Marciano Antônio Venâncio

Atividade de Biotcnologia
Profe. Dr. Bruno

1) O que e a técnica do DNA recombinante?

A técnica do DNA recombinante permite produzir moléculas de DNA a partir da

combinação de genes com proveniências diferentes. è possível produzir um
gene humano em bactérias, para que estas produzam, em larga escala, uma
proteína humana.
Esta técnica permite obter entre outros, OGM (organismos geneticamente
modificados), sendo muito utilizada na engenharia genética.

2)Em quais situações o técnica do DNA recombinante pode ser utilizada?

Estudo da estrutura dos genes;

Terapia gênica;
Melhoramento animal e vegetal;
Criação de modelos animais;
Obtenção de grandes quantidades de proteínas raras;

3)Suçintamente descreva a síntese da molécula de insulina humana e como foi

construído o seu gene sintético.

A insulina humana, como muitos hormônios protéicos, é sintetizada como uma

proteína precursora maior, seguida de uma clivagem proteolítica, para gerar o
hormônio ativo. Desse modo, a insulina é produzida sob a forma de um único
polipeptídeo, a pré-pró-insulina, como uma cadeia de 110 aminoácidos. Os
vinte e quatro primeiros aminoácidos formam o peptídeo sinal ou seqüência pré
da proteína e têm a função de facilitar a entrada da mesma no retículo
endoperiplasmático. Durante esse processo, o peptídeo sinal é separado
da proteína, resultando na formação da pró-insulina. Essa molécula resultante,
na qual as cadeias A (21aminoácidos) e B (30 aminoácidos) estão ligadas pelo
peptídeo conectante C (35 aminoácidos), é a precursora da insulina. Ela
adquire sua conformação com a formação de duas pontes dissulfídricas e é
transportada para o aparelho de Golgi, onde vai ser empacotada em grânulos
de estoque. Durante a formação e maturação dos grânulos secretórios, a pró-
insulina é clivada por enzimas proteolíticas do tipo da tripsina,
Resultando na liberação do peptídeo C. Desse modo, as duas cadeias A e B
estão ligadas entre si por pontes dissulfídricas, tendo uma outra ponte interna
na cadeiaA, formando a molécula de insulina.
Dentre as várias maneiras pelas qual um gene eucariótico pode ser obtido para
a expressão em procariotos, a síntese química oferece as seguintes vantagens:
fornece diretamente a seqüência exata desejada; as seqüências codificadoras
e não codificadoras podem ser desenhadas para a expressão procariótica;
sítios de restrição podem ser removidos ou adicionados, íntrons
retirados; não há necessidade da etapa de isolamento do mRNA ou DNA
genômico e permite a alteração do gene de forma mais simples.
4)Quais características são necessárias para a construção de um sistema de
expressão de proteínas em E. colli. Cite os elementos utilizados para
construção do vetor de expressão pLMT8-5C.

 uma região necessária para replicação estável e controle do número de

cópias;
 um marcador seletivo, como um gene conferindo resistência a antibiótico
para a hospedeira;
 um promotor para iniciação da transcri
ção e seu controle;
 uma região terminadora da transcrição um sítio de ligação de
ribossomas
para a iniciação da tradução em uma trinca ATG apropriada;
 e uma região de sítios apropriados para enzimas de restrição, para
utiliza-
ção nas clonagens dos genes a serem expressos.

5) Para a produção de pró-insulina o gene sintético é clonado no vetor de

expressão (plasmideo) e transfectado em uma E. coli. Num processo
denominado transformação que foi visto na biotecnologia. O que é a
transformação e comente sobre a produção da pró-insulina humana pela E. coli
transformada ( que contém o plasmidio recombinante).

Mecanismo evidenciado como causando recombinação em bactérias. A

iniciação da produção de pró-insulina por sequências de aminoácidos da
própria proteína e utilizando o códon genético da E. Coli para otimizar a
expressão do gene da bactéria não teve alteração do aminoácido de
correspondência por causa das modificações feitas nos códons.

6) a- Quais as vantagens do uso de S. cerevisiae ( fungo) para expresão de

genes heterólogos em comparação a expressão em E. coli.

Entre as razoes para o insucesso da E. coli, poderíamos citar: conformação

incorreta, ausência de modificações pós-traducionais e baixos níveis de
expressão. Alguns desses problemas puderam ser resolvidos quando as
mesmas proteínas foram expressas em S. cerevisiae. O ambiente intracelular
da levedura é adequado para o ocorrência de varias reações que normalmente
ocorrem em células de mamíferos. Além do mais, S. cervisiae goza de status
de microorganismo “GRAS” o que é de suma importância no que se refere à
produção de biofármacos por engenharia genética.

b- Por que algumas proteínas não podem ser expressas em E. coli?

Por conformação incorreta e ausência de modificações pós-traducionais, pois,

a E. Coli se trata de um ser procarioto e as proteínas humanas são
provenientes de seres eucariotos, como os fungos, por exemplo

c- Comente sobre o processo de glicosilação realizado pelas leveduras de S.

cerevisiae e a importância de P. pastoris (fungo) de leveduras nesse processo.
d- Qual a vantagem de outras leveduras (P. pastoris) como sistema alternativo
de expressão gênica heteroglifa que e comparado a S. cerevisiae.

A Pichia pastoris é capaz de crescer em meio de cultura contendo metanol

como única fonte de carbono. É o forte promotor usado para transcrever genes
heterólogos o qual é derivado do gene do álcool oxidase. Não é considerado
uma forte fermentadora.

e- Estes sistemas estão sendo utilizados para expressar diversas proteínas de

interesse biotcnológico. Dê exemplos.

Proteínas como α-amilase de Bacillus subtilis (sozinha ou fusionada a uma

glicoamilase de Aspergillus awamori); um fragmento de anticorpo (scFv) anti –
Z – DNA; celobiohidrolase L2 de Humicola grisea var thermoidea...

7) O que é terapia gênica e em quais condições clinicas, ela vem sendo

experimentada?

É o tratamento de doenças baseado na transferência de material genético, que

vem sendo experimentada no tratamento de doenças adquiridas, como AIDS,
neoplasias malignas e doenças cardiovasculares, mais do que para doenças
hereditárias

8) Discuta sobre os métodos químicos, físicos e biológicos de inserção de

genes em células (trasfecção).

Um espectro terapêutico muito mais amplo se apresenta à medida em que

novos sistemas são desenvolvidos para permitir a liberação de proteínas
terapêuticas, tais como hormônios, citocinas, anticorpos, antígenos ou novas
proteínas recombinantes. A terapia gênica é a esperança de tratamento para
um grande número de doenças até hoje consideradas incuráveis por métodos
convencionais, das hereditárias e degenerativas
às diversas formas de câncer e doenças infecciosas.

9) O que é um vetor “na Biologia Molecular” e descreva os principais tipos

utilizados na terapia gênica.

É o agente que constitui ou contém os genes a serem transferidos e expressos

em uma célula receptora. Os diversos tipos de vetores são utilizados com o
objetivo de:
- Levar o DNA terapêutico ao núcleo das células-alvo;
- Entregar o RNA diretamente ao citoplasma das células, mas o RNA é mais
instável que o DNA, o que limita a aplicação dessa modalidade de transferência
gênica.

10) a- Os anticorpos monoclonais são facilmente produzidos em camundongos,

porém eles podem ser tóxicos por induzir respostas alérgicas ao nosso
organismo. Comente esta toxicidade dos anticorpos introduzidos em
camundongos quando administrados em humanos.

b- Qual a solução para a síntese de anticorpos não tóxicos aos humanos?

c- Descreva a síntese de anticorpos recombinantes.