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Os produtos formados podem ter as mais variadas apresentações, podendo ser uma
aglutinação de partículas, turvação, formação de cor ou formação de um produto sem cor,
que pode ser identificado ou medido através de fotômetros ou contadores de radiação.
Portanto, o trabalho no Laboratório Clínico se baseia, quase na sua totalidade, no uso de
reagentes que produzem as reações desejadas, formando os produtos indicadores da reação.
Os reagentes podem ainda ser anticorpos específicos para antígenos que desejamos
pesquisar ou quantificar e que desenvolvem reações cujo produto pode ser uma turvação ou
uma precipitação em um meio sólido. Um dos exemplos correntes é a dosagem de
imunoglobulinas por imunodifusão radial.
As enzimas são também produtos químicos, mas devido a características próprias destes
reagentes, os sistemas analíticos utilizando enzimas são denominados enzimáticos. Os
usuários dos reagentes enzimáticos sentiram a necessidade de distinguir estes reagentes dos
reagentes químicos e criou-se então a denominação de reagentes colorimétricos para os
reagentes químicos e de reagentes enzimáticos para aqueles utilizando enzimas. Entretanto,
muitos reagentes enzimáticos formam produtos coloridos, sendo colorimétricos também.
Assim, para distinguir os dois tipos de reagentes, devemos denominar como enzimáticos os
reagentes que utilizam enzimas, e como reagentes químicos aqueles que não utilizam
enzimas. Os reagentes para dosagem do colesterol formam produtos coloridos, mas podem
utilizar reagentes químicos ou enzimáticos. Assim, os métodos para dosagem de colesterol
devem ser denominados como químico e enzimático e não como colorimétrico e
enzimático.
Os métodos quantitativos têm a denominação genérica de "ensaios".
A água é o suprimento de laboratório mais barato. Talvez, por este motivo, sua qualidade
seja tão negligenciada, apesar de ser um reagente importante e o mais largamente utilizado.
A água utilizada no laboratório deve ser PURA e este termo pode significar coisas
diferentes, dependendo da situação. Se falamos que a água de um rio é pura, estamos
afirmando que não é poluída e é adequada para natação, pescaria e esportes náuticos.
Pureza da água de uso doméstico significa que ela é livre de microrganismos patogênicos,
agentes tóxicos e própria para consumo humano. No Laboratório Clínico, a água é utilizada
como reagente químico. Neste caso a denominação água pura significa que ela é usada
como H2O e nada mais.
O efeito das impurezas da água nos diversos testes de laboratório tem sido estudado
sistematicamente e existem evidências de numerosas causas de erro. O cloro utilizado na
água servida à população, na concentração em torno de 1,0 mg/l, pode introduzir erros de
até 25% na dosagem de cloretos e interfere com vários procedimentos em bacteriologia e
enzimologia. Traços de metais aceleram ou inibem várias reações e introduzem erros,
muitas vezes consideráveis, nas dosagens de enzimas ou em procedimentos que utilizam
enzimas como reagentes. A dimensão do erro gerado pela impureza da água depende em
muito da concentração do analito. Um miligrama de sódio por litro de água pode introduzir
um aumento de 4,3 mEq/l na dosagem de sódio se a diluição utilizada for de 1:100,
representando um erro de 3,1%, em uma concentração de sódio de 140 mEq/l. Por outro
lado, 1,0 mg de potássio por litro de água introduz um aumento de 2,5 mEq/l. Em uma
amostra com potássio de 4,0 mEq/l, o erro é de 62%.
Fica então claro que a água a ser utilizada no laboratório deve ser purificada para que não
produza interferências nos testes ou ensaios. Vários são os processos de purificação que
estão disponíveis para utilização no laboratório e a tabela que se segue relaciona os vários
procedimentos de purificação da água e sua eficiência na remoção dos principais
interferentes.
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Principais contaminantes e eficiência da purificação
Uma combinação dos processos de purificação da água para uso no Laboratório Clínico,
que é eficiente e de baixo custo, consiste de:
A água deionizada pode ser utilizada com sucesso no Laboratório Clínco, supondo que os
cuidados de controle da qualidade sejam tomados e que a água seja testada todas as vezes
em que se obtiver um novo lote. A água de uso no laboratório foi classificada em quatro
graus de pureza, em função da concentração de contaminantes mais importantes. Os quatro
graus de pureza da água são mostrados na tabela abaixo.
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Especificações da água como reagente
Existe ainda uma especificação para a água que é usada em HPLC, cultura de células e
tecidos, análise de cromossomas e testes de HLA, que é denominada água tipo 'Especial'.
A medida da resistividade deve ser feita com um condutivímetro. Os silicatos podem ser
facilmente medidos, conforme será mostrado adiante quando for abordado o controle da
qualidade da água. O número de bactérias pode ser determinado utilizando uma cultura
quantitativa. Para obter uma água que somente contenha partículas menores que 0,22 mm,
deve-se filtrá-la em um filtro com poro de diâmetro igual a 0,22 mm.
A água de tipo I só existe nesta forma no momento de sua produção, pois a resistividade irá
diminuir porque metais ou matéria orgânica podem se desprender do recipiente de
armazenamento. Portanto, quando um reagente requerer este tipo de água, ele deve ser
preparado imediatamente após a produção da água. Deve-se minimizar o armazenamento
da água tipo IIa, para que se mantenha uma consistência de qualidade específica para a
aplicação da água.
Os sistemas de armazenamento da água de tipos IIb e III devem ser construídos com
materiais que não facilitem a contaminação química ou bacteriana.
Certos cuidados devem ser tomados após obter água destilada ou deionizada, pois não tem
sentido obter uma água de boa qualidade e contaminá-la durante o processo
armazenamento.
Não se deve armazenar a água tipo IIb ou III por mais de uma semana, e o recipiente de
armazenamento deve ser lavado, todas as vezes em que se adicionar novo lote de água. Não
utilizar tubos de borracha como saídas da água e deve-se constantemente lavar as vedações
da torneira.
De modo geral, como a água deionizada se encontra em um estado antinatural e tem a
tendência a retornar ao estado anterior à purificação, deve-se evitar armazená-la, qualquer
que seja a aplicação. Quando se usar água deionizada, é recomendável obter a quantidade
suficiente para um dia de trabalho, utilizando a porção que sobrar para recompor a água do
banho-maria.
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Tabela 3
Para a preparação dos diversos regentes é necessário selecionar o tipo de água mais
adequado, em função da qualidade requerida. A tabela acima mostra a aplicação dos tipos
de água na preparação dos reagentes utilizados no laboratório. Assim, se desejamos
preparar um reagente enzimático, devemos utilizar água Tipo IIa, no mínimo e os reagentes
para fluorescência quantitativa devem ser preparados com água tipo I, imediatamente após
sua produção.
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Entretanto, um modelo básico que tem aplicação geral no laboratório pode ser proposto.
Em primeiro lugar devemos nos preocupar com a prevenção, para impedir que reagentes e
proteínas fiquem aderidos a pipetas, ponteiras e tubos de ensaio.
A vidraria deve ser imersa, logo após o uso, em uma solução de detergente a 0,5 ou, no
máximo, a 1,0%. Soluções de detergentes muito concentradas dificultam sua remoção da
vidraria e os detergentes aderidos podem atuar como inibidores ou ativadores de outras
reações. A vidraria deverá ficar imersa na solução de detergente por um mínimo de 1 hora
ou tempo maior quando a contaminação for muito grande. As pipetas e tubos de ensaio
devem ser enxaguados exaustivamente com água de torneira e lavados pelo menos duas
vezes com água deionizada ou destilada. Secar em estufa a 80 °C.
As cubetas devem ser lavadas com água deionizada, imediatamente após as leituras. As
cubetas usadas para as dosagens de ferro e cálcio, capacidade de ligação de ferro e
magnésio devem ser lavadas com ácido clorídrico ou nítrico e enxaguadas com água de
torneira e água deionizada. Cubetas de fluxo devem ser lavadas com solução de hipoclorito
de sódio a 1%, ou hidróxido de sódio a 1%. Lavar em seguida com água deionizada.
Como a limpeza de ponteiras e multicubetas é uma tarefa difícil e trabalhosa, muitas vezes
não garantindo a limpeza química do material, deve-se avaliar a relação custo benefício
entre executar esta tarefa ou descartar estes materiais.
Reações
Reações de aglutinação
Ocorrem por precipitação de um analito, na maioria das vezes uma proteína, por ação de
um reagente, que pode ser químico ou um anticorpo. As turvações podem ser observadas
visualmente ou medidas por fotometria ou nefelometria e, nestes dois casos, a proteína
precipitada permanece na forma de suspensão. As precipitações podem ocorrer em meio
sólido ou líquido e quase sempre são analisadas visualmente.
Reações colorimétricas
São aquelas em que os produtos formados têm uma cor e as intensidades das cores são
medidas na faixa visível do espectro (380 - 680 nm).
Reações ultravioleta
São reações cujos produtos formados absorvem energia radiante ("luz") na porção do
ultravioleta próximo, mais especificamente em 365 ou 340 nm.
A figura 1 mostra graficamente uma reação de ponto final.A divisão em três etapas mostra
o início e incremento na formação do produto, a etapa de estabilidade, e o decaimento do
produto por perda da estabilidade.
Reações cinéticas
Figura 2: a-b: fase inicial da reação onde a velocidade não é constante; b-c: reação com
velocidade constante onde pode-se obter as diferenças de absorbância/minuto (D 1 - D 9),
usadas para calcular o resultado; c: redução da velocidade de reação por consumo do
substrato.
Cada modelo de reação tem seus méritos, que vamos discutir a seguir, mostrando os
benefícios de cada um dos modelos metodológicos.
As reações cinéticas são geralmente aplicadas nas dosagens de enzimas, mas podem ser
utilizadas para dosagem de analitos, habitualmente ensaiados por reações de ponto final. A
creatinina é comumente dosada com uma reação de ponto final, mas pode-se também
utilizar uma reação cinética de dois tempos. Neste caso, a reação de ponto final é aplicada
em metodologias manuais e a reação cinética é utilizada, principalmente, em metodologias
automatizadas. Outro analito medido por reações de ponto final e reações cinéticas é a
uréia.
As reações de cinética de dois tempos podem ser utilizadas para diminuir o tempo de
reação, reduzir a influência de interferentes (creatinina) ou estender a linearidade do
sistema analítico (uréia UV). Comumente, as reações cinéticas de 2 tempos utilizam a fase
inicial da reação com uma leitura aos 30 segundos, que servirá como branco, e outra leitura
aos 90 segundos. Utiliza-se então o DA correspondente a um minuto para calcular a
concentração do analito.
As reações cinéticas de dois tempos são reações cinéticas de tempo fixo, em que a primeira
leitura é usada como branco e o tempo de incubação é reduzido para se obter melhor
desempenho ou agilizar o procedimento.
CONCLUSÕES
As reações representam a base do trabalho no Laboratório Clínico e o conhecimento dos
vários modelos é relevante para uma atuação adequada e intervenção em muitas
dificuldades técnicas encontradas no dia a dia do trabalho.
Para finalizar, procuramos sintetizar nas duas figuras abaixo, as principais reações
utilizadas no Laboratório, classificando-as de acordo com o produto ou o modelo da reação.
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A forma inicial para abordar um problema técnico consiste em definir o erro que está
ocorrendo, o que pode facilitar a identificação do problema e permitir sua correção
adequada.
Este erro pode ser devido às seguintes causas: amostra inadequada, erros na medida da
amostra, temperaturas ou tempos incorretos de incubação, técnica mal conduzida, vidraria
contaminada, defeitos no fotômetro e água de má qualidade.
Quando ocorre um problema técnico, deve ser feito um esforço sistemático para encontrar a
causa e introduzir as medidas de correção.
Deve-se, em primeiro lugar, fazer uma revisão de todo o processo operacional, procurando
as causas mais óbvias como: pipetas utilizadas, principalmente a usada na medida da
amostra; avaliar se não houve omissão ou troca de reagentes; verificar o desempenho do
fotômetro e a correção dos cálculos dos resultados.
É evidente que um conhecimento adequado da metodologia, das causas de erro e a
experiência com a metodologia irão contribuir decisivamente para identificar as causas do
problema e encontrar um solução.
Deve ser criado um esquema de avaliação dos problemas, que, para conveniência, pode ser
dividido em 3 sub-unidades: pré analítica, intra-analítica e pós-analítica.
Cada método deve ter seu esquema próprio, pois eles diferem em etapas e procedimentos.
Relacionaremos a seguir um roteiro básico contemplando as três sub-unidades analíticas. É
evidente que etapas na sub-unidade intra-analítica deverão ser suprimidas ou inseridas.
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Etapa pré-analítica
Preparo do paciente
Obtenção da amostra
Processamento da amostra
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Etapa intra-analítica
1. reagente foi corretamente preparado a partir da solução estoque (quando for o caso)?
2. reagente está dentro de sua validade e foi armazenado corretamente?
3. Ocorrem modificações visuais no reagente (turvação, precipitação, modificação da
cor)?
4. Foi pipetado o volume recomendado?
5. A mistura reagente/amostra foi correta?
Passo 4 - Incubação
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Etapa pós-analítica
Cálculos
Resultados ou relatórios