Вы находитесь на странице: 1из 16

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ


БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ
Кафедра биохимии

«Плесневые грибы – продуценты антибиотиков.


Особенности строения клетки и цикла развития при
ферментации»
Реферат

\
Подготовила:
Титкова Маргарита Сергеевна
студентка 4 курса 51 группы,
специальность биохимия

Преподаватель:
Приступа Кристина Владимировна

Минск, 2020
ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение.................................................................................................................3
1. Плесневые грибы...................................................................................................4
1.1. Общая характеристика плесневых грибов...................................................4
1.2. Плесневые грибы - продуценты антибиотиков............................................4
1.3. Характеристика рода Penicillium, Aspergillus и Cephalosporium
(=Acremonium)........................................................................................................5
2. Антибиотики – продукты жизнедеятельности плесневых грибов...................7
2.1. Общая характеристика продуцируемых плесневыми грибами
антибиотиков.........................................................................................................7
2.2. Характеристика β-лактамных антибиотиков...............................................7
3. Особенности развития плесневых грибов при ферментации.........................10
3.1 Особенности биотехнологического процесса............................................10
3.2 Производство пенициллина и цефалоспорина. Особенности
культивирования.................................................................................................11
Заключение..........................................................................................................15
Список используемых источников....................................................................16

2
ВВЕДЕНИЕ

Много времени прошло с тех пор, как Флеминг впервые обнаружил, что
плесень обладает бактерицидным действием. Это событие стало началом эры
антибиотиков. Наше время нельзя представить без антибиотиков, поэтому
вопросы их изучения и получения уже в промышленных масштабах до сих пор
актуальны.
Одним из продуцентов антибиотиков являются плесневые грибы. К
плесеням относят следующие семейства и виды:
 Penicillium spp.
 Aspergillus
 Moniliaceae
 Dematiaceae
 Fusarium
 Acremonium
 Scytalidium dimidiatum (Nattrassia magniferae)
 Onychocola Canadensis
Плесневые грибы являются продуцентами сотен различных
антибиотиков, но значение для медицины имеют не все. Наибольший интерес
представляют: пенициллин, цефалоспорин, гризеофульвин, трихотецин,
фумагиллин и другие, используемые в медицине и сельском хозяйстве.

3
1. ПЛЕСНЕВЫЕ ГРИБЫ

1.1. Общая характеристика плесневых грибов

Плесневые грибы – это многоклеточные микроорганизмы со сложным


циклом развития. Представители имеют разнообразное морфологическое
строение, они не имеют плодового тела, а их мицелии представлены
различными формами. Мицелии некоторых грибов представляют амебоиды
(отдел Хитридиомикота), других – хорошо развитые субстратные и воздушные
гифы (отдел Зигомикота). Кроме этого многие представители имеют довольно
сложные механизмы размножения и отличаются большим разнообразием
органов плодоношения (рисунок 1).
Плесневые грибы распространены повсеместно. В основном, обширные
колонии вырастают в тёплых влажных местах, в питательных средах. Их
называют пионерами живой природы. Они способны поселяться в самых
экстремальных зонах: в местах повышенной радиации и в зонах вечной
мерзлоты.

1.2. Плесневые грибы - продуценты антибиотиков

Как было сказано ранее, наиболее интересующие человека антибиотики


это: пенициллин, цефалоспорин, гризеофульвин, трихотецин, фумагиллин и
другие, используемые в медицине и сельском хозяйстве.
Некоторые виды грибов могут производить несколько видов
антибиотиков.
Пенициллины могут образовываться определенными видами Penicillium
(P.chrysogenium, P.brevicompactum, P.nigricans, P.turbatum, P.steckii,
P.corylophilum), некоторыми видами Aspergillus (Asp.flavus, Asp.flavipes,
Asp.janus, Asp.nidulans и др.).
Цефалоспорины - основной продуцент Cephalosporium acremonium.
Близкий к цефалоспорину С антибиотик цефамицин С образует актиномицет
Str.clavuligereus.
Фумагиллин, синтезируемый Aspergillus fumigatus, используется в
медицине и ветеринарии.
Гризеофульвин синтезируется некоторыми видами плесневых грибов:
Penicillium nigricans, P.urticae (P.patulum), P.griseofulvum.
Трихотецин синтезируется плесневым грибом Trichothecium roseum,
некоторыми видами несовершенных грибов.

4
1.3. Характеристика рода Penicillium, Aspergillus и Cephalosporium
(=Acremonium)

Грибы рода Penicillium являются лидерами по распространению и


относятся к почвенным микроорганизмам. Гриб имеет ветвящийся,
септированный, бесцветный мицелий, который быстро разрастается и
формирует споры. Penicillium spp. образуют голубую плесень, которая состоит
из гиф и конидиеносцев. На конидиеносцах размещаются веточки, на
верхушках которых располагаются цепочки спор. Такие плесени хорошо
развиваются в плохо вентилируемх и сырых помещениях (рисунок 2).

Рисунок 2 – Рост колоний грибов рода Penicillium

Род Aspergillus представлен многоклеточными грибами. Талом


септирован, сильно разветвлен и состоит из многоядерных клеток. Споры
располагаются на булавовидных вздутиях конидиеносцев. У разных видов
конидии окрашиваются в зеленый, желтовато-зеленый, бурый или черный
цвета (рисунок 3).

Рисунок 3 - Рост колоний грибов рода Aspergillus.

5
Грибы рода Acremonium образуют медленно растущие колонии. Гифы
тонкие и бесцветные. Образуют одиночные фиалиды, но также могут
встречаться и ветвящиеся конидиеносцы (рисунок 4).

Рисунок 3 - Рост колоний грибов рода Acremonium.

6
2. АНТИБИОТИКИ – ПРОДУКТЫ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ
ПЛЕСНЕВЫХ ГРИБОВ

2.1. Общая характеристика продуцируемых плесневыми грибами


антибиотиков.

Антибиотики, создаваемые плесневыми грибами, имеют очень


разнообразное строение:
 Антибиотики, содержащие β-лактамное кольцо – пенициллин и
цефалоспорин (Aspergillus, Penicillium, Acremonium);
 Антибиотики стероидной природы – фузидиевая кислота (Fusidium);
 Антибиотики, содержащие несколько O-гетероциклов - трихотецин
(Trichothecium roseum);
 Антибиотики, являющиеся полиеновыми соединениями – фумагиллин
(Aspergillus fumigatus);
 Кислородсодержащие гетероциклические антибиотики – ризеофульвин
(Penicillium nigricans, P.urticae (син. P.patulum), P.griseofulvum).

2.2. Характеристика β-лактамных антибиотиков.

Данную группу стоит рассматривать более подробно, так как она является
наиболее значимой для медицины. Свое название данная группа получила из-за
того, что важнейшая часть молекулы, от которой зависит бактерицидное
действие, реакционноспособное четырехчленное β-лактамное кольцо (рисунок
5).

Рисунок 5 – Простейший β-лактам

Молекула пенициллина - это бициклическая структура, состоящая из β-


лактамного и тиазолидинового колец, соединенная с определенной для каждого
типа пенициллина боковой цепью. В результате биологического синтеза
образуются: бензилпенициллин, оксибензилпенициллин, пентенилпенициллин,
гептилпенициллин. К синтетическим пенициллинам относят: ампициллин,
оксациллин, диклоксациллин, нафциллин, метициллин и карбенициллин
(рисунок 6).

7
Рисунок 6 – Разнообразие пенициллинов

По химическому строению цефалоспорин принадлежит к β-лактамным


соединениям, но β-лактамное кольцо конденсировано не с пяти, а с
шестичленным гетероциклом (рисунок 7).

Рисунок 7 – Общий план строения цефалоспоринов.

Цефалоспорины в отличие от пенициллинов устойчивы к β-лактамазе,


подавляют развитие и грамположительных и грамотрицательных бактерий, но
активность этого антибиотика ниже пенициллина. Цефалоспорин не
инактивируется пенициллиназой. Но имеется аналогичный фермент,
гидролизующий β-лактамное кольцо цефалоспорина – цефалоспориназа.
В процессе развития Acremonium sp. наряду с цефалоспорином С
синтезируется и пенициллин N. Его образование идёт тем же путём, что и
образование изопенициллина N в процессе биосинтеза бензилпенициллина.
Через ряд стадий из изопенициллина N образуется цефалоспорин С.
Эти антибиотики селективно ингибируют различные этапы построения
клеточной стенки бактерий. Первый этап действия препаратов заключается в их
связывании с клеточными рецепторами; такими рецепторами являются
пенициллинсвязывающие протеины (ПСП), количество которых составляет от 3
до 6 тыс. у различных бактерий. Отдельные ПСП могут иметь неодинаковый
аффинитет к препарату, и каждый из них может опосредовать различное

8
действие. Так, присоединение пенициллина к одному ПСП может вызывать
аномальное увеличение клетки, присоединение к другому – приводить к
дефекту на поверхности клеточной стенки без последующего лизиса клетки.
ПСП контролируется хромосомами, мутации могут изменить их количества и
аффинитет к отдельным β-лактамным препаратам. После связывания β–
лактамнного препарата с рецепторами ПСП ингибируется реакция
транспепдидирования и останавливается синтез пептидогликана. Следующий
этап – устранение или инактивация ингибитора аутолитических энзимов
(гидролаз) в клеточной стенке, что сопровождается активизацией литического
фермента у некоторых микроорганизмов и может привесити к лизису клетки.
Соответственно, β-лактамы активны только в отношении делящихся бактерий.

9
3. ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ ПЛЕСНЕВЫХ ГРИБОВ ПРИ
ФЕРМЕНТАЦИИ

3.1 Особенности биотехнологического процесса

Биосинтез антибиотика осуществляется микроорганизмами на


определённом этапе их развития. Эта закономерность характерна и для
плесневых грибов. Максимально высокую активность штамма-продуцента
способна обеспечить технология рекомбинантных ДНК, так как можно
создавать новые антибиотики с уникальной структурой, оказывающие более
мощное воздействие на определенные микроорганизмы, обладающие
минимальными побочными эффектами. Генно-инженерные подходы
используются для увеличения выхода антибиотиков и соответственно
снижения стоимости их производства.
У промышленных мутантных штаммов антибиотик не должен влиять:
 На собственный биосинтез;
 На жизнедеятельность продуцента.
При проведении первой стадии технологического процесса применяют
натуральные среды неопределенного состава, к числу которых относят
продукты крахмалопаточного производства, агар, желатин, отруби, зерно.
Композиция натуральных сред неопределенного состава не является
постоянной.
Задача второй стадии – создать оптимальные условия для развития
продуцента и максимально возможного биосинтеза необходимого антибиотика.
Особенность производства антибиотиков – двухфазный характер развития
продуцентов.
В первой фазе развития культуры, носящей название тропофазы (фазы
сбалансированного роста микроорганизма), идет интенсивное накопление
биомассы продуцента. Продуцент синтезирует белки, нуклеиновые кислоты,
углеводы, ферменты, и другие БАВ, необходимые для роста микроорганизма;
наблюдается быстрое потребление основных компонентов субстрата,
интенсивное поглощение кислорода. В культуральной среде может снижаться
pH, как результат накопления органических кислот. В тропофазе антибиотик,
как правило, не образуется или его количество незначительное. Возможно, в
этой фазе синтез ферментов, принимающих участие в образовании
антибиотика, подавлен.
Во второй фазе – идиофазе (фазе несбалансированного роста
микроорганизма) – накопление биомассы замедлено. Культуральная среда уже
обеднена компонентами, необходимыми для развития продуцента и обогащена
продуктами его жизнедеятельности. В культуре преобладают протеолитические

10
процессы, приводящие к её подщелачиванию. Продукты метаболизма
микроорганизма частично используются на построение клеток мицелия,
частично – на синтез антибиотика. Максимум биосинтеза антибиотика в
культуральной среде наступает, как правило, после максимального накопления
биомассы, этот максимум неодинаков у разных микроорганизмов и при разных
условиях культивирования.
Очистку антибиотиков проводят повторной заменой растворителя,
адсорбционно-хроматографическими методами, ВЭЖХ. От степени чистоты
препарата, влажности, температура, pH растворителя зависит стабильность
антибиотика. Затем оценивают антимикробный спектр, стерильность,
токсичность, пирогенность, действие на лейкоциты крови и другие показатели.
На всех стадиях получения антибиотика строю соблюдается технологическая
дисциплина, все процессы осуществляются в асептических, условиях.

3.2 Производство пенициллина и цефалоспорина. Особенности


культивирования.

Промышленное производство антибиотиков ведётся в ферментерах, где


продуцирующие антибиотики микроорганизмы культивируются в стерильных
условиях на специальных питательных средах. Большое значение при этом
имеет селекция активных штаммов, для чего предварительно используются
различные мутагены с целью индукции активных форм. Если исходный штамм
продуцента пенициллина, с которым работал Флеминг, образовывал
пенициллин в концентрации 10 ЕД / мл, то современные продуценты образуют
пенициллин в концентрации 16 000 ЕД / мл. Эти цифры отражают прогресс
технологии.
В качестве углеводов часто используют сахарозу или смесь лактозы с
глюкозой в соотношении 1:1. Глюкоза может снижать биосинтез антибиотика;
на средах, содержащих лактозу или сахарозу (в условиях депрессии), биосинтез
антибиотика идёт активнее. Важную роль в процессе биосинтеза пенициллина
играет сера, которая содержится в структуре антибиотика. В качестве
источников серы используются натрия сульфат или натрия тиосульфат.
Избыток ионов меди не влияет на рост гриба, но подавляет биосинтез
пенициллина. Эффект торможения биосинтеза снимается добавлением в среду
ионов железа. P. chrysogenum в качестве источника фосфора может
использовать не только фосфаты, но и фитаты (соли инозитфосфорных кислот):
этот продуцент содержит фермент, разрушающий фитин с освобождением
неорганического фосфора.
Температура в период первой фазы, должна быть 30°С, во вторую фазу
20 °С, pH в период роста гриба – ниже 7,0, потребление углеводов должно быть

11
медленным, что достигается использованием лактозы, либо дробным внесением
глюкозы.
Должна быть хорошая аэрация, т.к. организмы являются аэробами и
кислород необходим для синтеза антибиотика – происходит замыкание β-
лактамного и тиазолидинового колец во время синтеза β-лактамной структуры.
Синтез того или иного пенициллина зависит от наличия специфичного
вещества в среда, иначе говоря, предшественника, который микроорганизм
включает в молекулу антибиотика без предварительного расщепления. Следует
отметить, что предшественники биосинтеза пенициллина (фенилуксусная
кислота, фенилацетамид, феноксиуксусная кислота) при определённых
концентрациях и pH среды оказывают токсическое влияние на продуцента.
Фенилуксусная кислота наименее токсична. Добавление её в среду в
концентрации выше 500 мкг/мл угнетает рост мицелия; особенно в первые 24 ч
его развития. Фенилуксусная кислота добавляется в концентрации от 100 до
500 мкг/мл через 24 ч развития P. chrysogenum. При таких условиях
обеспечивается наибольший выход бензилпенициллина, который через 72 ч
развития может поступать 500-1000 мкг/мл.
При развитии гриба без внесения предшественника образуется около 45%
бензилпенициллина (пенициллин G) и около 53% пенициллина К (радикал – n-
гептилпенициллин). При добавлении к среде фенилуксусной кислоты меняется
соотношение образующихся компонентов в сторону резкого увеличения
бензилпенициллина, количество которого в зависимости от возраста достигает
75-99% от смеси пенициллинов. В процессе культивирования P. chrysogenum в
среде, не содержащей фенилуксусной кислоты, в ней накапливаются
серосодержащие соединения не β-лактамного характера, близкие к цистеину и
метионину. Добавление в среду фенилуксусной способствует более
интенсивному метаболизму серосодержащих компонентов в соединения
β- лактамного характера.
При развитии продуцента пенициллинов – гриба P. chrysogenum – в
кукурузно-лактозной среде выделяют три фазы:
 Первая фаза – рост мицелия, выход антибиотика низок. Всегда
присутствующая в кукурузном экстракте молочная кислота потребляется
продуцентом с максимальной скоростью, лактоза используется медленно.
Потребление кислорода высокое. Усиливается азотный обмен, в результате в
среде появляется аммиак и резко поднимается значение pH.
 Вторая фаза – максимальное образование пенициллина, это связано с
быстрым потреблением лактозы и аммонийного азота. pH среды остаётся почти
без изменений, увеличение массы мицелия незначительное, потребление
кислорода снижается.

12
 Третья фаза – снижение концентрации антибиотика в среде в связи с
начавшимся автолизом мицелия и выделением в результате этого процесса
аммиака, что сопровождается повышением pH среды.
В настоящее время описано шесть условно выраженных возрастных фаз
продуцента пенициллина. Заметное количество пенициллина начинает
образовываться с IV возрастной фазы гриба, максимум накопления приходится
на VI фазу – в период автолиза.
По мере развития гриба меняется и химический состав мицелия.
Количество общего азота и белка в мицелии уменьшается, содержание
моносахаров в период максимального биосинтеза пенициллина (96 ч)
увеличивается почти в 6 раз по сравнению с начальным периодом, количество
дисахаридов уменьшается. Изменяемся количество отдельных аминокислот.
Процесс биосинтеза пенициллина ведётся при самом тщательном
соблюдении стерильности всех операций, так как загрязнение культур
посторонней микрофлорой резко снижает накопление антибиотика. Это связано
с тем, что многие бактерии воздуха способны образовывать пенициллнназу.
Особенно активно продуцируют этот фермент Вacillus subtilis и Вacillus cereus.
Одним из активных продуцентов пенициллиназы является туберкулёзная
палочка (Mycobacterium tuberculosis). Предположительно именно с этим
свойством связана резистентность этого микроорганизма к пенициллину.

Рисунок 8 – Путь синтеза пенициллина

Из культуральной жидкости антибиотик, где он находится в виде


кислоты, выделяют путём экстракции неполярными органическими
растворителями (амилацетатом, хлороформом, бутилацетатом, бутанолом и
13
др.). Очистку антибиотика проводят путём замены растворителей, поскольку
соли пенициллина плохо растворимы в органических растворителях.
Экстрагированный пенициллин в виде кислоты переводят в водный раствор в
виде соли, добавляя щелочь. Повторяя эти операции, пенициллин
концентрируют и очищают.
Сейчас возможно получение антибиотика полусинтетическим способом.
Процесс синтеза цефалоспорина очень похож, на синтез пенициллина и
фазы в том числе, но он устойчив к пенициллазе. Вместе с цефалоспорином С
синтезируется и пенициллин N. Его образование идёт тем же путём, что и
образование изопенициллина N в процессе биосинтеза бензилпенициллина.
Через ряд стадий из изопенициллина N образуется цефалоспорин С.
Большой практический интерес представляют химические модификации
цефалоспоринов: цефапарол, цефатризин, цефамандол, цефакситин.

14
ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Плесневые грибы являются продуцентами целого ряда антибиотиков,


которые способны подавлять развития разнообразных, как грам-
положительных, так и грам-отрицательных бактерий, бактериофагов и
фитопатогенов.
Эти свойства вносят свой вклад в развитие медицины, сельского
хозяйства и тд, а главным инструментом является биотехнология, позволяющая
успешно культивировать микроорганизмы и получать максимальный выход
интересующей нас продукции.

15
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Сазыкин, Ю.О. Биотехнология / Ю.О. Сазыкин, С.Н. Орехов, И.И.


Чакалева. – М.: Академия, 2008. – 256с.
2. Альгология и микология / А.С.Шуканов [и др.] – Минск:БГУ, 2009. –
423с.
3. Основы фармацевтической биотехнологии / Т.П. Прищеп [и др.]. –
Ростов-на-Дону: Феникс, 2006. – 251с.
4. Фармацевтическая микробиология / Т.С. Потехина [и др.]. –
М.:Арнебия, 2003. – 252с.
5. Промышленная технология лекарств / редкол: В.И.Чуешов (гл.ред.) [и
др.]. – Харьков:НФАУ, 2002. – 2т.

16