin cambio de aminoácidos por
medio de superposición en la PCR usando los primers 619C1F1,619C1R2, 619C1BstBIDF, y
619C1BstBIDR.
£ La región de ³arriba´ el codón iniciador contiene el ribosoma de sitio obligatorio y el sitio !
BI,
sobre la regio final del codón de parada contiene el sitio de restricción '(I, donde amplifica para la
PCR usando los primers ROABF, 619C1R1, 619C1F1, 619C1R2,
619C1F2 y ROABR.
 Ol plasmido resultante fue designado como pPs619C1-CnAB.
  Finalmente el  
à!(gen à! ) en el pPs619C1-CnAB fue reemplazado por el
gen (à
à) sobre los sitios de restricción '(I y )I. Ol gen à
àgene es amplificado por PCR
usando el plasmido (pTac99Pct).
Î Para la eliminación de los sitios internos ()I) dentro de gen (à
à) sin cambios de aminoacidos,
la superposicion PCR fue realizada usando los primers CPPCTFSbfI, CPPCTRNdeI,
CPPCTNdeIDF, y CPPCTNdeIDR.
 Ol plasmido resultante designado como (pPs619C1-CpPCT), contiene el gen (à6-19) y el gen
(à
à) gene, en el cual la expresión del gen correspondiente fue impulsado por el promotor del
operon (à! ).
" On orden para expresar el gen (à! ) que codifica 'ketothiolase (PhaA) and (acetoacetil-CoA) )
(PhaB), un plasmido de expresión fue contruido usando pBBR1MCS.
Produccion fermentativa del acido láctico y la polimerización anulando los genes *, àà, y !
à
+  
 à 


!  
à 

'  el genoma de silico a escala
metabolica.

Ingeniería genómica

1. Delación de los genes *(acetato quinasa), àà(( ( 
à#

' 
), y 
(

, !
 
  fueron realizados usando un método de
inactivación de un solo paso. Reemplazando el gen promotor nativo de
(%-lactate
dehydrogenase) y ((acetyl-CoA synthetase) con el promotor (
à  PCR
utilizando el método la recombinación --Red.
2. Ol plasmido de expresión recombinasa --Red es pKD46, la recombinación en el plasmido pKD46 fue
cultivada a 30°C y la expresión de la recombinasa fue inducida agregando 10mM Larabinose.
3. Para la delecion del gen *, la recombinación homologa del fragmento de PCR se preparo en dos
pasos.
4. Unos 1,234 bp fragmentos de DNA contienen sitios lox71, la resistencia al gen cloranfenicol, y el
sitio lox66 se funden juntas obtenidas por PCR usando los primers FDackA1 y RDackA1.
5. Ol plasmido (pMloxC) el cual contiene la resistencia al gen cloranfenicol flanked por las secuencias
lox. Después la PCR fue tratada con los primers FDackA2 y RDackA2
6. Ol product final de la PCR es introducida por electroporacion dentro de O.coli hospedando
pKD46, que expresa Ȝ-Red recombinasa.
7. La delecion del gen àà( 
 
àimers FDppc1, RDppc1, FDppc2, y
RDppc2, mientras que la delecion del gen (  
 primers FDadhO1,
RDadhO1, FDadhO2, y RDadhO2,de la misma forma que se describió para la delecion del gen ackA.
8. Las mutaciones resistentes al clorofenicol fueron transformadas en el plasmido (pJW168), y la
resistencia a la ampicilina fue selecionada sobre placas de agar LB, conteniendo 100 g/mL
ampicilina y 1mM (isopropil '-%-1-thiogalactopyranoside) a 308°C. todas aquellas colonias que
perdieron la resistencia a clorofenicol fueron selecionadas.
9. Para calmar la regulacion del gen de expression (
el gen promoter nativo de (
(
à
+ à 
à 


 

.--Red recombinación. Ol
fragmento de PCR fue hecho por 3 pasos.
10. Unos 1,189 bp fragmentos de DNA contenienen el sitio lox71,(resistencia al gen clorofenicol), y el
sitio lox66, fue obtenido por PCR usando los primers FPldhA1 y RPldhA1. Ol Plasmido (pMloxC)
fue usado como templado. Ontonces la PCR fue actuada por los primers FPldhA2 y RPldhA2. Para
introducir el promotor (trc) se utilizaron 2 primers, RPldhA1 y RPldhA2, el cual contenían la
secuencia del promotor trc.
11. Ol producto final de la PCR fue introducido por electroporacion entre O.coli hospedando pKD46,
expresando Ȝ-red recombinasa.
Lo del trabajo del estado
(acido láctico)Acido poli
Importancia

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