БИОХИМИЯ, 2011, том 76, вып. 5, с.

613 – 635

УДК 577.352.5

ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ КОРРЕЛЯЦИОННАЯ
СПЕКТРОСКОПИЯ В БИОЛОГИИ,
ХИМИИ И МЕДИЦИНЕ
Обзор
© 2011 г. И.В. Перевощикова1,2, Е.А. Котова1, Ю.Н. Антоненко1*
1
НИИ физикохимической биологии им. А.Н. Белозерского
МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва; факс: (495)9393181,
электронная почта: antonen@genebee.msu.ru
2
Department of Biomedical Sciences, University of Veterinary Medicine,
Vienna, Austria
Поступила в редакцию 15.10.10
После доработки 24.11.10

Описаны метод флуоресцентной корреляционной спектроскопии (ФКС) и его приложения. ФКС исполь!
зуется для исследования процессов, связанных с изменением подвижности молекул и комплексов, и позво!
ляет изучать такие процессы, как агрегация частиц, связывание флуоресцирующих молекул с надмолеку!
лярными комплексами, липидными везикулами и так далее, причем диапазон размеров изучаемых объек!
тов очень широк – от молекул красителей до наночастиц, размер которых достигает сотен нанометров. Рас!
смотренные приложения ФКС охватывают разные области изучения – от простых химических систем
(раствор–мицелла) до тонких процессов регуляции на уровне живых клеток. Показана простота и доступ!
ность как методических основ, так и теоретической базы ФКС. Наиболее полно отражены приложения,
связанные с искусственными и природными мембранами. В отличие от родственного метода динамическо!
го светорассеяния метод ФКС в настоящее время мало известен в России, несмотря на то что он активно
используется зарубежом. Цель работы – дать толчок развитию ФКС в России и помочь этому методу занять
более заметное место в современной российской науке.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: флуктуации флуоресценции, корреляционная спектроскопия, диффузия, агрегация,
связывание, наночастицы, биополимеры, везикулы, лиганды, рецепторы, конформационные изменения,
сворачивание белков и нуклеиновых кислот.

Современную науку характеризирует посте! отдельных частиц, возникающих в результате

пенный переход от изучения объектов на макро!
уровне (вещества в целом) к изучению свойств
нанообъектов и даже одиночных молекул. Этот
общий тезис особенно применим к современ!
ной биохимии и биофизике, где в последнее
время используются такие методы изучения
биомолекул, как атомно!силовая микроскопия,
флуоресцентная микроскопия отдельных моле!
кул, измерение активности одиночных каналов
и некоторые другие. Метод флуоресцентной
корреляционной спектроскопии (ФКС) осно!
ван на регистрации флуктуаций флуоресценции
П р и н я т ы е с о к р а щ е н и я : ФКС (FCS) – флуоресцент!
ная корреляционная спектроскопия (fluorescence correla!
tion spectroscopy), ДНФ – 2,4!динитрофенол, TMRE – тет!
раметилродаминэтиловый эфир, τd – время диффузии,
PCH – photon counting histrogram, G(τ) – автокорреляци!
онная функция.
* Адресат для корреспонденции.
броуновского движения в освещенном лазером
малом объеме пространства (конфокальном
объеме). Современные объективы позволяют
сфокусировать лазерный луч в пятно размером,
составляющим доли микрона, и регистрировать
сигнал от объема ~10–15 л. Временнáя зависи!
мость интенсивности свечения F(t) флуоресци!
рующих молекул в растворе или частиц некой
дисперсной фазы характеризуется появлением
скачков (или пиков) сигнала на фоне практи!
чески постоянного (низкоамплитудного) сигна!
ла базового уровня. Каждый скачок соответ!
ствует прохождению отдельной частицы через
конфокальный объем. Важно отметить, что
амплитуда флуктуаций флуоресценции опреде!
ляется числом молекул флуорофора, связанных
с одной частицей, и не зависит от размера час!
тицы. Стандартная обработка временнóй зави!
симости флуктуаций флуоресценции в виде ав!
токорреляционной функции (G(τ)) позволяет

613
614 ПЕРЕВОЩИКОВА и др.
получить информацию о двух важных парамет!
рах: времени диффузии частиц (τd), которое
прямо пропорционально их размеру, и числе
частиц в конфокальном объеме (N). Традицион!
но ФКС используется для исследования процес!
сов, связанных с изменением подвижности мо!
лекул и комплексов, а именно: агрегации час!
тиц, взаимодействия флуоресцирующих моле!
кул с надмолекулярными комплексами, липид!
ными везикулами и так далее, причем диапазон
размеров изучаемых объектов очень широк – от
молекул красителей до наночастиц размером,
составляющим сотни нанометров.
Метод ФКС активно применяется в зару!
бежных лабораториях, но по не очень ясным
причинам мало известен в настоящее время в
России, несмотря на то что во второй половине
1970!х гг. на территории СССР в Институте хи!
мической и биологической физики АН ЭССР в
Таллине была создана установка ФКС мирового
уровня [1, 2], с помощью которой в дальнейшем
были получены принципиально новые результа!
ты [3–7]. На фоне обширной иностранной лите!
ратуры по ФКС, включающей в себя наряду с
экспериментальными и теоретическими статья!
ми большое число обзоров [8–21], имеется лишь
считанное число современных публикаций на
русском языке [22–27], причем одна из этих ра!
бот полностью выполнена в английской лабора!
тории [24]. Метод ФКС по своей сути очень
близок к методу фотонной корреляционной
спектроскопии (его еще называют методом ди!
намического светорассеяния), который очень
широко используется в России для измерения
размеров наночастиц в суспензии.
Цель настоящего обзора – восполнить не!
достаток информации о методе ФКС в России.
Авторы, собравшие у себя в лаборатории прибор
ФКС, на собственном опыте убедились в эффек!
тивности и плодотворности данного подхода.
ИСТОРИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ
РАЗВИТИЯ МЕТОДА
ФКС – Экспериментальный метод, осно!
ванный на статистической обработке флуктуа!
ций флуоресценции в условиях регистрации ма!
лого числа молекул красителя. В противополож!
ность другим методикам, регистрирующим
флуоресцентный сигнал, в методе ФКС наибо!
лее информативен не сам сигнал интенсивности
флуоресценции, а его отклонение от среднего
значения, т.е. флуктуации флуоресценции. По!
следующее автокоррелирование временнóго сиг!
нала интенсивности флуоресценции позволяет
получить информацию о коэффициенте диффу!
зии и концентрации частиц. Именно этим мате!
матическим преобразованием и обусловлено
название метода. Первоначально он был разра!
ботан для изучения кинетики химических реак!
ций. В 1972 г. Магде с соавт. [28] показали при!
годность нового метода для исследования хими!
ческой реакции связывания бромида этидия
(EtBr) с двунитевой молекулой ДНК:
.
EtBr – Это маленькая флуоресцирующая мо!
лекула, которая может встраиваться между ос!
нованиями ДНК, что сопровождается увеличе!
нием ее квантового выхода флуоресценции в 20
раз.
Первоначально установка включала в себя
аргоновый лазер с длиной волны 514,5 нм. Флуо!
ресценция собиралась параболическим зерка!
лом, проходила через раствор К2Cr2O7 для отде!
ления от возбуждающего света, после чего соби!
ралась на фотоэлектронный умножитель. Ана!
логовый сигнал флуоресценции затем анализи!
ровался 100!канальным коррелятором. Типич!
ные концентрации препаратов составляли 5 мкМ
EtBr и 5 нМ ДНК массой 20 кДа из тимуса те!
ленка.
Размеры области наблюдения составляли
5 мкм в поперечном и 150 мкм в продольном
направлениях. Таким образом, в поле зрения на!
ходилось 104 молекул. Обработка сигнала флук!
туаций флуоресценции коррелятором давала ав!
токорреляционную функцию с временами диф!
фузии 10–100 мс. В описанной системе флук!
туации флуоресценции возникали в результате
двух процессов: свободной диффузии флуорес!
цирующих молекул в объеме наблюдения и вза!
имодействия флуоресцирующих молекул с
ДНК, приводящего к разгоранию флуоресцен!
ции. Анализ автокорреляционных функций, по!
лученных для различных концентраций EtBr,
позволил оценить константы связывания и рас!
пада комплексов, которые составили 1,5 · 107
М–1 · с–1 и 27 с–1 соответственно [28].
Последующие теоретические и эксперимен!
тальные разработки метода [29–31] обеспечивали
использование ФКС для определения констант
химических реакций, концентрации частиц, аг!
регации молекул, вращательного и поступатель!
ного движения в двух! и трехмерном простран!
ствах [5, 6, 29–36]. Значительным успехом стало
применение метода для изучения диффузии ли!
пидов в мембранах [35, 37, 38]. Был определен
коэффициент диффузии D = 9,9 · 10–8 см2/с флуо!
ресцентной молекулы йодида 3,3'!диоктадеци!
линдокарбоцианина (DiI) в искусственной би!
БИОХИМИЯ том 76 вып. 5 2011
 ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ КОРРЕЛЯЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ 615

слойной липидной мембране, сформированной ющего света, с одной стороны, осуществляется

из яичного лецитина и холестерина в соотноше! двухфотонное возбуждение молекул, а с другой
нии 2 : 1 (молярное соотношение). Однако пер! стороны, может происходить их необратимое
вые приборы имели плохое соотношение сиг! выцветание. Эти свойства двухфотонного воз!
нал–шум главным образом из!за низкой буждения дают большие преимущества для из!
чувствительности детектора, нахождения боль! мерений внутри клеток [41, 42]. В противопо!
шого числа частиц в освещенном лазером объе! ложность этому при однофотонном возбужде!
ме и недостаточного подавления фонового сиг! нии значительное количество флуоресцирую!
нала. щих молекул, находящихся кверху и книзу от
Огромным шагом вперед стали работы Риг! конфокального объема, подвержены выгора!
лера и коллег [39], в которых техника регистра! нию. В случае двухфотонного лазерного возбуж!
ции одиночных молекул была совмещена с кон! дения не требуется конфокальной диафрагмы и
фокальным принципом. Это позволило изучать весь поток фотонов флуоресценции образца
процессы не только в водном растворе, но и в сразу попадает на фотоэлектронный умножи!
интактных клетках [9, 39, 40]. тель, затем на усилитель и далее на плату корре!
Современный прибор ФКС (рис. 1) в случае ляции. К сожалению, большая стоимость лазе!
однофотонного лазерного источника возбужда! ров, используемых для двухфотонного возбуж!
ющего света устроен таким образом, что лазер! дения, существенно сдерживает их практичес!
ный луч проходит через систему линз и расши! кое применение.
ряется в диаметре до 6–8 мм. После этого воз! В 1974 г. Коппель [43] впервые провел ста!
буждающий свет направляется в объектив мик! тистический анализ стандартных отклонений
роскопа через дихроическое (селективное) зер! для экспериментальных автокорреляционных
кало и фокусируется в образце. Обычно исполь! кривых. Рассмотрение влияния различных фак!
зуется водно!иммерсионный объектив с число! торов (свойства детектора, размер и форма кон!
вой апертурой (NA) NA > 0,9. Флуоресценция фокального объема, концентрация частиц в
образца собирается этим же объективом и про! конфокальном объеме, интенсивность лазерно!
ходит через дихроическое зеркало, которое от! го излучения и многие другие) на регистрируе!
деляет его от возбуждающего света. Дополни! мый сигнал привело к дальнейшему развитию
тельно для выделения длины волны флуорес! теоретического анализа [40, 44, 45]. Разработа!
ценции используются эмиссионные фильтры. ны различные приложения метода ФКС для
Конфокальная диафрагма (пинхол (pinhole)) на анализа частиц с одинаковыми или близкими
плоскости изображения ограничивает прохож! коэффициентами диффузии [46–49]. Все это
дение флуоресцентного сигнала так, что собира!
ется свет только от конфокального объема. На
представленной схеме в качестве диафрагмы ис!
пользуется торец световода. Затем фотоны
флуоресценции попадают на детектор, предпочти!
тельно лавинный фотодиод или фотоумножи!
тель, работающий в режиме регистрации оди!
ночных фотонов. Далее сигнал преобразуется
специальной компьютерной платой с функцией
коррелятора. С помощью подбора диаметра
конфокальной диафрагмы удалось уменьшить
размеры конфокальной области регистрации до
0,32 мкм в поперечном и 1,53 мкм в продольном
направлениях [39].
В некоторых современных приборах ФКС
используется двухфотонное возбуждение, кото!
рое обеспечивает возможность возбуждения на
удвоенной длине волны по сравнению с обыч!
ным спектром возбуждения флуоресценции
красителя (рис. 2). Вероятность поглощения
двух фотонов одной молекулой пропорциональ!
на квадрату интенсивности излучения. Это при!
водит к выделению очень маленького объема
пространства вблизи фокальной плоскости, где Рис. 1. Принцип работы прибора для флуоресцентной кор!
в силу максимальной интенсивности возбужда! реляционной спектроскопии

БИОХИМИЯ том 76 вып. 5 2011

616 ПЕРЕВОЩИКОВА и др.
а б
S S
h v/2
hv hv F
h vF
h v/2
S S
Рис. 2. Освещенная область, полученная с использованием
однофотонного (а) и двухфотонного (б) лазерного возбуж!
дения
расширило области применения метода для изу!
чения различных биологических объектов.
Сегодня ФКС совместно с другими метода!
ми конфокальной флуоресцентной микроско!
пии представляет собой стандартный подход,
сочетающий в себе простоту исполнения и вы!
сокое временнóе и пространственное разреше!
ние, позволяющее регистрировать сигналы на
уровне отдельных молекул.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ
И ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДА
Конфокальный объем и способы его определе;
ния. Важным элементом современной реализа!
ции метода ФКС является использование кон!
фокального принципа, который нашел широкое
применение в современной микроскопии. Тер!
мин «конфокальный» означает «софокусный» –
в плоскости, оптически сопряженной с фокаль!
ной плоскостью объектива, помещается конфо!
кальная диафрагма (пинхол). Графически этот
принцип показан на рис. 3.
Область пространства, которая дает детекти!
руемый сигнал от флуоресцентного маркера
(молекулы) в рамках вышеприведенной опти!
ческой системы, принято называть конфокаль!
ным объемом, составлющим ~1 фл (10–15 л). Такое
определение конфокального объема, однако, не
дает строгого определения его границ, посколь!
ку выделение из шума сигнала флуоресценции
может иметь разную степень эффективности.
Его размер и форма определяются как характе!
ристиками сфокусированного возбуждающего
света, так и системой конфокальной регистра!
ции флуоресценции. Более того, параметры
конфокального объема зависят от свойств об!
разца (показателя преломления среды, фотофи!
зических свойств флуорофора), а также от тол!
щины покровного стекла и других эксперимен!
тальных условий [50]. Обычно конфокальный
объем представляют в виде эллипсоида, с коор!
динатами r0 в поперечном и z0 продольном на!
правлениях (рис. 4).
Все вышеперечисленные параметры влияют
на пространственную функцию распределения
вероятности обнаружения пробной частицы,
которая и определяет границы конфокального
объема. Эта функция часто задается в виде гаус!
совского распределения вероятности, и в этом
случае за конфокальный объем можно прини!
мать эллипсоид, ограниченный параметрами
размера, которые входят в распределение Гаусса
(т.е. z0 и r0). Кроме того, используют понятие
объема наблюдения, или эффективного объема,
который определяется как область простран!
ства, где вероятность обнаружения маркерной
молекулы превышает 1/e2 от максимального
уровня. В случае гауссовского распределения
размер конфокального объема больше размера
эффективного объема в 23/2 раза [51]:
. (1)
Можно выделить следующие основные ме!
тоды определения размеров конфокального
объема [51]: измерение серии автокорреляцион!
ных функций диффузии флуоресцирующих мо!
лекул в растворе с известной концентрацией;
измерение автокорреляционной функции диф!
фузии флуоресцирующих молекул с известным
коэффициентом диффузии; измерение сигнала
интенсивности флуоресценции флуоресцирую!
щих сфер (размеры сферы меньше размеров
конфокального объема), фиксированных на
покровном стекле.
Согласно первому подходу регистрируются
автокорреляционные функции диффузии моле!
кул флуоресцентного красителя с известной
концентрацией в серии разведений. Тогда эф!
фективный объем вычисляется по формуле
, (2)
БИОХИМИЯ том 76 вып. 5 2011
 ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ КОРРЕЛЯЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ 617

а б в

ФЭУ ФЭУ ФЭУ

КД КД КД

Л Л Л

СЗ СЗ СЗ

Лазер(ы) Лазер(ы) Лазер(ы)

Расширитель пучка Расширитель пучка Расширитель пучка

Объектив Объектив Объектив

Т+ Т+ Т0 Т+
Т0 Объект Объект Т0 Объект
Т– Т– Т–

Рис. 3. Принцип конфокальной фильтрации сигнала. Луч лазера (непрерывная линия) с помощью селективного зеркала
(СЗ) направляется в объектив микроскопа и фокусируется в точку Т0 в глубине исследуемого объекта. Флуоресценция, из!
лучаемая из этой точки (штриховая линия), собирается объективом и фокусируется линзой Л в сопряженной фокальной
плоскости объектива, проходя через отверстие в конфокальной диафрагме (КД) к фотоэлектронному умножителю (ФЭУ)
(а). Флуоресценция, излучаемая из точек Т+ (б) и Т– (в), дефокусирована на КД и к ФЭУ не проникает. Тем самым обес!
печивается подавление флуоресценции, испускаемой из точек образца, расположенных выше и ниже фокуса объектива

где N – число флуоресцирующих молекул в кон! ления зависит от точности определения коэф!
фокальном объеме, с – молярная концентрация фициента диффузии в воде общепринятого
вещества, NА – число Авогадро. флуоресцентного маркера родамина 6G, значения
Преимуществом данного подхода является которого в литературе различаются от 250 до
то, что он не зависит от оптических характерис! 426 мкм2/с при 22° [39, 52–54].
тик прибора и, следовательно, не требует допу!
щений о функции распределения света в конфо!
кальном объеме. Однако этот метод трудоемок и
требователен к фотофизическим свойствам об!
разцов. Традиционно используемые красители,
такие как родамин 6G и сульфородамин В, не
могут быть использованы для калибровки при!
бора таким методом в связи с их быстрой и зна!
чительной адсорбцией на поверхность стекла.
Второй метод основан на предположении,
Z0
что распределение вероятности регистрации
частицы в конфокальном объеме можно ап!
проксимировать функцией Гаусса в трехмерном
пространстве. Тогда аппроксимация экспери! r0
ментальной автокорреляционной кривой (см.
ниже) позволит определить время диффузии
флуоресцирующих молекул τd. Зная коэффици!
ент диффузии вещества, размер эффективного
объема можно вычислить по формуле

Vэф = π3/2k(4Dτd)3/2, (3)

где k = z0/r0.

Основным достоинством этого метода явля! Рис. 4. Форма и параметры конфокального объема (темная
ется быстрота калибровки. Но точность опреде! область)

БИОХИМИЯ том 76 вып. 5 2011

618
Независимо от методологии ФКС конфо!
кальный объем может быть определен с по!
мощью сканирования сигнала интенсивности
флуоресценции по фиксированным на покров!
ном стекле флуоресцирующим сферам с разме!
рами, меньшими геометрических параметров
конфокального объема. На рис. 5 показаны та!
кие измерения для флуоресцирующих сфер диа!
метром 100 нм в трех направлениях (у–х, z–x и
z–y) [51].
Автокорреляционная функция. Как следует из
названия, оценка корреляции основана на на!
хождении коррелирующих (похожих, связан!
ных) величин при их измерении в некотором
временнóм интервале T. Это достигается путем
сравнения интенсивности сигнала в моменты
времени t и (t + τ) на протяжении всего времени
регистрации сигнала (рис. 6). Строгое определе!
ние автокорреляционной функции G(τ) задается
уравнением
, (4)
где F(t) – функция интенсивности флуоресцен!
ции от времени t.
В литературе часто используется нормиро!
ванная автокорреляционная функция, которая
получается путем деления уравнения (4) на мно!
житель <F(t)2>:
4 4
5 5
z, мкм
3
y, мкм
2 6
1 7
1 2 3 4
х, мкм
Рис. 5. Измерение размеров конфокального объема путем сканирования интенсивности флуоресценции неподвижных
сфер. Серые контуры соответствуют 90, 50 и 13,5% максимальной интенсивности флуоресценции. На краях рисунка по!
казаны экспериментально полученные границы конфокального объема в соответствующих плоскостях (модифицирован!
ный рисунок из работы [51])
ПЕРЕВОЩИКОВА и др.
. (5)
Нормированная автокорреляционная функ!
ция принимает значения от нуля до единицы.
Получены аналитические выражения для
функции G(τ) в случае свободного движения
частицы в трехмерном пространстве [29], дви!
жения частицы в потоке жидкости [31, 55], про!
текания химической реакции, приводящей к из!
менению светимости частицы [11, 29]. Для слу!
чая трехмерной диффузии справедливо следую!
щее выражение:
, (6)
где τd – время диффузии, т.е. время, в течение
которого частица находится внутри конфокаль!
ного объема до своего выхода вследствие сво!
бодной диффузии; N – среднее число частиц в
конфокальном объеме; r0, z0 – геометрические
параметры конфокального объема.
Число флуорофоров в конфокальном объеме
обратно пропорционально значению автокор!
реляционной функции в пределе малых времен,
т.е. при τ → 0 [29]:
. (7)
4
z, мкм
6
7
3 4 5 6 4 5 6 7
у, мкм
БИОХИМИЯ том 76 вып. 5 2011
 ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ КОРРЕЛЯЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ 619

32 000 а Это простое соотношение верно не только

для случая гауссовского распределения вероят!
Флуоресценция, фотон/с

ности обнаружения частицы, но также и в об!

30 000
щем случае для более сложных распределений.
Из уравнения (7) следует, что флуктуации ин!
тенсивности флуоресценции затухают при уве!
личении числа частиц в конфокальном объеме.
28 000 Гистограмма распределения интенсивностей
флуоресценции. Временнáя зависимость флуо!
ресценции может быть проанализирована не
26 000 только с помощью вычисления автокорреляци!
онной функции, но и с помощью гистограммы
0 20 40 60
распределения интенсивностей флуоресценции
(photon counting histogram (РСН)). По определе!
Время, с нию это распределение соответствует зависи!
τ мости частоты встречаемости сигнала данной
б величины (P(F)) от значения самой величины,
т.е. F. Гистограмма показывает вероятность на!
F (t) хождения молекул с определенной интенсив!
Флуоресценция

ностью флуоресценции в конфокальном объеме

относительно всего числа зарегистрированных
событий. Таким образом, в отличие от автокор!
реляционного преобразования, РСН анализи!
рует распределение интенсивностей флуорес!
– ценции частиц, оказавшихся в конфокальном
F F (t + τ)
объеме за время наблюдения, а не их подвиж!
ность.
Основные закономерности PCH могут быть
Время поняты в упрощенной системе, когда конфо!
кальный объем представляет собой область
пространства с однородной вероятностью обна!
в ружения частицы. В случае частиц одинаковой
0,06 яркости вероятность попадания N частиц в кон!
фокальный объем описывается распределением
Автокорреляция G(τ)

Пуассона:
0,04

0,02
0,00
10–5
Рис. 6. Принцип автокорреляционной обработки сигнала
флуктуаций флуоресценции. а – Типичная зависимость
интенсивности флуоресценции родамина 6G (R6G) от вре!
мени при возбуждении 532 нм. б – Показана часть данных
из панели а в другом временнóм масштабе. Нижняя запись
–
сдвинута относительно верхней на время τ. F – средний
уровень сигнала. Для нахождения значения автокорреля!
ционной функции при данном значении τ необходимо
суммировать произведения величин сигналов, показанных
на этих двух строчках. в – Результирующая автокорреляци!
онная функция флуктуаций флуоресценции R6G (точки) и
ее аппроксимация по уравнению (6) (кривая)
, (8)
где λ – среднее число частиц за время наблюде!
ния. В силу принятого выше условия однород!
ной вероятности обнаружения частицы внутри
10–3 10–1 101 выделенного объема PCH должна также соответ!
τ, с ствовать в данном случае распределению Пуас!
сона. Однако неравномерное распределение ве!
роятности обнаружения частицы, а также слу!
чайная траектория движения частицы в конфо!
кальном объеме вносят искажения в гистограм!
му распределения интенсивности, что приводит
к заметным отклонениям от распределения Пу!
ассона.
В случае двухфотонного возбуждения, когда
распределение вероятности обнаружения части!
цы хорошо описывается функцией Гаусса, выве!
дены математические алгоритмы нахождения
функции для аппроксимации эксперименталь!

БИОХИМИЯ том 76 вып. 5 2011

620 ПЕРЕВОЩИКОВА и др.
но полученных гистограмм и проведена провер!
ка данного подхода на некоторых эксперимен!
тальных примерах [48, 56–58]. Показано, что
данный подход позволяет оценивать яркость
частиц даже в системе, где присутствует смесь
частиц с близкими коэффициентами диффузии,
но различной яркостью [47, 49, 59]. Как уже от!
мечалось выше, установки, имеющие двухфо!
тонное возбуждение, являются все еще большой
редкостью. В силу этого мы не стали подробно
обсуждать публикации, касающиеся анализа
PCH при двухфотонном возбуждении.
Проанализируем лишь одну из ключевых ра!
бот, которая поможет получить представление о
возможностях данной разновидности ФКС.
Этот подход был применен для определения
стехиометрии связывания флуоресцентно!ме!
ченного лиганда ретиноидного Х!рецептора,
локализованного в ядерной мембране клеток
[60]. Серия контрольных измерений была про!
ведена in vitro и in vivo в целях вычисления зави!
симости яркости одной молекулы флуоресцент!
ного маркера GFP от концентрации препарата.
Показано, что в широком диапазоне концентра!
ций светимость одной молекулы флуорофора
остается постоянной как в растворе, так и в
ядерной мембране и составляет ~4000 фотонов в
1 с на одну молекулу. В случае гетерогенной сис!
темы (мономер–димер) регистрируемое значе!
ние яркости частицы (εapp) будет промежуточ!
ным между значениями яркости мономерной
(ε1) и димерной (ε2) форм и вклад каждого сорта
комплексов в общую яркость будет зависеть от
числа частиц соответственно мономерной (N1) и
димерной (N2) форм:
. (9)
Клетки линии COS были трансфицированы
с последующей экспрессией в них GFP!мечен!
ного лиганда для ретиноидного Х!рецептора
ядерной мембраны. Увеличение концентрации
лиганда приводило к увеличению яркости
комплекса лиганд–рецептор, что свидетель!
ствовало об олигомеризации рецептора. Однако
значение яркости комплекса оказалось проме!
жуточным между соответствующими значения!
ми для мономерной и двумерной форм GFP, что
авторы объясняли низкой концентрацией, не до!
статочной для полной димеризации рецептора.
Добавка к клеткам активатора рецептора 9!цис!
ретиноевой кислоты вызывала быструю диме!
ризацию, что хорошо согласуется с данными,
полученными для этого рецептора in vitro [61].
ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ
ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ КОРРЕЛЯЦИОННОЙ
СПЕКТРОСКОПИИ
Изучение взаимодействия и агрегации биоло;
гически активных молекул. Определение под!
вижности (коэффициента диффузии) флуорес!
цирующих частиц, представляющих собой флуо!
ресцентно!меченные биополимеры, является
наиболее распространенным приложением ме!
тода ФКС в биологии. Поскольку время диффу!
зии τd обратно пропорционально коэффициенту
диффузии,
, (10)
и, следовательно, прямо пропорционально раз!
меру частицы,
(11)
(k – постоянная Больцмана, T – температура, η –
вязкость раствора, R – радиус частицы), этот па!
раметр будет изменяться при агрегации изучае!
мых молекул или при образовании комплексов с
другими полимерами. Измерение τd было ис!
пользовано для исследования белок!белковых,
белок!липидных, лиганд!рецепторных взаимо!
действий, а также агрегации биомолекул под
влиянием различных факторов. Исследование
таких взаимодействий включает в себя анализ
автокорреляционных функций флуктуаций
флуоресценции свободного флуоресцирующего
лиганда (как правило, небольшого размера) и
комплекса этого лиганда с биомолекулами (рис. 7).
Для исследования агрегации амфипатичес!
ких биополимеров, способных образовывать
мицеллы в водном растворе, в качестве флуорес!
цирующих маркеров используются накаплива!
ющиеся в мицеллах липофильные красители,
например октадецилродамин Б (R18). Анализ
автокорреляционных функций позволил опре!
делить число агрегации (N) липополисахарида
(LPS: E. coli 0111:B4) в водном растворе [62]:
, (12)
где cmc – критическая концентрация мицелло!
образования, [LPS] – общая концентрация ли!
пополисахарида, [Mic] – концентрация мицелл.
На основе измерений амплитуды автокорре!
ляционной функции R18 рассчитывали число
БИОХИМИЯ том 76 вып. 5 2011
 ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ КОРРЕЛЯЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ
1,2
0,8
Автокорреляция G(τ)
0,4
0,0
10–7
Рис. 7. Взаимодействие флуоресцентно!меченного лиганда с нефлуоресцирующим партнером, приводящее к сдвигу авто!
корреляционной функции в сторону больших времен диффузии τd вследствие образования комплексов и уменьшения ко!
эффициента диффузии связанного лиганда
мицелл в конфокальном объеме Np,lim, и далее
вычисляли концентрацию мицелл в растворе по
формуле
, (13)
где Vf – конфокальный объем. Эксперименталь!
но определенное значение N = 168 ± 4 оказалось
постоянным в широком диапазоне концентра!
ций липополисахарида (0,7–150 мкМ).
Более прямым способом регистрации агре!
гации биополимеров является измерение увели!
чения времени диффузии τd в условиях, когда
флуоресцентная метка ковалентно связана с
данным полимером. Таким способом изучали
агрегацию белка β!амилоида в растворе [63–65]
и агрегацию белка α!синуклеина in vitro [66]. Аг!
регация α!синуклеина играет ключевую роль в
болезни Паркинсона, причем мутантные белки,
обнаруживаемые у больных, обладают большей
склонностью к агрегации, чем дикий тип [67].
Авторы показали, что под действием белков се!
мейства иммунофилинов агрегация α!синукле!
ина, меченного красителем Bodipy, существенно
ускоряется, что приводит к увеличению време!
ни диффузии (τd) меченого α!синуклеина. Из!
меренный коэффициент диффузии мономер!
БИОХИМИЯ том 76 вып. 5 2011
621
τ2
τ1
10–5 10–3 10–1
τ, с
ной формы составил (5,8 ± 0,65) · 10–11 м2/с, что
из расчета глобулярной структуры белка соответ!
ствует радиусу 4,3 ± 0,5 нм. После завершения
процесса агрегации время диффузии было на
2–3 порядка больше, чем в начале эксперимен!
та. Определение размеров таких комплексов из
данных автокорреляционной функции затруд!
нено, так как флуктуации флуоресценции боль!
шой амплитуды вносят существенный вклад в
форму автокорреляционной функции. Авторы
отмечают, что метод ФКС имеет большую
чувствительность, поэтому для измерений с ис!
пользованием этого метода требуются гораздо
более низкие концентрации белков, чем для
аналогичных измерений методом светорассея!
ния.
Метод анализа автокорреляционных функ!
ций и измерения коэффициентов диффузии
совместно с методом измерения анизотропии
флуоресценции применили также для изучения
взаимодействия с молекулами ДНК таких бел!
ков, как активатор транскрипции NtrС [68] и
7!аминоактиномицин Д [23]. К достоинствам
данного подхода помимо высокой чувствитель!
ности относится возможность проводить изме!
рения в широком диапазоне значений рН, кон!
центраций солей и температуры. Показано, что
константы диссоциации NtrС существенно за!
622 ПЕРЕВОЩИКОВА и др.
висят от солевого буфера и отличаются на два
порядка (0,014 и 5,8 нМ) для 15 и 600 мМ аце!
тата калия соответственно. Следует отметить,
что анизотропию флуоресценции можно изме!
рять на приборе ФКС, который в данном слу!
чае используется как микрофлуориметр [25].
Такой подход позволил измерить константы
связывания 7!аминоактиномицина Д с ДНК
[23].
Рассмотрим подробнее способ оценки свя!
зывания меченого лиганда с рецептором, имею!
щим существенно меньший коэффициент диф!
фузии. Примером такой системы является взаи!
модействие меченых антигенов с антителами к
ним [69–71], меченых олигонуклеотидов с ДНК
и РНК [72, 73] или белков с липидными везику!
лами [74–77]. Ранее уже обсуждалось, что ос!
новными параметрами автокорреляционной
функции являются время диффузии τd и кон!
центрация частиц в конфокальном объеме N. В
системе, состоящей из молекул, имеющих раз!
личные значения τd, вклад каждого вида частиц
(i = 1, 2, 3, …, M) в значение автокорреляцион!
ной функции будет выражаться следующим об!
разом:
, (14)
где Ni – среднее число частиц, qi – нормирован!
ная интенсивность флуоресценции, Gi(τ) – авто!
корреляционная функция i!го компонента [78].
В случае системы, состоящей из двух видов час!
тиц (например, свободного флуоресцентно!ме!
ченного белка P и комплекса этого белка с ли!
посомами V), амплитуды автокорреляционных
функций представляются в виде
, лород и свободные радикалы), посредством ко!
(15)
, ческого действия фотосенсибилизаторов явля!
где Nр и Nv – числа частиц свободного белка и
липосом соответственно, N' – число частиц
комплексов липосом со связанным белком, α –
среднее число молекул белка на одну липосому.
С помощью такого подхода можно рассчи!
тать константы связывания белка с липосомами:
, (16)
где [P]mem – концентрация связанного белка,
[Р]tot – исходная концентрация белка, [L]асс –
общая концентрация липида. Общее количество
белка не меняется, т.е.
N0 = αNv + Np .
Тогда
. (17)
Величину Ар можно вычислить путем ап!
проксимации экспериментальных автокорреля!
ционных кривых диффузии белка, связанного с
липосомами, двухкомпонентным уравнением
(14), а N0 – путем аппроксимации автокорреля!
ционной функции диффузии свободного флуо!
ресцентного белка в растворе уравнением (6).
Таким образом были измерены константы свя!
зывания фрагмента белка MARCKS (myristoylat!
ed alanine!rich C!kinase substrate) с липосомами
различного липидного состава и проведено
сравнение результатов измерений с данными,
полученными с помощью традиционной мето!
дики определения связывания радиоактивно
меченного белка с использованием последую!
щего центрифугирования комплексов [74]. Дан!
ные хорошо согласовывались между собой. В
других работах ФКС применили для измерения
связывания с липосомами других важных бел!
ков [79–81], а также связывания белков с при!
родными мембранами [40].
Среди большого разнообразия биологически
активных молекул, обладающих яркой флуорес!
ценцией, значительный интерес представляют
фотосенсибилизаторы – соединения, способ!
ные при поглощении кванта света генерировать
активные формы кислорода (cинглетный кис!
торых осуществляется фотодинамическое воз!
действие [82]. Согласно результатам многочис!
ленных исследований важной стадией биологи!
ется связывание с плазматической мембраной
клеток [83]. Метод ФКС позволяет не только
получать количественную информацию о свя!
зывании фотосенсибилизаторов как с искус!
ственными [84], так и с природными [27, 85]
мембранами, но и исследовать его механизм. В
частности, с применением ФКС установлено,
что одним из существенных факторов связыва!
БИОХИМИЯ том 76 вып. 5 2011
 ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ КОРРЕЛЯЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ
ния с фосфолипидными мембранами фотосен!
сибилизаторов ряда металлофталоцианинов яв!
ляется взаимодействие центрального атома ме!
талла в молекуле фталоцианина с фосфатной
группой фосфолипида [84, 85].
Интересным примером исследования ли!
ганд!рецепторных систем методом ФКС являет!
ся изучение взаимодействия различных флуо!
ресцирующих лигандов с рецепторами, при!
крепленными к нефлуоресцирующим искус!
ственным сферам нанометрового диапазона.
Этот подход применили в работе, где изучалось
взаимодействие эстрогеновых β!рецепторов с
флуоресцентно!меченным белком – коактива!
тором этих рецепторов (SRC!1) в присутствии
17!β!эстрадиола и тамоксифена [86]. Анализ ав!
токорреляционных функций свободного лиган!
да и комплекса лиганд–рецептор–сфера позво!
лил рассчитать равновесные константы диссо!
циации.
Метод ФКС применяется для измерения не
только подвижности частиц в растворе, эмуль!
сии или суспензии, но и двумерной диффузии
частиц в искусственных и клеточных мембранах
[18, 87, 88]. Так, с помощью ФКС определены
коэффициенты диффузии флуоресцентно!ме!
ченных липидов в липидном бислое и изучено
влияние холестерина на их движение в составе
мембран гигантских липосом [89, 90]. К особен!
ностям данной системы относится формирова!
ние доменов, имеющих разное фазовое состоя!
ние, что естественно проявляется в существенно
различной подвижности липидов, зависящей от
их местоположения в липосоме. Путем регист!
рации сигнала ФКС в различных местах мемб!
раны неподвижно лежащей липидной везикулы
получены следующие значения коэффициентов
диффузии для липофильного красителя Dil!C20:
1 · 10–7 см2/с. Как было впоследствии
D = 3 · 10–8 cм2/с в жидкой фазе и D = 2 · 10–9
см2/с для фазы, которая обогащена холестери!
ном. Существенно, что полученные значения
хорошо соответствовали результатам измерений
методом восстановления флуоресценции после
фотообесцвечивания (FRAP).
Метод ФКС применялся также для измере!
ния диффузии липидов и белков в плазматичес!
ких мембранах клеток [91–93]. Эти работы
подтвердили ранее выявленные аномалии при
диффузии в клеточных мембранах, связанные с
наличием неподвижных субдоменов мембраны,
наличием так называемых рафтов, а также
структур, связанных с цитоскелетом [94].
Измерение диффузии частиц в мембране
требует прецизионного расположения мембра!
ны в центре конфокального объема. Предложен
метод оптимизации таких экспериментов путем
измерения серии автокорреляционных функ!
БИОХИМИЯ том 76 вып. 5 2011
623
ций при различных положениях конфокального
объема относительно плоскости мембраны (ось z)
[95, 96]. Путем аппроксимации зависимости τd
от z предложенной авторами функцией находит!
ся значение коэффициента диффузии частицы в
мембране с точностью, существенно превыша!
ющей таковую при однократном измерении τd.
К настоящему моменту накоплен уже боль!
шой опыт применения ФКС к живым системам.
Примером может служить работа, в которой по!
казано, что автокорреляционная функция флуо!
ресцентно!меченного кальмодулина (Alexa 488
calmodulin) в цитоплазме клеток HEK293 суще!
ственно сдвинута в сторону больших времен по
сравнению с таковой для выделенного кальмо!
дулина в водном растворе и отличается наличи!
ем нескольких диффузионных компонентов
[17]. Это, очевидно, связано с большей вяз!
костью цитоплазмы и образованием комплек!
сов белка с различными клеточными компонен!
тами, что и приводит к уменьшению коэффици!
ента диффузии в цитоплазме.
В сочетании с методом FRAP метод ФКС
был применен для изучения движения олиго!
нуклеотидов в ядре культивируемых миобластов
крысы [97]. Были определены коэффициенты
диффузии флуоресцентно!меченных олигодез!
окситимидина и олигодезоксиаденина длиной
43 нуклеотида [97]. Методом ФКС показали, что
большая часть обоих видов олигонуклеотидов
движется в ядре с коэффициентом диффузии
4 · 10–7 см2/с, что совпадает с коэффициентами
диффузии в водном растворе. Также удалось за!
регистрировать большую фракцию внутриядер!
ного олигодезокситимидина (45%), которая в
отличие от олигодезоксиаденина давала вторую
медленную компоненту с коэффициентом диф!
фузии
показано, эта медленная компонента соответ!
ствует комплексу олигодезокситимидина с по!
лиаденином внутриядерной РНК. Методом
FRAP для олигодезокситимидина не удалось за!
регистрировать две компоненты, и значение ко!
эффициента диффузии в этом случае оказалось
промежуточным между аналогичными значени!
ями для быстрой и медленной компонент, изме!
ренными методом ФКС. В случае олигодезокси!
аденина значения коэффициентов диффузии,
измеренные двумя методами, хорошо согласо!
вывались между собой.
ФКС активно применяется для изучения
взаимодействия лигандов с рецепторами на
природных мембранах. Так, было исследовано
взаимодействие флуоресцентно!меченного про!
инсулина С с рецепторами на плазматической
мембране нескольких линий клеток человека
[40]. Константы сродства оказались в диапазоне
624 ПЕРЕВОЩИКОВА и др.

десятых долей наномоля в зависимости от типа но отличается от резонансного переноса энер!

клеток. Специфичность взаимодействия была гии (FRET), который также часто применяется
показана путем блокирования связывания под для выявления образования межмолекулярных
действием специфических ингибиторов. В бо! комплексов и внутримолекулярных взаимодей!
лее поздней работе было изучено взаимодей! ствий. В этом случае сигнал кросскорреляции
ствие рецепторов ростовых факторов фибро! означает одновременное появление двух видов
бластов (Fgfr1 и Fgfr4) с их лигандом Fgf8 in vivo в метки в конфокальном объеме.
клетках Danio rerio [98]. Для этого на стадии эмб! Использование метода ФКС для изучения ки;
риогенеза в клетки вводились мРНК соответ! нетики химических реакций биологически актив;
ствующих белков, конъюгированных с флуорес! ных молекул. Как было описано ранее, в своем
центными белками. Были измерены коэффици! первоначальном представлении метода ФКС
енты диффузии изученных Fgfr рецепторов в Магде с соавт. [28] продемонстрировали воз!
плазматической мембране, а также константы можность изучения кинетики химических реак!
их сродства с Fgf8. Исследования лиганд!рецеп! ций с участием биомолекул, а именно: взаимо!
торных комплексов в клетках методом ФКС бы! действия ДНК с молекулой бромида этидия.
ли недавно обобщены в подробном обзоре [16]. Рассмотрим подробнее теорию ФКС примени!
Метод ФКС применялся также для диагно! тельно к мономолекулярной реакции изомери!
стики различных заболеваний, например ВИЧ! зации:
инфекции и туберкулеза [99, 100]. При иденти!
фикации ВИЧ!инфекции метод ФКС совмести! [11].
ли с методом изотермической амплификации
ДНК/РНК, который позволяет избирательно
увеличивать концентрацию РНК ВИЧ!1. В ра! Примем, что состояние А вещества флуорес!
боте использовали флуоресцентно!меченный цирующее, состояние В – нефлуоресцирующее
олигонуклеотидный праймер, специфичный в (квантовые выходы флуоресценции QA = Q, QB = 0)
отношении участка гена gag ВИЧ!1 для синтеза и коэффициенты диффузии молекул не меня!
ДНК с анализируемой РНК матрицы. В резуль! ются в процессе изомеризации (DA = DB = D).
тате специфической гибридизации и удлинения Тогда изменение концентраций А и В будет про!
цепи ДНК в ходе реакции амплификации уве! исходить за счет процессов диффузии и хими!
личивалось время диффузии флуоресцентно! ческой реакции:
меченной молекулы, что и регистрировалось
методом ФКС. Такая модификация метода изо!
термической амплификации ДНК/РНК имеет
ряд преимуществ. Во!первых, можно следить за
процессом в режиме реального времени по уве!
личению времени диффузии флуоресцентной , (18)
молекулы. Во!вторых, процесс можно анализи!
ровать параллельно в большом количестве ис!
следуемых проб. В!третьих, не требуется откры!
вания реакционных систем, что исключает риск
загрязнения. В случае изучения кинетики амп!
лификации генома возбудителя туберкулеза ис!
пользовали процедуру полимеразной цепной
реакции вместо изотермической амплификации
ДНК/РНК [100].
Интересной модификацией метода ФКС яв! . (19)
ляется одновременное измерение флуоресцен!
ции двух независимых красителей (так называе!
мая двухцветовая ФКС, или dual!color FCS) Решение этих уравнений [29] дает следую!
[101]. Это позволяет проводить очень точные щее выражение для автокорреляционной функ!
измерения гибридизации олигонуклеотидов, ции:
несущих две различные флуоресцентные метки.
Появление сигнала кросскорреляции свиде!
тельствует об образовании комплексов между
двумя нуклеотидами. Следует отметить, что дан! , (20)
ный способ не требует переноса энергии с одно!
го красителя на другой и тем самым существен!

БИОХИМИЯ том 76 вып. 5 2011

 ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ КОРРЕЛЯЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ
где N = (CA + CB)V – общее число молекул А и В
в объеме наблюдения, K = kAB /KBA = CB /CA –
константа равновесия химической реакции,
τR = (kAB + kBA)–1 – время релаксации химичес!
кой реакции.
Уравнение (20) содержит два компонента,
один из которых аналогичен приведенному в
уравнении (6), описывающему автокорреляци!
онную функцию для трехмерной диффузии, а
другой соответствует вкладу химической реак!
ции. Для временнóго промежутка τ << τR,τd амп!
литуда автокорреляционной функции обратно
пропорциональна числу флуоресцирующих мо!
лекул А (G(τ→0) = 1/NA, NA = CAVконф). Если ско!
рость химической реакции больше времени
диффузии (τR << τd), то для временных ` проме!
жутков, бóльших τR, автокорреляционная функ!
ция определяется преимущественно диффузией
(уравнение (6)), причем в этом случае G(τ→0) =
= 1/N, т.е. амплитуда автокорреляционной
функции зависит от общего числа молекул, что
связано с быстрыми переходами между состоя!
ниями А и В.
Переход молекулы из флуоресцирующего
состояния в нефлуоресцирующее может быть
связан с протонированием–депротонировани!
ем молекулы, как в случае зеленого флуоресци!
рующего белка (GFP) [102]. Анализ автокорре!
ляционных функций GFP при разных значени!
ях рН показал, что время перехода составляет
300 мкс при рН 7 и уменьшается до 45 мкс при
рН 5; при этом 80% молекул переходят в нефлуо!
ресцирующее состояние. При щелочных значе!
ниях рН зарегистрировано время перехода 340
мкс, не связанное с протонированием–депрото!
нированием. Авторы предполагают, что мерцание
флуоресценции белка при рН 8–11 связано с
внутримолекулярным переносом протона или из!
менением конформационного состояния белка.
В работе [103] была рассмотрена более прос!
тая система – переходы между флуоресцирую!
щим и нефлуоресцирующим состояниями кра!
сителя флуоресцеина в водном растворе. В част!
ности, характерное время перехода из депрото!
нированной двухзарядной флуоресцирующей
формы в однопротонированную анионную сла!
бофлуоресцирующую форму при рН 9,4 состав!
ляло 5,4 мкс. В последующей работе этой же ла!
боратории метод ФКС применили для изучения
латеральной подвижности протонов на поверх!
ности липидной мембраны, а также процесса
отрыва–присоединения протонов к липидной
поверхности [104]. Для этого использовали два
флуоресцентно!меченных липида на основе
фосфатидилэтаноламина: один представлял со!
бой конъюгат с флуоресцеином, а другой – с
орегоновым зеленым. Было показано, что в об!
2 БИОХИМИЯ том 76 вып. 5 2011
625
ласти рН >8 процесс протонирования поверхно!
стного красителя включает в себя взаимодей!
ствие протона со всей поверхностью мембраны
(т.е. мембрана работает как антенна, собираю!
щая протоны), тогда как при более низких зна!
чениях рН протонирование красителя происхо!
дит без участия мембраны, т.е. так же, как и в
растворе.
Была измерена кинетика образования комп!
лексов ионов калия с флуоресцентно!меченным
К+!индикатором TAC!К+ методом ФКС [105].
При образовании комплекса индикатора с ио!
нами калия происходил переход из нефлуорес!
цирующего состояния свободного индикатора
во флуоресцирующее состояние индикатора,
связанного с ионами калия:
,
где kа – константа образования комплекса и kd –
константа распада комплекса. Анализ автокор!
реляционных функций при разных концентра!
циях ионов калия в растворе позволил опреде!
лить константы ассоциации и диссоциации
комплекса (0,0020 ± 0,0003 мМ–1 · мс–1 и 0,12 ±
± 0,02 мс–1 соответственно).
Методом ФКС была изучена кинетика взаи!
модействия пиронина Y и пиронина B с β!цик!
лодекстрином [106]. При добавлении циклодек!
стрина происходил сдвиг автокорреляционной
функции в область больших времен (от 250 до
400 мкс) и появилась быстрая компонента G(τ) в
диапазоне 0,1–1 мкс. Показано, что связывание
обоих красителей было быстрым и лимитирова!
лось диффузией. Основной вклад в различие их
равновесных констант связывания вносило раз!
личие в скоростях диссоциации комплексов.
Были измерены также коэффициенты диффу!
зии свободных красителей и их комплексов с
циклодекстринами.
С помощью метода ФКС можно следить за
образованием водородных связей, приводящим
к сворачиванию биополимеров. Например,
ФКС использовали для изучения кинетики об!
разования петли короткоцепочечной молекулы
ДНК [107]. К одному концу молекулы ДНК ко!
валентно присоединялся флуоресцентный кра!
ситель (родамин 6G), а к другому – тушитель
флуоресценции родамина DABCYL. Таким об!
разом, флуоресценция была яркой в разверну!
том состоянии ДНК и существенно затушенной
при образовании шпильки. Формула (20) была
преобразована для двумерного движения и ис!
пользована для вычисления кинетических пара!
метров химической реакции образования вто!
ричной структуры ДНК:
626 ПЕРЕВОЩИКОВА и др.
, (21)
где р – доля молекул в развернутом состоянии,
1/τR = k– + k+, k– – константа скорости перехо!
да из закрытого (свернутого) состояния в от!
крытое, k+ – константа скорости перехода из сво!
бодного в свернутое состояние. Так как время
диффузии молекулы ДНК (τd = 150 мкс) попада!
ло в диапазон времен реакции τR = 5 мкс – 1 мс,
то для вычисления τR исследовали контрольный
образец ДНК, в котором отсутствовал тушитель
флуоресценции родамина 6G, т.е. автокорреля!
ционная функция характеризовала только диф!
фузионную компоненту. Для фрагмента ДНК из
21 нуклеотида τR = 134 мкс при 10° и τR = 28 мкс
при 45°.
Методом ФКС изучалась аналогичная систе!
ма, однако вместо тушения флуоресценции из!
меряли перенос энергии с одного конца молеку!
лы РНК на другой (FRET) [108]. Для этого ис!
пользовали пару красителей Cy3 и Cy5. Кон!
формационная динамика РНК приводила к по!
явлению флуктуаций сигнала FRET в миллисе!
кундном диапазоне, которые зависели от кон!
центрации ионов магния и натрия. Авторы сде!
лали вывод, что процесс ассоциации–диссоциа!
ции ионов не вносит вклад в наблюдаемую внут!
римолекулярную динамику молекулы РНК. Су!
щественно, что в данной работе молекулы РНК
были иммобилизованы на стекле, покрытом
стрептавидином, с помощью дополнительно
пришитой молекулы биотина.
В работе [109] метод ФКС применили для
изучения суперспирализации плазмидной ДНК
длиной 2686 пар оснований (плазмида pUC18).
В данном случае источником флуктуаций флуо!
ресценции плазмиды, меченной родамином 6G
по одному основанию, была конформационная
динамика данной протяженной молекулы,
пространственные размеры которой превышали
размеры конфокального объема. Кольцевая
ДНК может иметь форму окружности, а также
спирализоваться и формировать дополнитель!
ные петли. Оказалось, что автокорреляционная
функция ДНК без петель хорошо описывается
простым уравнением диффузии, наличие петель
приводит к появлению дополнительной компо!
ненты G(τ), которая соответствует быстрым пе!
реходам между различными конформациями
ДНК.
ФКС применяется для изучения конформа!
ционной динамики не только ДНК, но и белков.
Измерена автокорреляционная функция белка,
ответственного за перенос жирных кислот в ки!
шечнике (intestinal fatty acid binding protein),
точнее его цистеинового мутанта в положении
60 с ковалентно пришитым флуоресцеином
Val60Flu [110]. Показано, что уравнение (6), со!
ответствующее чисто диффузионной динамике
частиц, плохо описывает наблюдаемую G(τ) бел!
ка в растворе. При этом измеряемое значение τd
лишь ненамного превышало значение τd для
свободных молекул красителя (71 и 55 мкс соот!
ветственно). В то же время уравнение (20), кото!
рое включает в себя наряду с диффузионной
компонентой еще и реакцию первого порядка,
отражающую конформационную динамику бел!
ка, очень точно описывало G(τ) белка. При этом
значение τd, определенное для данного белка,
уже достаточно хорошо соответствовало частице
такой большой молекулярной массы (120 мкс).
Компонента, включающая в себя конформаци!
онную динамику τR (35 мкс), существенно зави!
села от рН и исчезала при закислении, что объ!
яснялось денатурацией данного белка. В работе
[111] подобный подход применили для изучения
динамики небольшой белковой субъединицы
оксоглутаратдегидрогеназы из E. coli. Было вы!
явлено несколько характерных времен сворачи!
вания данного белка, причем самое короткое
время составило 500 нс. Авторы отметили, что
это время оказалось более коротким, чем пред!
сказывалось теорией «стохастического клубка»
биополимера.
Применение метода ФКС для изучения движе;
ния отдельных молекул в проточных системах.
Метод ФКС может быть применен для опреде!
ления скоростей потоков флуоресцентно!ме!
ченных частиц, в том числе биологически важ!
ных молекул [55, 112–114]. Формула для авто!
корреляционной функции при движении час!
тиц в потоке с определенной скоростью имеет
вид [55]
, (22)
. (23)
В этом уравнении τd и τflow – соответственно
времена прохода частицы через конфокальный
объем путем свободной диффузии и под
действием постоянного потока жидкости. Зна!
чение τflow может быть использовано для оценки
скорости потока жидкости:
БИОХИМИЯ том 76 вып. 5 2011
 ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ КОРРЕЛЯЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ
, (24)
где r0 – радиус конфокальной плоскости.
Практически поток обычно задается с по!
мощью расположения резервуара с разбавлен!
ным раствором флуоресцентно!меченнного
препарата на различной высоте. Перепад давле!
ния создает стационарный поток со скоростью
V, пропорциональной разности давлений. По!
казано, что скорость потока максимальна в
центре канала и приближается к нулю около его
стенок [55] в соответствии с параболическим
профилем скорости в сечении канала, который
задается уравнением Пуазейля для ламинарного
потока:
, (25)
где η – вязкость раствора, l – длина канала, d –
полуширина канала. В работе [55] в качестве
флуоресцентного маркера для определения ско!
рости потока использовался уридинтрифосфат,
ковалентно меченный тетраметилродамином
(10–10 М).
Установка ФКС с проточным капилляром
очень напоминает устройство проточного ци!
тофлуориметра и может использоваться по су!
ществу в этих же целях [115]. Однако, несмотря
на внешнее сходство, между ними имеются су!
щественные различия, которые заключаются в
геометрии сфокусированного возбуждающего
света. У проточного цитофлуориметра пятно
возбуждающего света имеет большие размеры и
яркость освещения внутри пятна более равно!
мерна, в результате чего достигаемая яркость
свечения существенно меньше, чем в ФКС. По
этой причине с помощью проточного цито!
флуориметра удобно изучать целые окрашенные
клетки, тогда как выделенные органеллы (суб!
микронного размера) обычно имеют недоста!
точную яркость. Метод ФКС, напротив, облада!
ет достаточной чувствительностью для регистра!
ции свечения отдельных молекул флуорофора.
Применение потока жидкости в ячейке в це!
лях увеличения числа регистрируемых событий
при прохождении частиц через конфокальный
объем описано в работе, где регистрировали
флуоресцентно!меченные одно! и двунитевые
молекулы ДНК [116]. Были определены ампли!
туды пиков флуоресценции, что позволило про!
вести популяционный анализ суспензии ДНК
при различных температурах. Зависимости ши!
рины пиков сигнала ФКС и площади под пика!
БИОХИМИЯ том 76 вып. 5 2011
627
ми от скорости потока и размера частиц были
проанализированы в работе [115]. Было показа!
но, что с увеличением размера частицы при по!
стоянной скорости потока ширина и площадь
пика увеличиваются. Авторы предложили ис!
пользовать данную зависимость для определе!
ния размера частиц, движущихся в потоке с
определенной скоростью.
Смешивание препаратов непосредственно в
конфокальном объеме с помощью микрофлю!
идных устройств (microfluidics) открывает новые
возможности для изучения кинетики быстрых
взаимодействий. Так, была показана модифика!
ция микроячейки, в которой два реагирующих
препарата разделены буферным раствором та!
ким образом, что смешивание происходит толь!
ко в фокусе лазерного луча [117]. Ячейка имеет
пять входов и один выход. В центральный канал
подается раствор А с одним видом биомолекул,
в перпендикулярном направлении подается
раствор Б с другим видом биомолекул. В диаго!
нальном направлении осуществляется поток
раствора А без биомолекул, что и предотвраща!
ет преждевременное смешивание препаратов из
растворов А и Б. Метод ФКС позволил пол!
ностью охарактеризовать гидродинамические
условия в такой ячейке и провести оценку ско!
рости смешивания двух растворов по реакции
тушения флуоресцентно!меченного декстрана
под действием йодида калия (характерное время
смешивания 0,1 мс).
Существует и более сложный вариант ФКС,
который специально был разработан для более
полной характеристики потоков жидкости. Речь
идет о двухфокусной (dual focus) кросскорреля!
ционной установке, которая позволяет опреде!
лять не только скорость потока, но и направле!
ние движения частиц. Оптическая схема в этом
случае принципиально отличается от представ!
ленной на рис. 3 наличием двух объемов наблю!
дения, разнесенных друг от друга на расстояние
~2 мкм [112]. При каждом измерении записыва!
ются две кросскорреляционные кривые, соот!
ветствующие корреляции сигналов флуоресцен!
ции в первом и втором конфокальных объемах в
направлении потока и против него. Кросскор!
реляционная функция движения в направлении
потока имеет пик, соответствующий прохожде!
нию одной и той же частицы сначала через пер!
вый, а затем через второй конфокальный объем.
Если поток направлен перпендикулярно векто!
ру, соединяющему два конфокальных объема,
кросскорреляция сигналов будет отсутствовать
[112].
ФКС применяется и в сочетании с капил!
лярным электрофорезом [118–121], позволяю!
щим разделять заряженные вещества в электри!
2*
628 ПЕРЕВОЩИКОВА и др.
ческом поле. Теоретически в стандартном мето!
де ФКС для надежной дискриминации двух
флуоресцирующих веществ необходимо иметь
не менее чем восьмикратное различие в их мо!
лекулярной массе М (в силу того что D ~M–1/3),
тогда как электрофоретическая подвижность
пропорциональна отношению заряда к массе,
т.е. более чувствительна к изменению массы мо!
лекулы [119]. Однако измерения подвижности в
электрическом поле серии молекул ДНК прак!
тически показали отсутствие зависимости под!
вижности от длины, тогда как коэффициент
диффузии, измеренный методом ФКС, заметно
менялся в зависимости от длины молекул в со!
ответствии с моделью жесткого цилиндра [120].
Одно из практически значимых применений
ФКС в билогических исследованиях – изучение
скорости потока крови в сосудах. Наличие ав!
тофлуоресцирующих компонентов крови, таких
как эритроциты, позволяет проводить исследо!
вания без дополнительной модификации био!
молекул или введения маркеров. Совместно с
лазерной сканирующей микроскопией метод
ФКС применили для определения скорости
кровотока в сосудах мозга эмбриона рыбки D.
rerio [122]. Для визуализации сосудов в данном
эксперименте во всех эндотелиальных клетках
кровеносных сосудов экспреcсировали GFP.
После фиксации эмбриона был выбран одиноч!
ный сосуд, в котором проводились дальнейшие
измерения скорости потока методом ФКС. По!
лученное значение скорости (1,67 мм/с) хорошо
согласовывалось со значениями скоростей для
сосудов сердца D. rerio [123].
Анализ пиков флуоресценции в суспензии яр;
ких частиц. Обработка сигнала флуоресценции в
виде автокорреляционной функции не всегда
является оптимальным вариантом анализа сис!
темы методом ФКС. Так, в случае смеси частиц,
существенно различающихся по яркости, G(τ)
будет практически полностью определяться
вкладом ярких частиц. Кроме того, в суспензии
частиц большого размера (липосомы, выделен!
ные митохондрии и т.д.) при их низкой концен!
трации воспроизводимое измерение G(τ) связа!
но с накоплением сигнала на протяжении дли!
тельного времени (вплоть до нескольких часов),
что затрудняет решение этой задачи. Поэтому
при работе с такого рода системами предложили
использовать другой вариант анализа – подсчет
числа и амплитуды пиков флуоресценции в из!
начальной временнóй записи сигнала. Такой
подход очень характерен для анализа электро!
физиологических данных и имеет развитый ма!
тематический аппарат.
В частности, анализ пиков применили для
изучения связывания флуоресцентно!меченно!
го колхицина с тубулином [124, 125]. Если в
растворе присутствуют только молекулы флуо!
ресцирующего лиганда, запись сигнала флуо!
ресценции в зависимости от времени представ!
ляет собой прямую с небольшими отклонения!
ми от среднего значения. При добавлении к это!
му раствору частиц, способных связать несколь!
ко молекул флуоресцирующего лиганда, в запи!
си интенсивности флуоресценции появляются
пики с высокой амплитудой, характерной для
образования комплексов. Поскольку частицы,
связавшие разное число флуоресцирующих мо!
лекул, различаются по яркости, авторы предла!
гают анализировать не число образовавшихся
комплексов, т.е. пиков, а суммарную площадь
под пиками на графике зависимости интенсив!
ности флуоресценции от времени. Контрольные
измерения показали линейную зависимость
этого параметра от числа частиц, на которых
сорбировался флуоресцирующий лиганд [124].
Такой анализ применяется при определении
константы связывания лиганда [124].
Аналогичный подход использовали для ана!
лиза связывания катионного полимера поли[(2!
диметиламино)этилметакрилата] (pDMAEMA)
с флуоресцентно!меченным олигонуклеотидом
(Rh!ON) [126]. Как известно, комплексы ДНК с
катионными полимерами более эффективно
осуществляют трансфекцию по сравнению со
свободной ДНК. Состав комплексов pDMAEMA–
Rh!ON исследован как функция соотношения
зарядов катионов и анионов ϕ(+/–). Авторы по!
казали, что в комплексах катионного полимера
с олигонуклеотидом, имеющих ϕ < 1, происхо!
дит тушение флуоресценции в связи с высокой
концентрацией олигонуклеотида на одной це!
почке полимера. Дальнейшее увеличение кон!
центрации полимера приводит к увеличению
числа пиков высокой амплитуды, что связано с
распределением молекул олигонуклеотида меж!
ду цепочками полимера в концентрации, не
достаточной для самотушения. При достижении
определенного соотношения зарядов, когда
каждой цепочке полимера будет соответство!
вать одна молекула олигонуклеотида, дальней!
шее увеличение концентрации полимера не
приведет к увеличению числа пиков, что и на!
блюдалось авторами при ϕ = 15 [126]. Этим ме!
тодом исследовали также связывание других ка!
тионных полимеров [127].
Подобный вариант метода ФКС, включаю!
щий в себя анализ пиков сигнала флуоресцен!
ции, применяли и для исследования вытекания
флуоресцентного красителя из замкнутых ли!
пидных везикул (липосом) под действием раз!
личных факторов [128–132]. Ван ден Богаарт с
соавт. [129, 133] предложили модифицирован!
БИОХИМИЯ том 76 вып. 5 2011
 ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ КОРРЕЛЯЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ
ный вариант анализа пиков, который включал в
себя регистрацию сигнала двух флуоресцентных
маркеров, различающихся по спектральным
свойствам. Свой вариант анализа авторы назва!
ли двухцветовым анализом пиков флуоресцен!
ции (dual color fluorescence burst analysis
(DCFBA)). Один гидрофильный маркер находил!
ся внутри липосом, тогда как второй был липо!
фильным и находился в липидном бислое. Если
воздействие не приводило к формированию пор
в мембране и целостность липосом сохранялась,
сигналы интенсивности флуоресценции двух
маркеров совпадали по времени и продолжи!
тельности, так как оба маркера двигались сов!
местно в каждой липосоме. В случае если к ли!
посомам добавляли каналообразующий агент и
образовывались поры, размер которых был
больше размера молекул гидрофильного марке!
ра, последний выходил из липосом и сигналы
флуоресценции больше не совпадали (рис. 8).
Анализ пиков позволил определить концен!
трацию молекул!маркеров внутри липосом, ко!
торая рассчитывалась по следующей формуле
для каждого пика:
, (26)
где Iliposome, Isize!marker – флуоресцентный сигнал
липосом и молекул внутренних маркеров соот!
ветственно, причем значение Iliposome больше не!
которого значения Ioffset на временнóм проме!
жутке t1–t2; возведение в степень 3/2 в знамена!
теле связано с тем, что флуоресцентная метка
находится на поверхности липосом, тогда как
молекулы!маркеры находятся в растворе внутри
липосом.
Данный подход применили при изучении
механочувствительного канала MscL [133]. Этот
белок был встроен в липосомы, окрашенные ли!
пофильной меткой DiO и нагруженные флуо!
ресцентно!меченными молекулами!маркерами
различного размера. Показано, что для соедине!
ний размерами 2–3 нм (белки молекулярной
массой до 7 кДа) концентрация молекул!марке!
ров внутри липосом уменьшалась по мере от!
крывания канала MscL. Результаты исследований
отдельных липосом методом DCFBA использо!
вали для оценки степени встраивания белка
MscL в липосомы. Показано, что только 50%
всего количества липосом теряет свое содержи!
мое при активации канала. Это значит, что при!
мерно половина липосом несет в себе функцио!
БИОХИМИЯ том 76 вып. 5 2011
629
нально неактивный белок. На основе соотноше!
ния белок–липид рассчитали, что в одной липо!
соме присутствует ~10 молекул белка, образую!
щих каналы. Тогда эффективность встраивания
составляет <10%.
Применение данного подхода может быть
очень эффективным и в случае изучения ли!
ганд!рецепторных систем. Для этого необходи!
мо приготовить липосомы с встроенным в них
флуоресцентно!меченным рецепторным бел!
ком, и лиганд при этом тоже должен иметь
флуоресцентую метку, спектрально отличную от
метки рецептора. При этом необходимо, чтобы
сродство лиганда к рецептору было достаточно
высоким и исключающим фоновый сигнал
флуоресценции свободного лиганда в растворе.
Данный подход применили для вычисления
константы связывания флуоресцентно!мечен!
ного белка SecA с флуоресцентно!меченным
белком канала SecYEG секреторной системы
E. coli. Путем изменения концентрации немече!
ного лиганда (SecA) была получена константа
связывания Кass = 4 нМ [129, 134].
Выше уже обсуждалась возможность приме!
нения проточного капилляра для анализа пиков
сигнала флуоресценции. Альтернативой этому
является использование принудительного пере!
мешивания раствора суспензии частиц. В нашей
лаборатории анализ пиков сигнала флуоресцен!
ции применили для анализа связывания потен!
циалзависимых красителей с выделенными ми!
тохондриями [26, 135]. Так как размеры митохон!
дрий существенно больше размеров липосом, в
этом случае анализ G(τ) затруднен или даже не!
возможен в силу лабильности препарата выде!
ленных митохондрий. Было показано, что ана!
лиз пиков существенно улучшается в случае пе!
ремешивания суспензии митохондрий. На рис. 9
приведены примеры записей флуоресценции
тетраметилродамина этилового эфира (TMRE) в
суспензии митохондрий без перемешивания
(левая сторона) и в условиях перемешивания
(правая сторона). На средней записи, сделанной
в условиях энергизации митохондрий, пики
флуоресценции TMRE проявляются наиболее
отчетливо. При деэнергизации происходит па!
дение мембранного потенциала митохондрий,
приводящее к выходу катионного красителя во
внешнюю среду (нижние записи на рис. 9). Дан!
ный подход может быть применен для анализа
связывания с митохондриями не только гидро!
фобных соединений, но и таких сравнительно
гидрофильных веществ, как флуоресцентно!ме!
ченный ATP [136], а также различных заряжен!
ных фталоцианинов [85].
Следует отметить, что перемешивание сус!
пензии частиц для увеличения числа регистри!
630 ПЕРЕВОЩИКОВА и др.

60 а
40

20

120 б
80

40

60 а
40

20

120 б
80

40

60 а

40

20

120 б

80

40

0
0,0 0,1 0,2 0,3

Время, с

` зависимости интенсивности флуоресценции липосом, нагруженных двумя флуоресцентными марке!

Рис. 8. Временные
рами. а – Для липофильной метки, б – одновременно измеренная зависимость для гидрофильной метки (модифициро!
ванный рисунок из работы [129])

БИОХИМИЯ том 76 вып. 5 2011

 ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ КОРРЕЛЯЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ 631

руемых событий может быть заменено на пере!
мещение конфокального объема внутри ячейки.
Этого можно добиться либо путем синхронизо!
ванного движения лазерного луча и положения
конфокальной диафрагмы (как это осуществля!
ется в конфокальном микроскопе), либо путем
перемещения столика микроскопа. Такой вари!
ант ФКС был реализован еще на заре возникно!
вения самого метода [137] и успешно применял!
ся для изучения олигомеризации белков в раст!
воре [138], регистрации траектории движения
наночастиц [139], а также изучения динамики
белков и лиганд!рецепторного взаимодействия
в живых клетках [19].
Рассмотренные приложения метода ФКС
охватывают самые разные области исследова!
ний – от простых химических систем (раст!
вор–мицелла) до тонких процессов регуляции
на уровне живых клеток. Наиболее полно в об!
зоре отражены приложения, касающиеся искус!
ственных и природных мембран. Это связано со

а б
2 2 Неэнергизованное 3 Энергизованное
состояние состояние
100 кГц

+ сукцинат

3
+ митохондрии + ДНФ
ротенон

4 1
•
СH3СH2COO
1
20 с • •
(СH3)2N O N(СH3)2
4 Деэнергизованное
ТМRE состояние

1 МГц
2

50 мс

Рис. 9. а – Зависимость интенсивности флуоресценции от времени для суспензии митохондрий, окрашенных TMRE
(0,3 мкМ) в отсутствие перемешивания. 1 – Контрольная запись в растворе TMRE, 2 – неэнергизованное состояние ми!
тохондрий в присутствии ротенона, 3 – энергизованное состояние после добавления сукцината, 4 – деэнергизованное
состояние после добавления ДНФ. б – Схематическое представление цепи событий взаимодействия красителя TMRE с
отдельной митохондрией в различных энергетических состояниях. в – Зависимость интенсивности флуоресценции от
времени для суспензии митохондрий, окрашенных TMRE (0,03 мкМ) в условиях перемешивания. 1 – Митохондрии и ро!
тенон, 2 – добавка сукцината, 3 – добавка ДНФ

БИОХИМИЯ том 76 вып. 5 2011

632 ПЕРЕВОЩИКОВА и др.
сферой первичных научных интересов авторов
обзора. Однако мы старались описать наиболее
характерные примеры и из других приложений.
Наша главная задача – показать на данных при!
мерах широкие возможности данного метода,
чтобы читатели могли оценить его примени!
мость для изучения конкретных систем.
Отличительное свойство метода ФКС – вы!
сокая чувствительность. Это позволяет работать
при концентрациях флуоресцентного маркера
~1 нМ в объемах измерения от 10 до 1000 мкл,
т.е. типичное измерение требует ~10–13 моля ве!
щества. В то же время ФКС вряд ли можно при!
равнивать к прямым методам измерения флуо!
ресценции отдельных молекул, поскольку по
своей сути за типичное время измерений (1 мин)
анализируется статистика для большого ансамб!
ля молекул (характерное значение ~103 моле!
кул), что позволяет проводить усреднение как
свойств самого используемого маркера (яркос!
ти, подвижности и т.д.), так и параметров его
взаимодействия с другими компонентами сис!
темы. Следовательно, данным методом не могут
быть напрямую решены такие задачи (типичные
для регистрации одиночных молекул), как
изучение «мерцания» (blinking) флуоресцен!
ции, идентификация множественных интерме!
диатов реакций, в том числе различных конфор!
мационных состояний на прямом и обратном
путях реакции [140–144]. Таким образом, метод
ФКС стоит на полпути исследования интеграль!
ных свойств вещества в целом и индивидуаль!
ных свойств отдельных молекул со всеми выте!
кающими из этого преимуществами и недостат!
ками.
Чувствительность метода ФКС можно оха!
рактеризовать на примере сравнительного из!
учения взаимодействия меченых олигонуклео!
тидов с ДНК. Показано, что чувствительность
ФКС примерно соответствует чувствительности
измерений взаимодействия по радиоактивной
метке, однако ФКС не требует работы с радио!
активностью и не требует физического разделе!
ния компонентов. Для применения метода ФКС
достаточно существенно меньшего количества
вещества по сравнению с используемым при из!
мерениях методами кругового дихроизма или
калориметрии. Кроме того, ФКС дает дополни!
тельную информацию о коэффициентах диффу!
зии, яркости частиц, степени их агрегации, кон!
центрации комплексов и, наконец, кинетике
межмолекулекулярного и внутримолекулярного
взаимодействия [12].
Если настоящий обзор вызвал интерес у чи!
тателя в плане конкретного применения данно!
го подхода, то возникает вопрос о практической
реализации измерения ФКС. Иными словами,
насколько сложно сделать такой прибор у себя в
лаборатории? Опыт авторов показал, что задача
изготовления такого прибора достаточно реаль!
на при наличии соответствующих блоков. Среди
них главными являются флуоресцентный мик!
роскоп, лазер, ФЭУ (или высокочувствитель!
ный светодиод) и коррелятор. Лазер, ФЭУ и
коррелятор являются стандартными компонен!
тами достаточно распространенной установки
по измерению динамического светорассеяния.
Кроме того, в отличие от газовых лазеров совре!
менные твердотельные лазеры (особенно зеле!
ный) уже достаточно распространены и характе!
ризуются большим временем безотказной не!
прерывной работы. Наладка установки ФКС
при наличии вышеописанных блоков подробно
описана в литературе [11, 13]. Собственный
опыт авторов обзора показал, что даже в отсут!
ствие навыков работы с оптическими прибора!
ми наладка самодельного прибора ФКС занима!
ет всего несколько дней. Следует отметить так!
же, что компании, выпускающие конфокальные
микроскопы, наладили выпуск приставок, поз!
воляющих проводить измерения ФКС. Авторы
будут считать свою задачу выполненной, если
прочтение данного обзора убедит читателей в
необходимости практического поиска возмож!
ностей конструирования прибора ФКС (или его
приобретения) и его применения в своей экспе!
риментальной работе. Метод ФКС, безусловно,
должен занять более заметное место в современ!
ной российской науке.
Авторы выражают благодарность проф.
Д.Б. Зорову (НИИ физико!химической биоло!
гии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломо!
носова) за плодотворное обсуждение обзора и
проф. Петре Швилле (Технический университет
Дрездена) за предоставление макетов некоторых
рисунков.
БИОХИМИЯ том 76 вып. 5 2011
 ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ КОРРЕЛЯЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Каск П., Кяндлер Т. (1978) Изв. АН ЭССР, 27, 73–78.
2. Каск П., Кяндлер Т., Сирк А., Кару Т., Липпмаа Э.
(1979) Изв. АН ЭССР, 28, 221–226.
3. Кяндлер Т., Каск П., Пиксарв П., Сирк А., Липпмаа
Э. (1982) Изв. АН ЭССР, 31, 314–319.
4. Кяндлер Т.Э. (1985) Флуоресцентная корреляционная
спектроскопия в исследовании динамики химических
систем. Дис. канд. физ.!мат. наук, Тартуский государ!
ственный университет, Тарту.
5. Kask, P., Piksarv, P., Mets, U., Pooga, M., and Lippmaa,
E. (1987) Eur. Biophys. J., 14, 257–261.
6. Kask, P., Piksarv, P., Pooga, M., Mets, U., and Lippmaa,
E. (1989) Biophys. J., 55, 213–220.
7. Kask, P. (1987) Stud. Biophys., 118, 7–24.
8. Fluorescence Сorrelation Spectroscopy: Theory and Applica
tions (Rigler, R., and Elson, E., eds), 2001, Springer, N.Y.
9. Eigen, M., and Rigler, R. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 91, 5740–5747.
10. Schwille, P. (2001) Cell. Biochem. Biophys., 34, 383–408.
11. Krichevsky, O., and Bonnet, G. (2002) Rep. Prog. Phys.,
65, 251–297.
12. Hess, S.T., Huang, S., Heikal, A.A., and Webb, W.W.
(2002) Biochemistry, 41, 697–705.
13. Sengupta, P., Balaji, J., and Maiti, S. (2002) Methods, 27,
374–387.
14. Enderlein, J., Gregor, I., Patra, D., and Fitter, J. (2004)
Curr. Pharm. Biotechnol., 5, 155–161.
15. Gosch, M., and Rigler, R. (2005) Adv. Drug Deliv. Rev., 57,
169–190.
16. Briddon, S.J., and Hill, S.J. (2007) Trends Pharmacol. Sci.,
28, 637–645.
17. Kim, S.A., Heinze, K.G., and Schwille, P. (2007) Nat.
Methods, 4, 963–973.
18. Machan, R., and Hof, M. (2010) Biochim. Biophys. Acta,
1798, 1377–1391.
19. Petrasek, Z., Ries, J., and Schwille, P. (2010) Methods
Enzymol., 472, 317–343.
20. Garcia!Saez, A.J., and Schwille, P. (2010) Biochim.
Biophys. Acta, 1798, 766–776.
21. Serdyuk, I.N., Zaccai, N.R., and Zaccai, J. (2007) in
Methods in Molecular Biophysics: Structure, Dynamics,
Function, Cambridge University Press, Cambridge.
22. Сухарев В.И., Векшин Н.Л. (2000) Биоорган. химия, 26,
723–727.
23. Ковалев А.Е., Яковенко А.А., Векшин Н.Л. (2004) Био
физика, 49, 1030–1037.
24. Татаркова С.А., Ллойд К., Хайра С.К., Берк Д. (2003)
Квант. электроника, 33, 357–362.
25. Векшин Н.Л. (2006) Флуоресцентная спектроскопия
биополимеров, Фотон!век, Пущино.
26. Перевощикова И.В., Сорочкина А.И., Зоров Д.Б., Ан!
тоненко Ю.Н. (2009) Биохимия, 74, 814–824.
27. Страховская М.Г., Антоненко Ю.Н., Пашковская
А.А., Котова Е.А., Киреев В., Жуховицкий В.Г., Кузне!
цова Н.А., Южакова О.А., Негримовский В.М., Рубин
А.Б. (2009) Биохимия, 74, 1603–1614.
28. Magde, D., Elson, E.L., and Webb, W.W. (1972) Phys. Rev.
Lett., 29, 705–708.
29. Elson, E.L., and Magde, D. (1974) Biopolymers, 13, 1–27.
30. Magde, D., Elson, E.L., and Webb, W.W. (1974)
Biopolymers, 13, 29–61.
31. Magde, D., Webb, W.W., and Elson, E.L. (1978)
Biopolymers, 17, 361–376.
32. Ehrenberg, M., and Rigler, R. (1974) Chem. Phys., 4, 390–401.
33. Ehrenberg, M., and Rigler, R. (1976) Q. Rev. Biophys., 9,
69–81.
34. Aragon, S.R., and Pecora, R. (1975) Biopolymers, 14, 119–138.
БИОХИМИЯ том 76 вып. 5 2011
633
35. Koppel, D.E., Axelrod, D., Schlessinger, J., Elson, E.L.,
and Webb, W.W. (1976) Biophys. J., 16, 1315–1329.
36. Aragon, S.R., and Pecora, R. (1976) J. Chem. Phys., 64,
1791–1803.
37. Webb, W.W. (1976) Q. Rev. Biophys., 9, 49–68.
38. Fahey, P.F., Koppel, D.E., Barak, L.S., Wolf, D.E., Elson,
E.L., and Webb, W.W. (1977) Science, 195, 305–306.
39. Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., and Kask, P. (1993)
Eur. Biophys. J., 22, 169–175.
40. Rigler, R., Pramanik, A., Jonasson, P., Kratz, G., Jansson,
O.T., Nygren, P., Stahl, S., Ekberg, K., Johansson, B.,
Uhlen, S., Uhlen, M., Jornvall, H., and Wahren, J. (1999)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 13318–13323.
41. Denk, W., Strickler, J.H., and Webb, W.W. (1990) Science,
248, 73–76.
42. Schwille, P., Haupts, U., Maiti, S., and Webb, W.W. (1999)
Biophys. J., 77, 2251–2265.
43. Koppel, D. E. (1974) Phys. Rev. A, 10, 1938–1945.
44. Kask, P., Gunther, R., and Axhausen, P. (1997) Eur.
Biophys. J., 25, 163–169.
45. Qian, H. (1990) Biophys. Chem., 38, 49–57.
46. Meseth, U., Wohland, T., Rigler, R., and Vogel, H. (1999)
Biophys. J., 76, 1619–1631.
47. Kask, P., Palo, K., Ullmann, D., and Gall, K. (1999) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 96, 13756–13761.
48. Chen, Y., Muller, J.D., So, P.T., and Gratton, E. (1999)
Biophys. J., 77, 553–567.
49. Chen, Y., Muller, J.D., Tetin, S.Y., Tyner, J.D., and
Gratton, E. (2000) Biophys. J., 79, 1074–1084.
50. Enderlein, J., Gregor, I., Patra, D., Dertinger, T., and
Kaupp, U.B. (2005) Chemphyschem., 6, 2324–2336.
51. Ruettinger, S., Buschmann, V., Kramer, B., Erdmann, R.,
Macdonald, R., and Koberling, F. (2007) Proc. SPIE,
6630, 66300D.
52. Sachl, R., Mikhalyov, I., Hof, M., and Johansson, L.B.
(2009) Phys. Chem. Chem. Phys., 11, 4335–4343.
53. Petrasek, Z., and Schwille, P. (2008) Biophys. J., 94,
1437–1448.
54. Gendron, P.O., Avaltroni, F., and Wilkinson, K.J. (2008) J.
Fluoresc., 18, 1093–1101.
55. Gosch, M., Blom, H., Holm, J., Heino, T., and Rigler, R.
(2000) Anal. Chem., 72, 3260–3265.
56. Muller, J.D., Chen, Y., and Gratton, E. (2000) Biophys. J.,
78, 474–486.
57. Qian, H., and Elson, E.L. (1990) Biophys. J., 57, 375–380.
58. Eid, J.S., Muller, J.D., and Gratton, E. (2000) Rev. Sci.
Instrum., 71, 361–368.
59. Chen, Y., Muller, J.D., Ruan, Q., and Gratton, E. (2002)
Biophys. J., 82, 133–144.
60. Chen, Y., Wei, L.N., and Muller, J.D. (2003) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 100, 15492–15497.
61. Egea, P.F., Rochel, N., Birck, C., Vachette, P., Timmins,
P.A., and Moras, D. (2001) J. Mol. Biol., 307, 557–576.
62. Yu, L., Tan, M., Ho, B., Ding, J.L., and Wohland, T.
(2006) Anal. Chim. Acta, 556, 216–225.
63. Tjernberg, L.O., Pramanik, A., Bjorling, S., Thyberg, P.,
Thyberg, J., Nordstedt, C., Berndt, K.D., Terenius, L.,
and Rigler, R. (1999) Chem. Biol., 6, 53–62.
64. Sengupta, P., Garai, K., Sahoo, B., Shi, Y., Callaway, D.J.,
and Maiti, S. (2003) Biochemistry, 42, 10506–10513.
65. Garai, K., Sureka, R., and Maiti, S. (2007) Biophys. J., 92,
L55–L57.
66. Gerard, M., Debyser, Z., Desender, L., Kahle, P.J., Baert,
J., Baekelandt, V., and Engelborghs, Y. (2006) FASEB J.,
20, 524–526.
67. Conway, K.A., Harper, J.D., and Lansbury, P.T. (1998) Nat.
Med., 4, 1318–1320.
634 ПЕРЕВОЩИКОВА и др.
68. Sevenich, F.W., Langowski, J., Weiss, V., and Rippe, K.
(1998) Nucl. Acids Res., 26, 1373–1381.
69. Lagerkvist, A.C., Foldes!Papp, Z., Persson, M.A., and
Rigler, R. (2001) Protein Sci., 10, 1522–1528.
70. Tetin, S.Y., Swift, K.M., and Matayoshi, E.D. (2002) Anal.
Biochem., 307, 84–91.
71. Varriale, A., Staiano, M., Iozzino, L., Severino, L.,
Anastasio, A., Cortesi, M.L., and D’Auria, S. (2009)
Protein Pept. Lett., 16, 1425–1428.
72. Kinjo, M., and Rigler, R. (1995) Nucl. Acids Res., 23,
1795–1799.
73. Schwille, P., Oehlenschlager, F., and Walter, N.G. (1996)
Biochemistry, 35, 10182–10193.
74. Rusu, L., Gambhir, A., McLaughlin, S., and Radler, J.
(2004) Biophys. J., 87, 1044–1053.
75. Yu, L., Ding, J.L., Ho, B., and Wohland, T. (2005)
Biochim. Biophys. Acta, 1716, 29–39.
76. Posokhov, Y.O., Rodnin, M.V., Lu, L., and Ladokhin, A.S.
(2008) Biochemistry, 47, 5078–5087.
77. Antonenko, Y.N., Perevoshchikova, I.V., Davydova, L.I.,
Agapov, I.A., and Bogush, V.G. (2010) Biochim. Biophys.
Acta, 1798, 1172–1178.
78. Clamme, J.P., Azoulay, J., and Mely, Y. (2003) Biophys. J.,
84, 1960–1968.
79. Pramanik, A., Thyberg, P., and Rigler, R. (2000) Chem.
Phys. Lipids, 104, 35–47.
80. Takakuwa, Y., Pack, C.G., An, X.L., Manno, S., Ito, E.,
and Kinjo, M. (1999) Biophys. Chem., 82, 149–155.
81. Rhoades, E., Ramlall, T.F., Webb, W.W., and Eliezer, D.
(2006) Biophys. J., 90, 4692–4700.
82. Красновский А.А. (2004) Биофизика, 49, 305–321.
83. Valenzeno, D.P. (1987) Photochem. Photobiol., 46, 147–160.
84. Pashkovskaya, A.A., Maizlish, V.E., Shaposhnikov, G.P.,
Kotova, E.A., and Antonenko, Y.N. (2008) Biochim.
Biophys. Acta, 1778, 541–548.
85. Пашковская A.A., Перевощикова И.В., Майзлиш
В.Е., Шапошников Г.П., Котова E.A., Антоненко
Ю.Н. (2009) Биохимия, 74, 1252–1259.
86. Allen, N.W., and Thompson, N.L. (2006) Cytometry A, 69,
524–532.
87. van den Bogaart, G., Hermans, N., Krasnikov, V., de Vries,
A.H., and Poolman, B. (2007) Biophys. J., 92, 1598–1605.
88. Ramadurai, S., Holt, A., Krasnikov, V., van den Bogaart,
G., Killian, J.A., and Poolman, B. (2009) J. Am. Chem.
Soc., 131, 12650–12656.
89. Schwille, P., Korlach, J., and Webb, W.W. (1999)
Cytometry, 36, 176–182.
90. Korlach, J., Schwille, P., Webb, W.W., and Feigenson,
G.W. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 8461–8466.
91. Wawrezinieck, L., Rigneault, H., Marguet, D., and Lenne,
P.F. (2005) Biophys. J., 89, 4029–4042.
92. Humpolickova, J., Gielen, E., Benda, A., Fagulova, V.,
Vercammen, J., Vandeven, M., Hof, M., Ameloot, M., and
Engelborghs, Y. (2006) Biophys. J., 91, L23–L25.
93. Wenger, J., Conchonaud, F., Dintinger, J., Wawrezinieck,
L., Ebbesen, T.W., Rigneault, H., Marguet, D., and Lenne,
P.F. (2007) Biophys. J., 92, 913–919.
94. Chiantia, S., Ries, J., and Schwille, P. (2009) Biochim.
Biophys. Acta, 1788, 225–233.
95. Przybylo, M., Sykora, J., Humpolickova, J., Benda, A.,
Zan, A., and Hof, M. (2006) Langmuir, 22, 9096–9099.
96. Machan, R., and Hof, M. (2010) Int. J. Mol. Sci., 11,
427–457.
97. Politz, J.C., Browne, E.S., Wolf, D.E., and Pederson, T.
(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 6043–6048.
98. Ries, J., Yu, S.R., Burkhardt, M., Brand, M., and
Schwille, P. (2009) Nat. Methods, 6, 643–645.
99. Oehlenschlager, F., Schwille, P., and Eigen, M. (1996)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 12811–12816.
100. Walter, N.G., Schwille, P., and Eigen, M. (1996) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 93, 12805–12810.
101. Schwille, P., Meyer!Almes, F.J., and Rigler, R. (1997)
Biophys. J., 72, 1878–1886.
102. Haupts, U., Maiti, S., Schwille, P., and Webb, W.W.
(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 13573–13578.
103. Persson, G., Thyberg, P., and Widengren, J. (2008)
Biophys. J., 94, 977–985.
104. Sanden, T., Salomonsson, L., Brzezinski, P., and Widengren,
J. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107, 4129–4134.
105. Magzoub, M., Padmawar, P., Dix, J.A., and Verkman,
A.S. (2006) J. Phys. Chem. B, 110, 21216–21221.
106. Al Soufi, W., Reija, B., Novo, M., Felekyan, S.,
Kuhnemuth, R., and Seidel, C.A. (2005) J. Am. Chem.
Soc., 127, 8775–8784.
107. Bonnet, G., Krichevsky, O., and Libchaber, A. (1998)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 8602–8606.
108. Kim, H.D., Nienhaus, G.U., Ha, T., Orr, J. W., Williamson,
J.R., and Chu, S. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99,
4284–4289.
109. Shusterman, R., Gavrinyov, T., and Krichevsky, O. (2008)
Phys. Rev. Lett., 100, 98–102.
110. Chattopadhyay, K., Saffarian, S., Elson, E.L., and Frieden,
C. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 14171–14176.
111. Neuweiler, H., Johnson, C.M., and Fersht, A.R. (2009)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 18569–18574.
112. Dittrich, P.S., and Schwille, P. (2002) Anal. Chem., 74,
4472–4479.
113. Kuricheti, K.K., Buschmann, V., and Weston, K.D.
(2004) Appl. Spectrosc., 58, 1180–1186.
114. Brister, P.C., Kuricheti, K.K., Buschmann, V., and
Weston, K.D. (2005) Lab. Chip., 5, 785–791.
115. Edel, J.B., and de Mello, A.J. (2003) Anal. Sci., 19,
1065–1069.
116. Okagbare, P.I., and Soper, S.A. (2009) Analyst., 134,
97–106.
117. Park, H.Y., Qiu, X., Rhoades, E., Korlach, J., Kwok,
L.W., Zipfel, W.R., Webb, W.W., and Pollack, L. (2006)
Anal. Chem., 78, 4465–4473.
118. Van Orden, A., and Keller, R.A. (1998) Anal. Chem., 70,
4463–4471.
119. LeCaptain, D.J., and Van Orden, A. (2002) Anal. Chem.,
74, 1171–1176.
120. Bayer, J., and Radler, J.O. (2006) Electrophoresis, 27,
3952–3963.
121. Fogarty, K., and Van Orden, A. (2009) Methods, 47,
151–158.
122. Pan, X., Yu, H., Shi, X., Korzh, V., and Wohland, T.
(2007) J. Biomed. Opt., 12, 14–34.
123. Malone, M.H., Sciaky, N., Stalheim, L., Hahn, K.M.,
Linney, E., and Johnson, G.L. (2007) BMC Biotechnol., 7,
40.
124. Van Craenenbroeck, E., Matthys, G., Beirlant, J., and
Engelborghs, Y. (1999) J. Fluoresc., 9, 325–331.
125. Van Craenenbroeck, E., and Engelborghs, Y. (2000) J.
Mol. Recognit., 13, 93–100.
126. Van Rompaey, E., Sanders, N., De Smedt, S.C.,
Demeester, J., Van Craenenbroeck, E., and Engelborghs,
Y. (2000) Macromolecules, 33, 8280–8288.
127. Van Rompaey, E., Engelborghs, Y., Sanders, N., De
Smedt, S.C., and Demeester, J. (2001) Pharm. Res., 18,
928–936.
128. van den Bogaart, G., Mika, J.T., Krasnikov, V., and
Poolman, B. (2007) Biophys. J., 93, 154–163.
129. van den Bogaart, G., Kusters, I., Velasquez, J., Mika, J.T.,
Krasnikov, V., Driessen, A.J., and Poolman, B. (2008)
Methods, 46, 123–130.
130. van den Bogaart, G., Guzman, J.V., Mika, J.T., and
Poolman, B. (2008) J. Biol. Chem., 283, 33854–33857.
БИОХИМИЯ том 76 вып. 5 2011
 ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ КОРРЕЛЯЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ 635

131. Pashkovskaya, A., Kotova, E., Zorlu, Y., Dumoulin, F.,
Ahsen, V., Agapov, I., and Antonenko, Y. (2010)
Langmuir, 26, 5726–5733.
132. Smith, P.B., Dendramis, K.A., and Chiu, D.T. (2010)
Langmuir, 26, 10218–10222.
133. van den Bogaart, G., Krasnikov, V., and Poolman, B.
(2007) Biophys. J., 92, 1233–1240.
134. Kusters, I., van den Bogaart, G., de Wit, J., Krasnikov, V.,
Poolman, B., and Driessen, A. (2010) Methods Mol. Biol.,
619, 131–143.
135. Perevoshchikova, I.V., Zorov, D.B., and Antonenko, Y.N.
(2008) Biochim. Biophys. Acta, 1778, 2182–2190.
136. Perevoshchikova, I.V., Zorov, S.D., Kotova, E.A., Zorov,
D.B., and Antonenko, Y.N. (2010) FEBS Lett., 584,
2397–2402.
137. Meyer, T., and Schindler, H. (1988) Biophys. J., 54,
983–993.
138. Berland, K.M., So, P.T., Chen, Y., Mantulin, W.W., and
Gratton, E. (1996) Biophys. J., 71, 410–420.
139. Levi, V., Ruan, Q., Kis!Petikova, K., and Gratton, E.
(2003) Biochem. Soc. Trans., 31, 997–1000.
140. Lu, H.P. (2005) Acc. Chem. Res., 38, 557–565.
141. Novoderezhkin, V.I., Rutkauskas, D., and van Grondelle,
R. (2006) Biophys. J., 90, 2890–2902.
142. Osad’ko, I.S. (2006) Phys.Usp., 49, 19–51.
143. Mukhopadhyay, S., and Deniz, A.A. (2007) J. Fluoresc.,
17, 775–783.
144. Hilario, J., and Kowalczykowski, S.C. (2010) Curr. Opin.
Chem. Biol., 14, 15–22.

FLUORESCENCE CORRELATION
SPECTROSCOPY IN BIOLOGY, CHEMISTRY,
AND MEDICINE
I. V. Perevoshchikova1,2, E. A. Kotova1,
Y. N. Antonenko1*
1
A. N. Belozersky Institute of PhysicoChemical Biology,
M. V. Lomonosov Moscow State University, Moscow 119991,
Russia; fax: (495)9393181, Email: antonen@genebee.msu.ru
2
Department of Biomedical Sciences, University of
Veterinary Medicine, Vienna, Austria
Received October 15, 2010
Revision received November 24, 2010

The review describes the method of fluorescence correlation spectroscopy (FCS) and its applications. This experi!
mental approach is based on recording fluorescence fluctuations arising from the Brownian motion of fluorescent par!
ticles in a small confocal detection volume. Being responsive to changes in mobility of fluorescent particles, FCS is
used to study a variety of processes associated with alteration of particle size, e.g., binding of ligands to membrane
vesicles or supercomplexes, aggregation of macromolecules, etc. The size of fluorescent particles detectable by FCS
ranges from a few angstroms (dimensions of single dye molecules) to hundreds of nanometers (dimensions of
nanoparticles). Applications of FCS comprise diverse processes beginning from solution/micelles interconversion up
to sophisticated regulations in living cells. The present review concentrates preferentially on FCS use in studying arti!
ficial and natural membranes. In contrast to a closely related method of dynamic light scattering, at present FCS is
poorly known in Russia, though widely employed in foreign laboratories. The goal of this review is to promote
development of FCS in Russia so that this technique could occupy the position it deserves in modern Russian science.
Key words: fluorescence fluctuations, correlation spectroscopy, diffusion, aggregation, binding, nanoparticles,
biopolymer, vesicle, ligand, receptor, conformational change, nucleic acid and protein folding

БИОХИМИЯ том 76 вып. 5 2011