Вы находитесь на странице: 1из 35

Министерство здравоохранения и социального развития Республики

Казахстан
Южно-Казахстанская медицинская академия
Кафедра фармацевтической и токсикологической химии

РЕФЕРАТ
На тему: Использование газо-жидкостной хроматографии с селективными
детекторами для определения ФОС при судебно-химической экспертизе
трупного материала

Выполнила: Якубова З.З


Группа: В-ФО-06-14 ФР
Приняла: Серикбаева А. Дж

Шымкент, 2018
План

Введение

1. Пестициды

2. Основные требования, предъявляемые к пестицидам

1
3. Физико-химические свойства, метаболизм, токсичность
4. Антихолинэстеразные препараты
5. Фосфорорганические пестициды
6. Методы определения
7. Характеристика некоторых фосфорсодержащих пестицидов

Заключение

Список использованной литературы

Введение

В настоящее время в РК используется около 200 наименований


пестицидов в качестве инсектицидов, акарицидов, зооцидов, бактерицидов,
фунгицидов, гербицидов, дефолиантов, репеллентов и др. Широкое
применение высокотоксичных пестицидов в сельском хозяйстве и в быту
нередко приводит к отравлениям. Кроме того, движение воздуха в атмосфере
2
и воды в гидросфере способствует тому, что при обычной технологии
использования пестициды могут распространяться далеко за пределы
объекта, для которого были предназначены, и накапливаться в окружающей
среде, тканях человека и животных, в лекарственном растительном сырье.

Пестициды
Пестициды — химические средства, применяемые в сельском хозяйстве
для защиты растений от различных видов вредных организмов и сорняков, а
также в гигиене людей и животных. Термин «пестицид» охватывает широкое
разнообразие веществ, имеющих свойство уничтожать нежелательные
формы жизни. Потенциальная опасность для живой природы и людей,
3
непредотвратимость циркуляции пестицидов в биосфере и в связи с этим
контакт большого количества людей с ними отличают пестициды от прочих
химических веществ, используемых человеком. Более тысячи пестицидов
используется сегодня в мире. Большинство из них имеет общепринятые
названия, согласованные с Международной организацией по стандартизации
(International Standardisation Organisation — ISO). Существуют различные
подходы к классификации пестицидов. Их классифицируют по назначению,
способности проникать в организм вредителя, характеру и механизму
действия, токсичности и другим признакам (табл. 8-24). К пестицидам также
относят химические средства, стимулирующие и тормозящие рост растений
(регуляторы роста растений), препараты для удаления листьев растений
(дефолианты), препараты для подсушивания растений (десиканты),
препараты для отпугивания (репелленты) и привлечения (аттрактанты)
насекомых.
Обладая выраженной биологической активностью, пестициды могут
оказывать токсическое действие на организм животных и человека, что
приводит к нарушению работоспособности человека, заболеванию и даже к
смерти. Степень токсичности пестицидов зависит от пути их поступления в
организм (ингаляционный, пероральный, трансдермальный и др.), от
индивидуальных особенностей организма (возраст, пол, наследственность,
заболевания и т.д.) и ряда других факторов. Классификация по степени
опасности отравления предложена специалистами ВОЗ и основана на
величине LD50 пестицидов для крыс в зависимости от пути введения
токсикантов и их агрегатного состояния (табл. 8-25).
Опасность отравления пестицидами зависит от природы соединения, его
агрегатного состояния (жидкая форма пестицида более опасна, чем твердая),
продолжительности контакта, степени летучести токсиканта, его
устойчивости в окружающей среде (персистентность), способности к
кумуляции (накопление в организме). Персистентность очень важна для
оценки токсичности пестицидов. Пестициды делятся по устойчивости в
почве на очень стойкие, период разложения которых составляет более 1 года,
стойкие — от 6 мес до 1 года, умеренно стойкие — 1—6 мес, малостойкие
-до 1 мес.

4
Таблица 8-24. Классификация пестицидов по назначению, способу проникновения и характеру
действия

Таблица 8-25. Классификация по степени опасности отравления

Класс опасности LD,„ для мг/кг массы тела


крыс,
перорально транедермально
твердые жидкие твердые жидки
IA — крайне опасные 5 и менее 20 и менее 10 и менее 40 или мен
IB — высоко опасные 5-50 20-200 10-100 40-400
II — умеренно опасные 50-500 200-2000 100-1000 400-4000
III — мало опасные около 500 около около 1000 около 400
более 2000
2000* более
3000*

5
Основные требования, предъявляемые к пестицидам
Пестициды должны обладать наряду с высокой биологической
активностью по отношению к различным видам вредных организмов и
сорных растений комплексом свойств, обеспечивающих безопасность их
использования. Важнейшими требованиями, предъявляемыми к пестицидам,
являются:
• низкая токсичность для теплокровных животных и человека,
обязательное отсутствие у них бластомогенного, тератогенного, мутагенного,
эмбриотоксического действия и других возможных отдаленных
нежелательных последствий;
• отсутствие резко выраженных кумулятивных свойств;
• способность разлагаться в природных условиях на нетоксичные
компоненты в течение не более 2 лет. Учитывая токсичность пестицидов, а
иногда их малую эффективность, например, резистентность переносчиков
инфекционных заболеваний к пестицидам. Комитет экспертов ВОЗ
предлагает использовать чередование пестицидов, смеси пестицидов,
синергисты пестицидов, чередование малых и больших доз, биологические
методы борьбы. Альтернативой использования ядохимикатов являются
биологические пестициды. При биологической борьбе используются агенты,
являющиеся токсичными только для насекомых-переносчиков или
вредителей. Например, в Индии и Сомали борьбу с малярией ведут с
помощью рыб, поедающих личинок комаров - переносчиков заболевания, а
также клопов-гладышей, выпущенных на рисовые чеки. В Иране с этой
целью используют грибы Lugenidium gigantum. Бактерия Bacillus thuringiensis
продуцирует обширное и неоднородное семейство пестицидных белков.
Многие из них токсичны для сельскохозяйственных вредителей, особенно
бабочек, а два типа (серотип H-14J3 В. thuringiensis и В. sphaericus)
продуцируют протеины, токсичные для личинок комаров и мошки.
Активность H-14J3 В. thuringiensis и В. sphaericus обусловлена 4 различными
белками с относительной молекулярной массой 27 300, 65 000, 128 000 и 135
000 Д. Вполне вероятно, что периодическое применение H-14J3 В.
thuringiensis и В. sphaericus в качестве ларвицида при чередовании с
традиционными инсектицидами позволит предотвратить или отсрочить
выработку резистентности к последним. Полезной тактикой предупреждения
резистентности к бактериальным пестицидам может стать дальнейшее
совершенствование их применения путем переноса генов В. thuringiensis
трансгенным организмам (например, сине-зеленым водорослям) при
сохранении максимального разнообразия пестицидных белков.

Физико-химические свойства, метаболизм, токсичность


Строение и физико-химические свойства пестицидов (изомерия,
устойчивость при нагревании, действии света, влаги и кислорода воздуха,
6
растворимость в воде и органических растворителях, кислотно-основные
свойства, летучесть) должны учитываться при проведении ХТА (выбор
способов пробоподготовки и методов определения, приготовление и
хранение рабочих растворов, растворов сравнения и т.п.).
Диапазон токсичности пестицидов для людей довольно большой.
Известно, что всего 100 мг тербуфоса, принятых внутрь, смертельны для
большинства взрослых людей, в то время как другой пестицид - амитрол
неядовит в дозе нескольких сотен граммов. Даже в пределах одного класса
пестицидов токсичность их может значительно различаться. Метаболиты
многих пестицидов являются более токсичными веществами, чем исходные
соединения. Некоторые пестициды не проявляют высокой токсичности, но
входящие в состав выпускаемых препаратов различные наполнители и
растворители могут быть ядовитыми и служить главной причиной
симптомов отравлений.
Представители одного и того же класса пестицидов имеют сходные
свойства и часто один и тот же механизм действия. Источником отравлений
людей и животных могут быть как сами пестициды, так и различные объекты
внешней среды, содержащие их, например вода, растения, пищевые
продукты, что связано с накоплением пестицидов в окружающей среде и
перемещением их по пищевым цепям. Частая причина отравлений
-несоблюдение правил безопасности при работе с пестицидами в быту и на
производстве (случайные, профессиональные, бытовые отравления).
Встречаются суицидальные отравления пестицидами. У лиц, занятых в
производстве пестицидов или постоянно использующих их, возможно
хроническое отравление, прежде всего из-за способности пестицидов к
кумуляции. При остром отравлении в первую очередь проявляются
специфические симптомы отравления, зависящие от вида и функциональной
роли определенных рецепторов токсичности, с которыми взаимодействует
пестицид или его метаболит. Постепенно появляются признаки поражения
отдельных органов или систем. При хронической интоксикации, в отличие
от острой, проявлению специфических симптомов токсического поражения
предшествует длительный период общесоматических расстройств (головная
боль, головокружение, ломота в суставах, тошнота, рвота).
Антихолинэстеразные препараты
Известно большое количество химических соединений, способных
подавлять активность холинэстеразы (ХЭ). К соединениям, обладающим
таким свойством, относятся пестициды из группы ФОС и производных
карбаминовой кислоты, составляющие значительную часть ассортимента
препаратов, широко используемых в сельском хозяйстве, среди которых
инсектициды, акарициды, гербициды, нематоциды, дефолианты и другие
ядохимикаты. Ведущим звеном в механизме действия этих веществ на
организм человека и животных является нарушение каталитической функции
фермента ХЭ во всех органах и структурах, имеющих холинергическую

7
иннервацию, прежде всего в ЦНС. Поэтому фосфорорганические пестициды
(ФОП) и карбаматы относят к нервным или синаптическим ядам.
Фосфорорганические пестициды
Открытие биологических свойств сложных эфиров фосфорной
кислоты произошло случайно в 1932 г. после выявления сильных
холинергических эффектов у людей при вдыхании паров фторангидрида
диэтилфосфата. В 1934 г. Г. Шредер предложил использовать вместо
никотина в качестве инсектицида тетраэтилпирофосфат. Он же положил
начало разработкам, приведшим к получению «нервных» газов табуна и
зарина. После Второй мировой войны были синтезированы и апробированы
в качестве инсектицидов более 10 ООО веществ класса ФОС. Потенциальное
количество соединений, которые можно создать на основе структуры (рис. 8-
19), предложенной Г. Шредером, оценивается в 250 ООО наименований.
К настоящему времени известно более 100 коммерчески доступных
ФОП, которые ежегодно производятся в количестве 1,5—2,5Т0 5т (табл. 8-26).
К ним относятся эфирные, амидные или тиоловые производные фосфорной
(дихлофос), тиофосфорной (метафос, трихлорметафос, меркаптофос и др.),
дитиофосфорной (карбофос, фосфамид и др.), пирофосфорной, фосфоновой
(хлорофос) кислот.
ФОП представляют собой твердые кристаллические вещества,
бесцветные или желтовато-коричневые, часто маслянистые жидкости.
Многие из них имеют неприятный специфический запах,
низкое давление пара, малорастворимы в воде, хорошо — в липидах.
Большинство ФОП, за исключением дихлорфоса, имеет сравнительно
низкую летучесть, в воде подвергается гидролизу, образуя
неядовитые соединения, опасность отравления которыми значительно
меньше по сравнению с хлорорганическими пестицидами, которые более
продолжительно воздействуют на организм.

Рис. 8-19. Общая структурная формула


ФОС.

Таблица 8-26. Классификация ФОП

Подкласс R, R, А ----------------
X
8
Фосфородитионаты О-алкил О-алкил S- I, S- S
Фосфоротионаты О-алкил О-алкил алк
О- арил
л, О- S
Фосфоротиоаты О-алкил О-алкил алк
S- арил
1, S- О
Фосфаты О-алкил О-алкил О- л, О- О
Фосфонаты О-метил О-метил алк
Алл арил о
Фосфонодитиоаты ал кил О-алкил ил,
S- S
Фосфороамидотиоа О- или S- О-алкил ари9
NH руппа О или S
ты алкил -г

В сельском хозяйстве используют главным образом эмульсионные


концентраты или влагопоглощающие порошки для получения жидких
аэрозолей и гранул. Летучие соединения используют ограниченно. ФОП
легко всасываются через кожу, попадают в организм через дыхательную
систему и ЖКТ. Независимо от способа введения концентрация многих ФОП
в мозге значительно меньше, чем в других тканях, что связано с их плохой
проницаемостью через гематоэнцефалический барьер. Биотрансформация
ФОП происходит путем окисления и гидролиза при действии эстераз, что
приводит к образованию продуктов различной токсичности. ФОП и их
метаболиты выводятся в виде глюкуронидов с мочой и калом. Степень и
время эффекта зависят от природы ФОП. Нейротоксическая активность ряда
ФОП может изменяться в результате биотрансформации. Так, метаболизм
триортокрезилфосфата (ТОКФ) в организме животных протекает с
образованием циклического соединения о-полициклосалегининфосфата,
нейротоксические свойства которого выражены в 5 раз сильнее, чем у
ТОКФ. В процессе превращения лептофоса образуются такие метаболиты,
как лептофосоксон и Рисунок 8- 20 Ингибирование АХЭ ФОП
десбромлептофос, которые в 2—3
раза активнее, чем лептофос. Метаболитом афоса является оксиосфонат,
обладающий более сильным нейропаралитическим свойством. При
окислении паратиона образуется высокотоксичное соединение параоксон.
Некоторые фосфоротиоаты вследствие большей липофильности могут
находиться в организме в неизмененном виде в течение многих дней или
недель, что провоцирует рецидив клинических проявлений после улучшения.
Другие, например дихлофос (0,0-диметил-0-2-2- дихлорвинил фосфат) и
ометоат (диметилфосфоротиоат) быстро гидролизуются в неактивные
соединения и не оказывают пролонгированного токсического действия. Как
правило, ФОП не накапливаются в организме человека. Однако после острой
интоксикации ФОП обнаруживают в жировой ткани в течение нескольких
недель. ФОП нарушают каталитическую функцию ХЭ. Ацетилхолин (АХ)
является медиатором ЦНС, синтезируется в нервных клетках из холина и
уксусной кислоты при участии ХЭ и ацетилко-энзима А. ХЭ локализуется не
в митохондриях нервных клеток (по последним данным), а в цитоплазме,
обладает высоким сродством к мембранным рецепторам. АХ накапливается
в окончаниях нервных волокон, которые отделены от синаптической щели
9
пресинаптической мембраной. За синаптической щелью шириной 20—50 нм
расположена постсинаптическая
мембрана. ХЭ располагается как на
пресинаптической, так и на
постсинаптической мембране.
Нервный импульс, достигая
синаптического окончания,
деполяризует его, в синапсе проис-
ходит обратимое увеличение
концентрации ионов кальция, что и
приводит к выбросу АХ в
синаптическую щель. АХ
взаимодействует на
постсинаптической мембране с
холинорецептором - мембранным
комплексом белковой природы,
имеющим анионный центр, который
реагирует с катионной головкой АХ. Другой участок рецептора
взаимодействует со сложноэфирной группировкой молекулы АХ, что
приводит к открытию или закрытию ионных каналов, возникает
деполяризация мембраны. Антихолинэстеразные вещества нарушают цепь
синаптической передачи возбуждения. Быстрый гидролиз АХ обеспечивают
ферменты ХЭ, среди которых известны ацетилхолинэстераза (АХЭ),
бутирилхолинэстераза (БуХЭ) и бензоилхолинэстераза (БеХЭ). АХЭ
содержится в сером веществе мозга, симпатических ганглиях, нейронах
спинного мозга, эритроцитах, эндоплазматическом ретикулуме, мышцах и
других тканях. Гидроксилсерина и пиридиновый атом азота имидазола в
гистидине -аминокислот, входящих в ХЭ, ответственны за ее реакционную
способность по отношению к АХ. Конформационные изменения молекул
субстрата и фермента обеспечивают высокую каталитическую
эффективность реакции ХЭ и АХ, которая протекает за несколько
миллисекунд. АХЭ играет главную роль в гидролизе АХ. ФОП вызывают
необратимое ингибирование АХЭ, фосфорилируя фермент и накапливая АХ
на чувствительных к нему рецепторах (рис. 8-20). На первой стадии (1)
происходит обратимая конкурентная реакция (обратимое ингибирование
ферментно-субстратного комплекса Михаэлиса),затем фосфорилирование
гидроксила серинового остатка фермента и потеря группировки X (2), далее
возможна реактивация комплекса (3), скорость которой зависит от природы
пестицида, рН среды и наличия оксимов, катализирующих реакцию, или
вторая необратимая стадия (4) — разрыв R-OP связей, в результате чего
ингибитор (ФОП), входящий в комплекс с ферментом, отличается от своей
первоначальной структуры. В результате деалкилирования прочность связи с
ХЭ резко возрастает, т.е. происходит старение комплекса ингибитор—
фермент и гидролиза АХ не происходит. Итак, различие во взаимодействии

10
ХЭ с АХ и ФОС состоит в том, что ацетилированный фермент — очень
непрочное соединение, легко подвергающееся гидролизу, что освобождает
активные центры ХЭ для новых реакций с АХ, а при фосфорилировании
образуется чрезвычайно устойчивое к гидролизу соединение, утратившее
свою каталитическую функцию и неспособное реагировать с АХ.
Устойчивость к гидролизу фосфорилированной ХЭ зависит от характера
алкоксигрупп, связанных с фосфором и увеличивается в последовательности:
диметиловые, диэтиловые, диизопропиловые эфиры фосфорных кислот,
последние практически необратимо угнетают ХЭ.
Строение ХЭ и холинорецепторов имеет много общего, поэтому ФОП
могут взаимодействовать не только с ферментом, но и с холинорецептором
(например, паратион). Большей токсичностью и антихолинэстеразной
активностью характеризуются соединения, в которых атом фосфора связан с
кислородом, а не с атомом серы. Оптические и геометричес-
кие изомеры ФОП проявляют разную антихолинэстеразную активность.
Клиника острой интоксикации ФОП включает мускарино- и
никотиноподобные нарушения, изменения со стороны центральной нервной
и дыхательной систем.
По требованиям ВОЗ, препараты, оказывающие отдаленное
нейротоксическое действие, — ОНД (через 14—21 день, а иногда через 1—5
лет после перенесенного острого отравления), приводящее к стойкой потере
трудоспособности, не допускаются к внедрению в практику. К настоящему
времени механизм ОНД ФОП окончательно не выяснен, не установлена
прямая связь между их антихолинэстеразным и нейропаралитическим
действием. Мишенью ОНД ФОП является специфический белок нервной
ткани, так называемая нейротоксическая (нейропатическая) эстераза (НТЭ).
Фосфорилирование эстеразы сопровождается гидролизом эфирной (Р-О-С)
или амидной (P-N-P) связи ФОП, приводящим к появлению ионизиро-
ванной группы кислого характера. Снижение активности НТЭ регистрируют
задолго до появления клинических признаков нейропатии. Развитие ОНД
связано не только с угнетением НТЭ, но и с последующим ее старением. Под
старением понимают такое изменение структуры фосфорилированной НТЭ, в
результате которого она теряет способность к реактивации. Ингибирование
активности фермента менее чем на 70—80% не обеспечивает старение, и
такие ФОП не вызывают ОНД. У человека похожий на НТЭ фермент
обнаружен в лейкоцитах и тромбоцитах периферической крови. В настоящее
время определение в периферической крови этого фермента рассматривается
как тест, предсказывающий у людей развитие поздних

Достаточно сложно предоставить достоверные данные о летальных


дозах для человека. Считается, что прием внутрь или ингаляционно 10—300
мг паратиона оказывает летальное воздействие на взрослого человека.
Определена смертельная доза диазинона для человека, которая составляет 25
мг при приеме внутрь, средняя летальная доза малатиона равна примерно 60
11
г. Однако известны случаи, когда дети погибали от воздействия 0,1 мг/кг
паратиона. При адекватном лечении можно пережить и воздействие намного
более высоких доз на организм. Лечение острых отравлений включает уход и
специфическую терапию противоядиями для нейтрализации токсического
действия ФОП. Как антидот используют атропин, который является
блокатором М-холинорецепторов. Однако атропин не оказывает
значительного влияния на скорость регенерации ингибированной АХЭ.
Оксимы являются антагонистами ФОС, т.е. это реактиваторы ХЭ. В
результате деалкилирования некоторые ФОС вызывают настолько быстрое
старение комплекса фермент—ФОС, что оксимы уже не могут оказать
действия. При использовании некоторых оксимов возможны тяжелые
последствия, поэтому прежде чем назначать оксимы, необходимо
идентифицировать ФОС.

Методы определения
Доступны и широко используются тысячи пестицидов. Большие запасы
устаревших пестицидов, которые перестали выпускаться в промышленном
масштабе, хранятся на складах и их продолжают применять. Для
окружающей среды, человека и животных пестициды несомненно
представляют опасность. Широкий ассортимент различающихся по своим
свойствам веществ делает задачу их определения чрезвычайно сложной. С
этой целью применяют иммунохимические и хроматографические методы.
Объектами исследования являются различные коммерческие препараты,
продукты домашнего приготовления, косметика, вода, напитки, пища,
объекты окружающей среды, образцы биологических жидкостей и тканей.

Пробоподготовка
Разнообразие химических классов пестицидов и их свойств, характера
объектов исследования (почва, вода, воздух, пищевые продукты,
биологические образцы и т.д.), особенности методов определения влияют на
выбор способа пробоподготовки. В этом разделе будет рассмотрена
пробоподготовка только биологических объектов. Гидролиз конъюгатов
пестицидов и их метаболитов с глюкуроновой, серной или другими
кислотами (иными субстратами) часто является одной из стадий
пробоподготовки биообразцов. Предпочтительным способом гидролиза
конъюгатов пестицидов и их метаболитов является ферментативный
гидролиз, который обычно осуществляется с применением р-глюкуронидазы
и р-арилсульфатазы в течение 12 ч при 37 °С. Экстракция из биологических
жидкостей осложнена тем, что некоторые пестициды легко разрушаются
кислотами или щелочами. Продукты разложения ряда пестицидов, например
производных мочевины, могут вступать во взаимодействие с некоторыми
растворителями, например этанолом или ацетоном. Пестициды изолируют из
12
водной среды, применяя жидкость-жидкостную (ЖЖЭ) или твердофазную
(ТФЭ) экстракции. ЖЖЭ расценивается как более универсальный способ для
скрининга, в то время как ТФЭ предпочтительна при проведении
количественного определения ряда пестицидов в образцах крови или при
извлечении пестицидов определенного химического класса, таких как
кумариновые антикоагулянты или четвертичные аммониевые основания. В
последние годы ТФЭ используют чаще. Использование для ЖЖЭ
растворителей, различающихся по своей природе и полярности,
позволяет получать извлечения с наименьшим количеством соэкстрактивных
веществ. Так, при извлечении ФОП из тканей органов трупа с помощью
гексана или петролейного эфира, смесей гексана и ацетона (в соотношении
90:10 и 70:30 соответственно) получают извлечения с наименьшим числом
соэкстрактивных веществ. Использование в качестве экстрагентов
ацетонитрила, бензола, хлороформа, метанола, этанола значительно
увеличивает массу и число экстрактивных веществ. Твердые образцы
гомогенизируют с равной массой воды. Пищевые продукты, содержимое
желудка, особенно с неусвоенными остатками пищи, или ткани желудка,
гомогенизированные с водой, смешивают с насыщенным раствором кальция
хлорида, оставляют на ночь и фильтруют. Фильтрованный образец или
гомогенат в количестве 5—10 мл встряхивают 5 мин с равным объемом
смеси гексан — толуол (1:1, по объму). Органический слой отделяют
центрифугированием и сохраняют. рН водной фракции доводят до 2,0
добавлением 1 М серной кислоты и затем извлекают равным объемом
диэтилового эфира. Водную фазу сохраняют для дальнейшего исследования.
Толуол-гексановое и эфирное извлечения объединяют и затем разделяют на
равные части. Каждую часть выпаривают досуха при 40 °С в токе азота.
Первый сухой остаток растворяют в 50 мкл толуола или гексана. Аликвоту
от 5 до 10 мкл помещают на пластину для тонкослойной хроматографии,
аликвоту от 1 до 2 мкл подвергают анализу методами ГХ или ГХ-МС. Два
других остатка и водную фазу сохраняют для дериватизации и/или
дополнительных испытаний, которые могут быть частью процедур
подтверждения или скрининга.
Для очистки экстрактов, содержащих пестициды, от балластных веществ
применяют различные способы. Одним из простых способов очистки
экстрактов от липидов на первом этапе очистки является вымораживание. На
последующих этапах применяют экстракционную очистку,
хроматографические методы: препаративную тонкослойную хроматогрфию,
колоночную хроматографию, гельпроникающую или флеш-хроматографию.
Для выделения пестицидов и удаления мешающих примесей также
применяют ультразвуковую, микроволновую, сверхкритическую
жидкостную (СЖЭ), сверхкритическую флюидную экстракцию и др. (см. гл.
5.4 и 6.2). СЖЭ селективна и позволяет использовать небольшие объемы
растворителя. Сверхкритические жидкости имеют плотность, близкую к
плотности обычных жидкостей, но меньшую вязкость и высокий

13
коэффициент диффузии. Автоматизация процесса позволяет проводить
экстракцию и очистку быстро и в один этап. Хорошие результаты получены
для полярных и малополярных пестицидов.
В последние годы усиленно развивается метод микроволновой экстракции.
Он основан на использовании энергии микроволнового излучения и имеет
ряд преимуществ перед другими методами экстракции. Микроволновая
экстракция позволяет количественно извлекать органические соединения из
матрицы за 10—15 мин с использованием минимальных количеств
органических растворителей (2—10 мл растворителя на 1 г образца).
Решить проблему многостадийной пробоподготовки и повысить точность
анализа можно с помощью иммуноаффинной хроматографии (ИАХ),
основанной на биоспецифических взаимодействиях с использованием
иммуносорбентов (Кузнецов П.В., 2002, см. гл. 6.2). Некоторые пестициды
(например, ГХЦГ) из тканей органов можно изолировать перегонкой
с водяным паром.
Газохроматографическое исследование многих пестицидов требует
проведения дериватизации, которая не только улучшает хроматографическое
разделение, но и для многих веществ обеспечивает возможность
использовать этот метод. Кроме того, в некоторых случаях
хроматографический анализ извлечения до и после проведения
дериватизации увеличивает эффективность идентификации методом ГХ, а
для методов ГХ-МС изменения в картине фрагментации могут давать
дополнительную информацию об исследуемом веществе.
Методики дериватизации пестицидов. Трифторацетаты получают
обработкой сухого остатка извлечения 50—100 мкл трифторуксусного
ангидрида и 50 мкл этилацетата при 60°С в течение 15 мин. После
выпаривания смеси остаток растворяют в 50 мкл безводного этилацетата
(1:1) и 2 мкл раствора подвергают анализу методами ГХ или ГХ-МС.
Использование растворителей, содержащих остаточные количества воды,
спиртов или аминов, может привести к гидролизу полученных производных.
Ацетилирование используют вместо трифторацетилирования. 100 мкл
пиридина и 100 мкл уксусного ангидрида добавляют к высушенному
извлечению. Образцы перемешивают взбалтыванием, нагревают до 70 "С 20
мин, высушивают в токе азота и растворяют в 50 мкл этил-
ацетата. От 1 до 2 мкл подвергают анализу методами ГХ или ГХ-МС.
Альтернативно процесс ацетилирования может быть проведен с 50 мкл
смеси уксусного ангидрида и пиридина (3:2 по объему) под действием
микроволнового излучения в течение 5 мин.
Метилирование проводят после выдерживания в течение 2 ч при
комнатной температуре сухого извлечения с 200 мкл не содержащего
метанол раствора диазометана в диэтиловом эфире, затем смесь выпаривают
досуха. Остаток растворяют в 50 мкл метанола, и от 1 до 2 мкл подвергают
анализу методами ГХ или ГХ-МС.

14
Альтернативный способ: высушенный остаток растворяют в 0,5 мл
толуола и 0,5 мл диметилсульфоксида. После добавления 50 мг натрия
гидрида и 0,5 мл метилйодида образец дериватизируют в течение 10 мин при
комнатной температуре. После добавления 2 мл гексана образец
взбалтывают 1 мин. С целью удаления избытка диметилсульфоксида
добавляют 2 мл воды и образец слегка взбалтывают, затем органический
слой удаляют и водную фазу вновь экстрагируют 2 мл гексана и затем 2 мл
этилацетата. Объединенные извлечения высушивают сульфатом натрия в
течение 15 мин и затем концентрируют до 0,1 мл. Возможно использование
других дериватизирующих реактивов и способов дериватизации.
Предварительное исследование пестицидов проводят
хроматографическими методами (ТСХ и ГХ) или ИХМ. ТСХ применяют для
скрининга и идентификации пестицидов в коммерческих препаратах,
добавленных к напиткам или пищевым продуктам, биологических жидкостях
(содержимое желудка, моча) и тканях.
Исследования образцов крови, объектов окружающей среды на
наличие остаточных количеств пестицидов требуют применения более
чувствительной техники ГХ. Наличие в молекулах пестицидов атомов
фосфора, галогенов, сурьмы или мышьяка позволяет использовать
возможности селективных газохроматографических детекторов (АФД, ЭЗД,
пламенно-фотометрический — ПФД), а также газохроматографических
систем, способных одновременно получать сигналы от нескольких из
указанных детекторов или оборудованных современными устройствами для
переключения потоков между хроматографическими колонками разной
полярности (многомерная хроматография).
Арбитражным методом при определении пестицидов считают ГХ
МС. Однако с развитием аналитической техники все большее значение
приобретает ВЭЖХ с масс-селективным детектированием (ВЭЖХ-МС),
особенно при определении термолабильных водорастворимых веществ. В
последние годы разрабатывается скрининговый анализ пестицидов с
использованием ИХМ. Лидирующее положение среди ИХМ определения
пестицидов занимает гетерогенный твердофазный иммуноферментный
анализ (ИФА), технология ELISA. Метод поляризационного
флюоресцентного иммуноанализа (ПФИА) также успешно применяется
для определения пестицидов.

Газовая хроматография
Метод обладает высокой чувствительностью, поэтому широко и успешно
применяется для обнаружения и количественного определения
микроколичеств пестицидов в пищевых продуктах растительного и
животного происхождения, различных объектах окружающей среды,
технических препаратах, биообразцах. Применение метода может
ограничиваться низкой летучестью и термической нестабильностью
15
некоторых пестицидов. Эффективность газовой хроматографии определяется
типом и режимом работы детектора, характером разделительной колонки,
свойствами хроматографируемых соединений, используемой аппаратурой.
Исследование проводят на капиллярных колонках с различающимися по
полярности неподвижными жидкими фазами. Выбор неподвижной жидкой
фазы для решения каждой конкретной задачи требует индивидуального
подхода. Для определения пестицидов часто используют ЭЗД, ТИД, АФД,
ПФД, ПИД и др. Выбор детектора зависит от цели анализа и условий
его выполнения. Для определения ХОП применяют преимущественно ЭЗД,
чувствительный и селективный к галогенсодержащим соединениям,
сульфидам, соединениям с сопряженными двойными связями и некоторым
другим веществам, содержащим атомы с высокой электроотрицательностью
(по шкале Полинга). При определении фосфорсодержащих соединений
используют высокоселективные и чувствительные к фосфор- и
азотсодержащим органическим соединениям ТИД, АФД, ПФД и ПИД.
Газовая хроматография с масс-селективным детектором

Системы ГХ-МС сопровождаются библиотеками, которые содержат спектры


многих пестицидов, их метаболитов и продуктов разложения. В настоящее
время разработано несколько комплексных систем обнаружения и
количественного определения различных пестицидов методом ГХ-МС.
Многие из них используют самые современные методы математической об-
работки получаемой информации, включающей методы деконвалюции
хроматографических пиков, реализованные в программе AMDIS
Национального американского института стандартов (NIST) с последующей
обработкой хемометрическими методами распознавания образов.
Данная система позволяет проводить исследование более 500 пестицидов
разных химических классов в различных объектах (см. электронное
приложение). На рис. 8-30 приведены хроматограммы смеси стандартов
пестицидов и экстракта из биологического объекта на кварцевой
капиллярной колонке длиной 30 м. На рис. 8-31 показаны масс-спектр
фосфорорганического пестицида, обнаруженного в анализируемом экстракте
в количестве 6,1 нг/г и его библиотечный масс-спектр.

16
17
18
Высокоэффективная жидкостная хроматография
Для определения пестицидов ВЭЖХ менее эффективна, чем газовая
хроматография, так как имеет меньшую чувствительность для большинства
веществ и их времена удерживания менее
воспроизводимы. Однако ВЭЖХ
применяется для количественного
определения пестицидов, а также для
проведения подтверждающих исследований,
особенно при наличии МС-детектора.
Современные способы подготовки образцов
(ТФЭ и ЖЖЭ при сверхкритических
условиях) дают возможность повысить
чувствительность определения до уровней
нанограммов на 1 кг или 1 л. Преимущество
этого метода заключается в том, что
нелетучие и водорастворимые пестициды
можно определять на современных
жидкостных хроматографах без
дериватизации. Поскольку разделение и
регистрация пиков производятся при
комнатной (или слегка повышенной)
температуре, этот метод идеально подходит
для работы с веществами, малоустойчивыми
при нагревании.
На рис. 8-32 приведена хроматограмма
смеси ХОП на колонке Exil Суапо 5 мк
длиной 250 мм и внутренним диаметром 4,6
мм. Подвижная фаза — изооктан, скорость
потока 0,75 мл/мин. Детектор УФ при 254
нм. Рис. 8-32. Разделение смесиХОП
При проведении ВЭЖХ используют главным методом ВЭЖХ. (Поясне-ние в
образом силикагели немодифицированные, или тексте.)
1 — алдрин; 2 — гептафтор; 3 —
модицированные С18, или другие, например
ДДТ; 4 — эндрин; 5 — диль-
цианмодифицированные сорбенты. В качестве дрин.
подвижных фаз применяются смеси ацетонитрила с водой
и другие, аналогичные им смеси. Выбор неподвижной и подвижной фаз
сильно зависит от свойств исследуемых веществ и используемого
оборудования (см. гл. 6.3.4).В последние годы для определения пестицидов в
различных объектах применяют капиллярный электрофорез с МС-
детектором — КЭ-МС
Для количественной оценки содержания пестицидов в объектах
исследования применяются ТСХ, ГХ, ГХ-МС, ВЭЖХ, КЭ-МС (см. гл. 6.3 и
электронное приложение).

19
Концентрация пестицидов в биообъектах, взятых от пациентов с острыми
отравлениями, определяет адекватный выбор методов детоксикации и
лечения, особенно когда рассматривается необходимость применения
форсированного диуреза или гемодиализа. При смертельных
отравлениях (в случаях убийств или самоубийств) концентрация пестицидов
в исследуемых объектах (биообразцы, напитки, пища, одежда, почва и др.)
может быть достаточно высокой, что облегчает идентификацию конкретного
пестицида. Количественное определение этого вещества в тканях трупа
позволяет доказать, что отравление вызвано именно этим пестицидом.

Количественное определение используют для мониторинга


концентрации пестицидов в почве, источниках воды, реках, озерах и
пищевых продуктах; в некоторых странах введен законодательный контроль
за допустимым уровнем пестицидов в окружающей среде.

Методы определения отдельных классов пестицидов

Фосфорорганические пестициды
При острых клинических отравлениях диагностическое значение имеет
пониженная активность холинэстеразы. Обнаружение, идентификация и
определение количества специфического агента, ответственного за
отравление, не имеют большого значения в выборе безотлагательного метода
лечения, хотя некоторые из диэтилфосфотиолатов, обладающих
липофильными свойствами, могут накапливаться в тканях в течение
нескольких дней, и у пациентов, которые уже выздоравливают,
может произойти повторное появление симптомов отравления.
Идентификация агента может подготовить клиницистов к та-
кой ситуации.
Определение активности холинэстеразы в плазме, сыворотке
и цельной крови. В организме существует два типа холинэстераз.
АХЭ, которая известна как истинная холинэстераза, содержится в
эритроцитах, нервных окончаниях, легких и тканях мозга. Ее главная
функция — гидролиз АХ в холинергических нервных окончаниях.
Холинэстераза второго типа известна как псевдохолинэстераза (ПХЭ),
содержится в плазме и различных тканях организма. Точная
физиологическая функция ПХЭ неизвестна, но она обладает способностью к
гидролизу различных сложных эфиров, в отличие от АХЭ. Понижение
активности ПХЭ может быть вызвано химическими соединениями, не
являющимися пестицидами, патологией печени и другими факторами
(физиологическими, фармакологическими или генетическими). Поэтому
определение активности АХЭ в эритроцитах является более специфичным
показателем ингибирования холинэстеразы, вызванного пестицидами из
групп карбаматов или ФОП. Кроме того, снижение активности АХЭ
в эритроцитах может обнаруживаться спустя 2—6 нед после воздействия
20
токсиканта, активность ПХЭ плазмы возвращает- ся к норме гораздо
быстрее. Однако на практике активность ПХЭ плазмы — также важный
показатель воздействия на организм пестицидов вышеупомянутых групп:
нормальная активность ПХЭ исключает острое отравление этими
веществами. Некоторые карбаматные гербициды и фунгициды класса
дитиокарбаматов не оказывают существенного влияния на холинэстеразу и
относительно неядовиты для людей. Исследуемые пробы, взятые посмертно
для испытания активности АХЭ, должны храниться при пониженной
температуре и быть проанализированы как можно скорее, чтобы мини-
мизировать возможность спонтанной реактивации фермента. Следует
заметить, что диапазон нормальных значений активности АХЭ зависит от
выбора метода исследования и имеет индивидуальные различия. К
настоящему времени разработано и широко применяется на практике
несколько специальных наборов для определения активности АХЭ в
биологических объектах. В большинстве из них определяют уксусную
кислоту, образующуюся при гидролизе АХ, также применяются наборы,
использующие ИХМ.
Определение ФОП в моче. Большинство соединений этого химического
класса быстро гидролизуются различными ферментными системами
организма с образованием множества метаболитов, их конъюгаты
выделяются с мочой и неустойчивы при хранении. Для получения досто
верных данных о степени отравления и концентрации ФОП важно провести
анализ образцов как можно скорее после инцидента. Образцы мочи должны
быть проанализированы в пределах недели после забора пробы и храниться
при пониженной температуре до анализа.
Многие ФОП могут быть проанализированы без предварительной
дериватизации. Скрининг этих соединений проводится методом газовой
хроматографии с многодетекторной системой. При этом наиболее часто
применяются комбинации детекторов: ПИД—АФД, ПИД—АФД — ДЭЗ ,
иногда к ним добавляются ПФД или МС-детектор. Применение АФД
десятикратно увеличивает чувствительность обнаружения ФОП по
сравнению с использованием ПИД. Это очень важно, потому что многие
ФОП высокотоксичны и их концентрации в биообъектах низки.
Фрагментация этих соединений при использовании масс-спектрометрии
характеристических ионов (интенсивность которых очень варьирует от
вещества к веществу) позволяет определить химический класс соединений.
Молекулярные ионы ФОП обнаруживаются при использовании ВЭЖХ с
ионизацией электронным ударом. Протонированные и содержащие
положительно заряженный четвертичный атом азота молекулы могут быть
детектированы в режиме обнаружения положительно заряженных ионов без
фрагментации. Фосфаты и фосфо- дитионаты дают лучший результат, чем
другие химические классы. Фосфодитионаты с такими заместителями в
кольце, как хлор, бром или нитрогруппа, образуют особенно интенсивные
пики. Масс-спектры, полученные при работе в режиме обнаружения

21
отрицательно заряженных ионов, позволяют определить большее количество
сопутствующих соединений.
Характеристика некоторых фосфорсодержащих пестицидов

Тиофос

диэтиловый эфир п-нитрофенокситиофосфорной кислоты

Тиофос представляет собой маслянистую жидкость со слабым запахом


чеснока, при температуре 6,1 °С затвердевает. Тиофос малорастворим в воде,
но хорошо растворяется в органических растворителях. Промышленностью
выпускается в виде концентрата эмульсии 30%, из которого готовят 0,03-
0,05% водные разведения и используют как инсектицид. При легкой форме
отравления тиофосом наблюдается общая слабость, головокружение, вялая
реакция зрачков. При отравлении средней тяжести - головокружение, беспо-
койство, рвота, понос, маскообразное лицо, дрожание рук, головы,
понижение сухожильных рефлексов. При тяжелых формах возникают
клонико-тонические судороги, кома с глубокой потерей сознания, отек
легких.

В организме у тиофоса отщепляется сера, и образуется более ядовитое


соединение - параоксон (летальный синтез).

При вскрытии трупов обычно


наблюдают отек легких, головного мозга, полнокровие внутренних органов.

МЕТАФОС

Метафос (метилпаратион, вофатокс, метацид, фолидол) —0,0-диметил-0-(4-


нитро-фенил) -тиофосфат — является ядохимикатом, принадлежащим к
органическим соединениям фосфора (производным тиофосфорной кислоты).
22
Метафос — белое кристаллическое вещество (т. пл. 35— 36 °С). Слабо
растворяется в воде (при 25°С в 1 л воды растворяется 55 мг препарата) и
парафиновых углеводородах, хорошо растворяется в большинстве других
органических растворителей.

При гидролизе метафоса в воде образуется n -нитрофенол и


диметилтиофосфорная кислота. В щелочной среде скорость гидролиза
метафоса увеличивается. В растениях он гидролизуется быстрее, чем в воде.
При нагревании до 140—160 °С метафос почти полностью превращается в
тиоловый изомер:

Технический метафос представляет собой желтую или коричневую


жидкость с неприятным запахом. Он содержит примеси n -нитрофенола,
триметилтиофосфата и др. Метафос выпускается в виде 2,5 %-го дуста, 20 %-
го концентрата эмульсии и 30 %-го смачивающегося порошка.

Метафос применяется как контактный инсектицид и акарицид для


обработки плодовых деревьев, виноградников, зерновых, овощных и
технических культур.

Метафос относится к сильнодействующим ядовитым веществам.


Обладает резко выраженной токсичностью, местного действия не оказывает.
При пероральном введении метафос быстро проникает в кровь. При
отравлении метафосом уменьшается содержание гемоглобина, но
увеличивается количество метгемоглобина в крови и т. д.

Выделение метафоса из биологического материала. Для этой цели


применяют метод, который описан для выделения карбофоса из
биологического материала.

Обнаружение метафоса

С целью обнаружения метафоса применяют реакцию с растворами о


-дианизидина и пербората натрия (NaBO 3 ·4H 2 O), а также метод
хроматографии в тонком слое силикагеля.

Реакция с о -дианизидииом и перборатом натрия. В пробирку вносят


1 мл ацетонового раствора исследуемого вещества, прибавляют 0,5 мл 3%-го
свежеприготовленного ацетонового раствора о-дианизидина и 2 мл 1,25 %-го
свежеприготовленного раствора пербората натрия. В зависимости от
содержания метафоса через 5—30 мин раствор приобретает желтую или
23
красноватую окраску. Если смесь реагирующих веществ довести до рН=
10...11, то чувствительность реакции повышается в 3—4 раза.

Эту реакцию дают и другие фосфорсодержащие органические


соединения (хлорофос, фосфамид, тиофос и др.).

Карбофос

диметиловый эфир Б-[1,2-ди-(карбоксиэтил)]-дитиофосфорной кислоты

Карбофос - это бесцветная маслянистая жидкость с характерным


неприятным запахом, мало растворяется в воде и предельных углеводородах.
Растворяется в большинстве органических растворителей. Карбофос
выпускается в виде 30-60% концентрата- эмульсии, которая после разведения
применяется в качестве контактного инсектицида и акарицида в борьбе с
тлями, клещами на плодовых и полевых культурах.

Токсическое действие карбофоса по сравнению с тиофосом менее


выражено и развивается медленнее. Основные симптомы отравления:
слюнотечение, рвота, понос, одышка, цианоз, клонические судороги.

В организме карбофос подвергается окислению с образованием


малаоксона, который обладает выраженной антихолинэстеразной
активностью.

Хлорофос

диметиловый эфир 2,2,2-трихлор-1-оксиэтилфосфоновой кислоты

Хлорофос - это белый кристаллический порошок, растворим в воде,


бензоле, хлороформе и других органических растворителях. Он
24
малорастворим в предельных углеводородах. Хлорофос выпускается в виде
порошка, содержащего 80% основного вещества. В виде 0,1-0,3% водного
раствора применяется как контактный и кишечный инсектицид для
обработки садов, виноградников, зерновых, бахчевых и других культур. В
быту применяются 0,3% растворы для борьбы с мухами, обработки жилых
помещений.

Токсическое воздействие на человека ниже по сравнению с тиофосом и


проявляется в раздражающем действии на кожу и слизистые оболочки глаз,
понижении активности холинэстеразы в крови. При хронических
отравлениях наблюдаются нарушения функции печени и сердечно-
сосудистой системы.

В организме продуктом разложения хлорофоса является дихлофос (Д


ДВФ - диметиловый эфир 2,2-дихлорвинилфосфорной кислоты), который
обладает более выраженным холинэстеразным эффектом.

При
гидролизе ДДВФ образуется диметилфосфорная кислота и дихлорвиниловый
алкоголь, который окисляется в дихлоруксусный альдегид.

25
Методы изолирования и обнаружения фосфорсодержащих
пестицидов

Из биологических объектов тиофос, трихлорметафос-3, карбофос


извлекают органическими растворителями. Для очистки полученных
извлечений используют методы: вымораживание липидов при низких
температурах, реэкстракцию, иногда рекомендуется колоночная
хроматография.

Карбофос, тиофос. К 100 г измельченного биологического материала


добавляют воду до кашицы, 100 мл хлороформа (или беизола) и смесь
оставляют на 4 ч при периодическом перемешивании. Затем органический
растворитель сливают и настаивают объект с растворителем еще 2 раза (по 50
мл) в течение 2 ч при взбалтывании. Экстракты объединяют, фильтруют и
выпаривают досуха. Остаток растворяют в 10 мл хлороформа и исследуют.

Для извлечения трихлорметафоса-3 используют также ацетон,


хлороформ или их смесь.

Хлорофос. 100 г измельченного биологического материала заливают


150 мл воды очищенной, подкисляют серной кислотой до рН=2-2,5 и
оставляют на 2 ч. Затем извлечение процеживают через марлю. К объекту
еще 2 раза добавляют воду очищенную (каждый раз по 75 мл) и настаивают
по часу. Полученные извлечения объединяют, центрифугируют и
экстрагируют 30 мл хлороформа 4 раза. Хлороформные экстракты объе-

26
диняют, выпаривают до сухого остатка, который растворяют в 5 мл воды
очищенной, раствор фильтруют и анализируют.

Предварительное исследование на фосфорорганические пестициды

Холинэстеразная проба. В основе реакции - способность


фосфорсодержащих органических соединений снижать активность
ацетилхолинэстеразы. Она является общей для фосфорорганических
ядохимикатов.

Ацетилхолин (гидроксид (2-ацетоксиэтил) триметиламмония) в


присутствии ацетилхолинэстеразы способен разлагаться с образованием
уксусной кислоты. Этот процесс можно зафиксировать, если к смеси
добавить индикатор бромфеноловый синий.

При появлении в растворе уксусной кислоты окраска индикатора


меняется от синей до желтой. Если в растворе присутствует
фосфорорганическое соединение, являющееся ингибитором
ацетилхолинэстеразы, то разложение ацетилхолина до уксусной кислоты не
происходит и окраска бромтимолового синего не меняется.

Для проведения испытания в фарфоровую чашку вносят индикатор,


каплю исследуемого раствора (извлечения из объекта) и каплю раствора
холинэстеразы (или плазмы крови, содержащей этот фермент). Через 10 мин
добавляют каплю раствора ацетилхолина. Если окраска раствора меняется на
желтую, делают вывод о необнаружении в объекте фосфорорганических
ядохимикатов.

Пробе придается судебно-химическое значение при отрицательном


результате из-за ее неспецифичности, так как некоторые другие соединения
(например, севин, эзерин) могут также подавлять активность
ацетилхолинэстеразы, хотя и не содержат в своей молекуле фосфор.

Обнаружение фосфора. В тигель вносят 0,2-0,3 г смеси из 2 частей


безводного карбоната натрия и 5 частей пероксида натрия. К полученной
смеси добавляют несколько капель полученного извлечения го объекта.
Тигель осторожно нагревают до выпаривания жидкости. Затем усиливают
нагревание до расплавления смеси. После охлаждения остаток переносят в
фарфоровую чашку, добавляют немного карбоната натрия и 10 мл воды,
27
растирают, фильтруют. В полученном растворе могут быть фосфаты,
сульфаты, галогениды, арсенаты. Обнаружению фосфора мешают арсенаты.
Чтобы их удалить, добавляют хлороводородную кислоту до рН=0,5 и
пропускают сероводород. При наличии арсенатов выпадает осадок сульфида
мышьяка. Осадок отфильтровывают и в фильтрате обнаруживают фосфат-
ионы.

В пробирку вносят 3-5 капель фильтрата (свободного от арсенатов),


добавляют 5 капель молибдата аммония и 10% азотную кислоту. При
наличии фосфатов появляется желтая окраска. К полученному раствору
добавляют 3-5 капель насыщенного водного раствора гидрохлорида
бензидина и 10% раствор аммиака до щелочной реакции (по лакмусу). При
наличии фосфат-ионов появляется синяя окраска.

При получении положительных результатов предварительных реакций


проводят исследование на индивидуальные вещества из группы
фосфорсодержащих пестицидов.

Обнаружение тиофоса

Реакция с о-анизидином. К 1 мл хлороформного раствора остатка


прибавляют 0,5 мл раствора о-анизидина и 2 мл раствора пербората натрия
(№ВО,-4Н20). Через 5-30 мин появляется окрашивание от желтого до
красноватого цвета в зависимости от количеств тиофоса.

Метод ТСХ. На хроматографическую пластинку со слоем силикагеля,


закрепленного крахмалом, наносят 2 капли хлороформного раствора остатка.
Рядом наносят хлороформный раствор «стандарта». Пластинку помещают в
систему растворителей н-гексан - хлороформ (1:2). После
хроматографирования пластинку подсушивают и опрыскивают смесью
растворов бромфенолового синего и нитрата серебра. Затем пластинку
вносят в сушильный шкаф и выдерживают при температуре 60°С в течение
20 мин. После охлаждения пластинку обрабатывают раствором лимонной
кислоты. Тиофоса «стандарт» проявляются в виде красных пятен на желтом
фоне.

Реакция щелочного гидролиза. К сухому остатку прибавляют 4-5 мл


пероксида водорода и нагревают на водяной бане до обесцвечивания
жидкости. После охлаждения вносят в раствор 2 мл 20% раствора гидроксида
натрия и нагревают на водяной бане 20 мин. Появляется желтое
окрашивание.

28
Обнаружение метафоса

С целью обнаружения метафоса применяют реакцию с растворами о


-дианизидина и пербората натрия (NaBO 3 ·4H 2 O), а также метод
хроматографии в тонком слое силикагеля

Реакция с о -дианизидииом и перборатом натрия. В пробирку вносят


1 мл ацетонового раствора исследуемого вещества, прибавляют 0,5 мл 3%-го
свежеприготовленного ацетонового раствора о-дианизидина и 2 мл 1,25 %-го
свежеприготовленного раствора пербората натрия. В зависимости от
содержания метафоса через 5—30 мин раствор приобретает желтую или
красноватую окраску. Если смесь реагирующих веществ довести до рН=
10...11, то чувствительность реакции повышается в 3—4 раза.

Обнаружение метафоса методом хроматографии. На пластинку,


покрытую тонким слоем силикагеля КСК, закрепленным гипсом, наносят
каплю раствора исследуемого вещества и каплю раствора «свидетеля» (0,01
%-го раствора карбофоса в хлороформе). Пластинку подсушивают на
воздухе, а затем вносят в камеру для хроматографирования, насыщенную
парами смеси н -гексана и ацетона (2 : 1). После того как система
растворителей поднимется на пластинке на 10 см выше линии старта,
пластинку вынимают из камеры, подсушивают на воздухе и опрыскивают
раствором бромтимолового синего, содержащим нитрат серебра. После
подсушивания пластинки на воздухе ее вносят на 20 мин в термостат,
нагретый до 60 °С. После указанного времени пластинку охлаждают и для
обесцвечивания фона опрыскивают 10 %-м раствором уксусной кислоты.
При наличии метафоса и ряда других фосфорсодержащих органических
соединений на желтом фоне пластинки появляются лилового цвета пятна.

Обнаружение карбофоса

Реакция с диазотированной сульфаниловой кислотой. Несколько


миллилитров хлороформного раствора остатка выпаривают досуха. К сухому
остатку прибавляют 2 мл воды очищенной, 1 мл раствора диазотированной
сульфаниловой кислоты и 0,5 мл 5% раствора гидроксида натрия -
появляется вишнево-красное окрашивание.

Реакция с реактивом Марки. Несколько миллилитров хлороформной


вытяжки выпаривают досуха. К остатку добавляют 5-10 капель реактива
Марки - появляется оранжевая окраска, переходящая в желто-коричневую.

Реакция с сульфатом меди(П). К сухому остатку после испарения


экстракта из объекта прибавляют 1 мл 10% спиртового раствора гидроксида
натрия и нагревают на кипящей водяной бане 10 мин. После охлаждения рН

29
раствора доводят до 4-5 с помощью 25% серной кислоты, прибавляют 1 мл
хлороформа и 2 капли 10% раствора сульфата меди(П). При наличии
карбофоса слой хлороформа окрашивается в зеленовато-желтый цвет.

Микрокристаллоскопические реакции. Для проведения этих


реакций спиртовый раствор остатка, содержащего карбофос, помещают в
углубление на предметном стекле и к нему добавляют один из
нижеперечисленных реактивов, закрывают покровным стеклом и помещают
во влажную камеру. Карбофос с хлоридом ртути(П) образует желтоватые
кристаллы в форме зведочек; с йодидом висмута - темно-красные кристаллы
в форме игл; с хлористым йодом - бурые кристаллы, которые исчезают через
некоторое время.

Метод ТСХ. На хроматографическую пластинку со слоем силикагеля,


закрепленного гипсом, наносят несколько капель раствора остатка.
Параллельно наносят раствор «стандарта». Пластинку помещают в систему
растворителей н-гексан - ацетон (2:1). После хроматографирования
пластинку опрыскивают бромтимоловым синим и нитратом серебра. Затем
пластинку нагревают в термостате 20 мин при 60°С. После охлаждения
пластинку опрыскивают 10% раствором уксусной кислоты - появляются
пятна лилового цвета при наличии карбофоса.

Обнаружение хлорофоса

Реакция с пиридином (реакция Фудживара). В пробирку вносят 1 мл


исследуемого раствора, 1 мл пиридина и 1 мл 50% раствора гидроксида
натрия. Смесь нагревают на кипящей водяной бане - появляется красное или
розовое окрашивание. Предел обнаружения составляет 10 мкг хлорофоса в
пробе. Реакция неспецифична.

Реакция с о-толидином. В пробирку вносят водный раствор


исследуемого вещества, 1 мл о-толидина в ацетоне, 1 мл смеси пероксида
водорода и гидроксида натрия - постепенно развивается желтое или
оранжевое окрашивание. Такой же результат получается в присутствии
метафоса и тиофоса.

Реакция с 2,4-динитрофенилгидразином. В пробирку вносят 1-10


капель исследуемого раствора и 2 капли 1 М раствора гидроксида натрия.
Через 20 мин добавляют 1 каплю 0,1% раствора 2,4-динитрофенилгидразина
в 4 М растворе хлороводородной кислоты. Смесь нагревают на водяной бане
30 мин. После охлаждения прибавляют 1 каплю 4 М раствора гидроксида

30
натрия и 0,5 мл этилового спирта. Появляется синее или сине- фиолетовое
окрашивание.

Эта реакция положительна при наличии хлорофоса и его основного


метаболита - дихлоруксусного альдегида.

Реакция с ацетоном. В пробирку помещают 0,1-0,5 мл исследуемого


раствора в этиловом спирте и прибавляют 1 мл ацетона и 0,5 мл 0,5 М
спиртового раствора гидроксида натрия. Через 5-15 мин появляется розовая
окраска, переходящая в оранжевую.

Реакция образования изонитрила. В пробирку вносят раствор


исследуемого вещества в спирте, добавляют 2 мл 10% спиртового раствора
гидроксида натрия и 1 каплю анилина. При нагревании ощущается
характерный запах изонитрила. Реакция неспецифична.

Реакция с о-анизидином. Проводится так же, как и с тиофосом.


Появляется желтое или красноватое окрашивание.

Метод ТСХ. Анализ проводят в присутствии «стандарта» на пластинке


с тонким слоем силикагеля с использованием системы растворителей ацетон
- гексан (1:1). После хроматографирования пластинку высушивают,
обрабатывают смесью 2% раствора резорцина в 10% растворе карбоната
калия, затем пластинку выдерживают 10 мин в сушильном шкафу при 100°С.
Хлорофос проявляется в виде пятна оранжевого цвета.

Методы количественного определения фосфорорганических


пестицидов

31
Фотоколориметрический метод. Он основан на минерализации ФОС с
помощью серной и азотной кислот. Определенный объем извлечения из
объекта помещают в колбу Кьельдаля, добавляют 3 мл концентрированной
серной, 10 мл концентрированной азотной кислот. Смесь нагревают до
просветления жидкости и появления белых паров. Минерализат охлаждают и
доводят до определенного объема водой очищенной. К части раствора
прибавляют молибдат аммония и бензидин. Регистрируют величину оптиче-
ской плотности окрашенного раствора. Расчет содержания
фосфорорганического соединения ведут по калибровочному графику.

Порядок выполнения реакций приведен ниже.

Метод газожидкостной хроматографии. Анализ проводится по высоте


или площади пика. Используются термоионный, пламенно-фотометрический
или электронно- захватный детекторы.

32
Заключение

Хранение пестицидов длительное время в испорченной упаковке может стать


причиной их утечки и, как следствие, загрязнения почв, заражения подземных вод,
отравления флоры и фауны. Поскольку человек является конечным звеном многих
пищевых цепей, необходимо учитывать опасность, связанную с использованием
таких биологически активных веществ. Для преодоления проблемы необходимо не
только разрабатывать более совершенные средства для борьбы с
сельскохозяйственными вредителями, но и проводить мониторинг агроландшафтов,
обязательную сертификацию и учёт производимых, ввозимых и используемых
пестицидов. Только таким способом можно достигнуть равновесия между
производительностью и безопасность сельского хозяйства.

33
Список использованной литературы

1. Токсикологическая химия: метаболизм и анализ токсикантов: учебное


пособие / под ред. Н.И. Калетиной. – М., 2008. – 1016 с. Переплет.
2. Токсикологическая химия: учебник / под ред. Т.В. Плетеневой. – 2-ое
изд. – М., 2008. – 512 с. Переплет.
3. ТСХ-скрининг токсикологически значимых соединений, изолируемых
экстракцией и сорбцией: учебное пособие / Г.В. Раменская, Г.М.
Родионова, Н.И. Кузнецова и А.Е. Петухов ; ред. А.П. Арзамасцев . -
М. : ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 240 с.
4. Вергейчик Т.Х.В31 Токсикологическая химия : учебник /
Т.Х.Вергейчик ; под ред. проф. E.H.Вергейчика. - М.: МЕДпресс-
информ, 2009. - 400 с. : ил.
5. https://studfiles.net/preview/1152212/

34
35