До начала работы

1) Проверить уровни рабочих растворов

2) Включить компьютер
3) Проверить наличие газа в баллоне, давление рабочего газа, открыть баллон до рабочего
давления (специфично для каждого ДНК синтезатора).

Начало работы
1. Включить ИБП. Включить ДНК синтезатор
2. Запустить программу-клиент ДНК синтезатора.
3. Запустить продув системы газом (нормализацию давления в системе).
4. Подкачать небольшое количество рабочих растворов и мономеров для заполнения
мертвых объемов системы (специфично для каждого ДНК синтезатора).
5. Установить тестовые реакторы. Проверить пропускную способность и герметичность
установленных реакторов. (опционально)
6. Провести тестовый синтез. Выбрать рабочую программу синтеза. Выбрать тестовую
последовательность (обычно ACGT). Установить настройку “не проводить
депротекцию последнего звена”. Запустить синтез тестовой последовательности,
отслеживая каждую стадию депротекции, чтобы оценить уровень снятия
диметокситритильной группы после присоединения нового звена. (опционально)
7. Наполнить реакторы твердой фазой (CPG). Зачастую, используется фаза с пришитым
первым звеном, так что стоит очень внимательно их выбирать и устанавливать, чтобы
не перепутать где какое первое звено. Установить реакторы в синтезатор. Проверить
пропускную способность и герметичность установленных реакторов.
8. Создать файлы синтезируемых последовательностей. Учесть направление синтеза
(обычно, 3”->5”) и то, что первое звено на твердой фазе. Учесть синхронизацию
программ присоединения (если программа одна, этого не требуется) так, чтобы звенья,
присоединяемые по одной программе обрабатывались одновременно (обычно
ДНК-синтезатор может использовать только 1 программу одновременно, так что
синхронизация позволяет зачастую сэкономить время, поскольку нестандартные
программы присоединения.обычно требуют больше времени).
9. Создать синтез: распределить последовательности олигонуклеотидов по реакторам,
выставить программы, выбрать настройки депротекции последнего звена.
Диметокситритильная группа весьма гидрофобна и присутствует только в полностью
синтезированном веществе (незаконченные последовательности теряют их при первой
же депротекции и кэпировании), что позволяет в некоторых случаях использовать эту
разницу в ВЭЖХ для улучшения очистки.
10. Запустить синтез. Отследить первую и вторую депротекцию: первая дает окраску с
твердой фазы, вторая- после первого звена. Так можно оценить эффективность синтеза
и отследить наличие проблем с прибором или процессом.
После синтеза
● Если ДНК синтезатор поддерживает деблокирование в газовой фазе, удаление
защитных групп и отделение синтезированных молекул от твердой фазы можно
провести сразу на приборе. После этого потребуется промыть твердую фазу водой,
растворяя олигонуклеотид, отфильтровать силикаты на целлюлозе, испарить раствор на
лиофильной сушилке и очистить его выбранным методом.
● Если прибор не поддерживает газовое деблокирование, реакторы нужно будет
высушить, извлечь из них твердую фазу и поместить ее в деблокирующий раствор. Для
нативных олигонуклеотидов используется водный раствор аммиака при нагреве (сутки
при комнатной температуре, около 8ч при нагреве до 40⁰С, несколько часов при 60⁰С).
Для модифицированных олигонуклеотидов используются более мягкие условия,
например, с использованием растворов органических аминов, вроде трет-бутиламина.