Вы находитесь на странице: 1из 5

ХИМИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ. 2011. №3. С. 117–121.

УДК 615.322:543.872
НОВЫЙ ПОДХОД В ОЦЕНКЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ
РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ ПРОЦЕССА
АУТООКИСЛЕНИЯ АДРЕНАЛИНА

© Е.И. Рябинина*, Е.Е. Зотова, Е.Н. Ветрова, Н.И. Пономарева, Т.Н. Илюшина

Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко,


ул. Студенческая, 10, Воронеж, 394036 (Россия), e-mail: ryabinina68@mail.ru
Определена антиоксидантная активность водных извлечений шести распространенных лекарственных трав по ин-
гибированию реакции аутоокисления адреналина. Предложен новый временной критерий в оценке антиоксидантной
активности. Доказано, что период индукции можно считать величиной, определяющей антиоксидантную активность
растительных экстрактов в анализе ингибирования реакции аутоокисления адреналина.
Ключевые слова: растительное сырье, антиоксидантная активность, аутоокисление адреналина.

Введение
Вопросы кислородного метаболизма в организме человека являются объектами постоянного внима-
ния медиков, химиков и биохимиков. При нарушении баланса между биохимическими механизмами окси-
геназной утилизации кислорода, механизмами защиты от вредных воздействий его высокореакционных
метаболитов возникает окислительный стресс. Фармакологическая коррекция окислительного стресса
осуществляется с помощью биологически активных веществ (БАВ), в частности антиоксидантов. Они пре-
рывают быстрорастущие процессы окисления, образуя малоактивные радикалы, легко выводящиеся из
организма. Одной из самых перспективных групп БАВ, обладающей антиоксидантной активностью, яв-
ляются растительные фенольные соединения, среди которых ведущее место занимают полифенолы [1, 2].
Поэтому одним из важных показателей качества растительного сырья является их антиоксидантная актив-
ность. С целью выявления состояния антиоксидантной защиты организма в условиях патологического
процесса исследуется активность супероксидисмутазы (СОД; КФ 1.15.1.1), важнейшего фермента этой
системы, катализирующего превращение высокореакционного супероксид аниона в относительно менее
активную перекись водорода и молекулярный кислород. Один из широко используемых подходов для оп-
ределения активности СОД основан на способности фермента ингибировать супероксидрадикалы в реак-
ции аутоокисления адреналина в щелочной среде [3]. На основе этого подхода разработан метод измерения
антиоксидантной активности различных видов лекарственного растительного сырья и препаратов на их
основе. Антиоксидантная активность не может измеряться напрямую, обычно измеряют влияние антиок-
сидантов на степень окисления, которая является функцией многих параметров, в частности времени.
Предложенный в [3] метод, как правило, из-за разного выбранного времени ингибирования аутоокисления
адреналина, выдает противоречивые данные, т.е. не коррелирующие между собой.
Цель данной работы – разработка универсального критерия в оценке антиоксидантной активности
при исследовании процесса аутоокисления адреналина.

Экспериментальная часть
В качестве объекта исследования использовали готовое сырье надземной части шести видов лекар-
ственных растений: мяты перечной (Mentha piperita L.), череды (Satureja hortensis L.), шалфея (Salvia
officinalis L.), зверобоя (Hypericum perforatum L.), мелиссы (Melissa officinalis L.), тысячелистника (Achillea
millefolium L.), выпускаемых ЗАО фирма «Здоровье» и приобретенных в аптечной сети.

*
Автор, с которым следует вести переписку.
118 Е.И. РЯБИНИНА, Е.Е. ЗОТОВА, Е.Н. ВЕТРОВА, Н.И. ПОНОМАРЕВА, Т.Н. ИЛЮШИНА

Водное извлечение готовилось путем нагревания около 1,5 г сырья, измеренного на аналитических
весах марки CAS CAUY, имеющих I (специальный) класс точности по ГОСТ 24104-2001 и дискретность
0,1 мг, со 100 мл воды на водяной бане с обратным холодильником в течение 20 мин.
В полученных экстрактах потенциометрическим методом определяли содержание дубильных ве-
ществ [4]. Количественное содержание флавоноидов определяли спектрофотометрически [5], а аскорбино-
вой кислоты – титриметрическим методом [6]. Погрешность измерения не превышала 5%, доверительный
интервал вычисляли по стандартной процедуре с использованием коэффициента Стьюдента (доверитель-
ная вероятность составляет 0,95).
Об антиоксидантной активности исследуемого растительного сырья судили по их способности ин-
гибировать аутоокисление адреналина in vitro и тем самым предотвращать образование активных форм
кислорода [3]. Для этого к 4 мл 0,2 М натрий-карбонатного буфера, рН = 10,65 (устанавливаемое добавле-
нием к 0,2 М раствору Na2CO3 сухого реактива NaHCO3), добавляли 0,2 мл 0,1% (5,46 мМ) аптечного рас-
твора адреналина гидрохлорида, тщательно и быстро перемешивали, помещали в спектрофотометр СФ-46
и определяли оптическую плотность через 30 сек в течение 10 мин при длине волны 347 нм в кювете тол-
щиной 10 мм на спектрофотометре СФ-46 (D1). Далее к 4 мл буфера (рН=10,65) добавляли 0,06 мл иссле-
дуемого экстракта и 0,2 мл 0,1% адреналина гидрохлорида, перемешивали и измеряли оптическую плот-
ность, как описано выше (D2). Для учета влияния собственной окраски экстрактов, которые поглощают
определенную длину волны в видимой части спектра, в качестве контрольной пробы использовали буфе-
рированный раствор экстракта, без адреналина. Антиоксидантную активность (АА) исследуемых препара-
тов выражали в процентах ингибирования аутоокисления адреналина и вычисляли по формуле:

( D1  D2 )  100
AA  , %.
D1

Величина АА более 10% свидетельствует о наличии антиоксидантной активности.

Обсуждение результатов
Результаты количественного определения содержания биологически активных веществ в исследуе-
мых образцах лекарственных растений [4–6] представлены в таблице 1. Полученные данные показывают,
что содержание биологически активных веществ в растениях варьируется в широких пределах. Так, массо-
вая доля дубильных веществ в растительном сырье колеблется в довольно значительных пределах
от ~1,2% у Mentha piperita L. до ~10% у Hypericum perforatum L.
Сумма флавоноидов в образцах изученных растений варьируется от 1,120 до 4,315%. Наибольшее
содержание флавоноидов определили в Hypericum perforatum L. и Salvia officinalis L. Наименьшее содер-
жание этой группы веществ установили в Satureja hortensis L.
Количество аскорбиновой кислоты в сырье изученных растений изменяется от 0,067 до 0,283%. Наи-
меньшее содержание аскорбиновой кислоты – в Satureja hortensis L., а наибольшее – в Mentha piperita L.
Поскольку реальные объекты представляют собой довольно сложные по химическому составу сис-
темы, то проблемой практического использования антиоксидантов растительного происхождения является
количественная оценка их антиоксидантной активности, которая реализуется за счет суммарного содержа-
ния и действия восстановителей различной природы. Кроме того, при оценке антиоксидантной способно-
сти необходимо учитывать не только природу и содержание восстановителей в исследуемом объекте, но
и возможность их взаимного влияния (например синергизм или антагонизм).

Таблица 1. Состав водных извлечений исследуемого растительного сырья


Исследуемое Содержание, %
растительное сырье дубильных веществ флавоноидов аскорбиновой кислоты
Mentha piperita L. … 2,205±0,039 0,283±0,006
Satureja hortensis L. 4,4600±0,0130 1,120±0,019 0,067±0,003
Salvia officinalis L. 5,7680±0,0132 2,787±0,029 0,078±0,013
Hypericum perforatum L. 10,5580±0,0412 4,315±0,013 0,189±0,011
Melissa officinalis L. 4,5115±0,0030 2,060±0,053 0,245±0,007
Achillea millefolium L. 2,8400±0,0180 1,940±0,013 0,098±0,006
НОВЫЙ ПОДХОД В ОЦЕНКЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ … 119

В данной работе нами использован метод оценки антиокислительной активности антиоксидантов на


начальных этапах свободнорадикального окисления по ингибированию супероксидрадикала в реакции ау-
тоокисления адреналина в щелочной среде при длине волны 347 нм [3].
На рисунке 1 представлена динамика реакции аутоокисления адреналина, имеющая сигмоидный ха-
рактер. Форма начального участка кривой указывает на существование индукционного периода реакции.
Введение в реакционную смесь растительных экстрактов, различающихся концентрацией БАВ, не оказывает
влияние на форму кривой. Ингибирующее действие рассматриваемых экстрактов проявляется в уменьшении
значения оптической плотности (по сравнению с контрольной пробой) и во влиянии на индукционный пери-
од, продолжительность которого различна в зависимости от используемого растительного сырья.
Антиоксидантная активность (АА) рассчитывается как относительная величина и определяется соот-
ношением экстинкций при определенном времени протекания реакции, т.е. времени экспозиции. Для оценки
влияния растительных экстрактов на процесс
аутоокисления адреналина было выбрано
разное время экспозиции: 3, 5 и 10 мин. . Антиоксидантная активность (АА) растительных
Предпочтение данному временному интер- экстрактов в зависимости от времени экспозиции
валу обусловлено наиболее высокой интен- Исследуемое АА, %
сивностью образования продукта окисления растительное сырье 3 мин 5 мин 10 мин tинд
Mentha piperita L. 50,0 34,15 21,67 48,65
адреналина в данный промежуток времени и
Satureja hortensis L. 71,09 59,15 46,0 65,21
рекомендациями исследователей [3, 7]. Рас- Salvia officinalis L. 88,28 84,86 60,2 85,88
чет антиоксидантной активности (АА) пока- Hypericum perforatum L. 92,96 92,19 65,3 92,95
зал, что все исследуемые растительные экс- Melissa officinalis L. 78,13 70,07 57,7 75,55
тракты проявляют высокую антиоксидант- Achillea millefolium L. 57,81 48,94 38,8 58,65
ную активность (табл. 2).

Рис. 1. Зависимость оптической


плотности (D347) от времени реакции
аутоокисления адреналина (t) в
отсутствие и в присутствии экстрактов
растений
В водных извлечениях АА уменьшается в ряду: Hypericum perforatum L. > Salvia officinalis L. >
Melissa officinalis L.> Satureja hortensis L. > Achillea millefolium L. > Mentha piperita L., что хорошо согласу-
ется с данными определения антиоксидантной активности амперометрическим методом [8]. Анализируя
полученные данные, можно отметить, что прослеживается корреляция между показателем АА образцов
лекарственных растений и суммарным содержанием в них всех биологически активных веществ (БАВ):
дубильных веществ, флавоноидов и аскорбиновой кислоты (рис. 2). Наилучший результат аппроксимации
экспериментальных данных был получен с использованием полиноминальной зависимости при времени
120 Е.И. РЯБИНИНА, Е.Е. ЗОТОВА, Е.Н. ВЕТРОВА, Н.И. ПОНОМАРЕВА, Т.Н. ИЛЮШИНА

экспозиции, равном 5 мин. Наблюдающееся отклонение от линейной зависимости, при достижении опре-
деленной концентрации (~7–8%) биологически активных веществ, связано со сменой антиоксидантного
действия прооксидантным [9]. Однако следует отметить, что, наряду с положительными моментами, дан-
ный метод имеет и недостатки. Результаты, полученные в разное время экспозиции, сильно разнятся меж-
ду собой (табл. 2) и не могут отвечать критерию оценки качества растительного сырья. Поэтому мы пред-
лагаем ввести новый временной параметр – период индукции, который имеется на всех кривых аутоокис-
ления адреналина в присутствии растительных экстрактов (рис. 1) и увеличивается с ростом процента БАВ
в экстрактах. Скорее всего, именно в это время БАВ и проявляют свое антиоксидантное действие. При ис-
тощении раствора (уменьшении концентрации БАВ) лимитирующей становится реакция окисления адре-
налина, и на кривой наблюдается второй, более вертикальный участок. Для определения индукционного
периода (tинд, мин) рассчитывали точку пересечения прямых линий – горизонтальной, характеризующей
длительность индукционного периода, и наклонной, характеризующей протекание самой реакции (рис. 1).
Для расчета антиоксидантной активности (АА) сначала определяли показатель экстинкции (D2), отражаю-
щий скорость ингибирования аутоокисления адреналина в присутствии исследуемых экстрактов при tинд,
а затем показатель экстинкции (D1), ответственный за аутоокисление адреналина в данный момент време-
ни. Если перестроить график (рис. 2) в координатах АА, рассчитанной по оптической плотности растворов
в момент времени, равный tинд от суммарного содержания биологически активных веществ (БАВ, %)
(рис. 3), и считать, что зависимость имеет тот же полиноминальный характер, то наблюдается возрастание
коэффициента корреляции (R2 = 0,9984). Таким образом, за временной критерий в данном методе необхо-
димо принимать время периода индукции, которое для каждого экстракта индивидуально, а не нормиро-
ванную разницу оптических плотностей для каких-то определенных временных интервалов.

Рис. 2. Зависимость антиоксидантной активности Рис. 3. Зависимость антиоксидантной активности


(АА) от содержания биологически активных (АА), рассчитанной по оптической плотности
веществ (БАВ,%) в растительных экстрактах для растворов на момент времени, равный периоду
трех интервалов времени реакции аутоокисления индукции реакции адреналина экстрактами, от
адреналина в присутствии экстрактов содержания в них БАВ

Выводы
1. Исследован состав водных извлечений шести распространенных лекарственных трав, и определе-
на антиоксидантная активность растительных экстрактов по ингибированию реакции аутоокисления адре-
налина. Установлено, что все исследуемые лекарственные растения в той или иной степени обладают дос-
таточно высокой антиоксидантной активностью.
НОВЫЙ ПОДХОД В ОЦЕНКЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ … 121

2. Выявлена корреляционная связь между суммарным содержанием биологически активных веществ


в растительном сырье и антиоксидантной активностью. При достижении определенной концентрации (~7–8%)
биологически активных веществ их антиоксидантное действие сменяется прооксидантным.
3. Предложен новый временной критерий оценки антиоксидантной активности растительных экс-
трактов в анализе ингибирования реакции аутоокисления адреналина. Доказано, что период индукции
можно считать величиной, определяющей антиоксидантную активность экстрактов.

Список литературы
1. Прида А.И., Иванова Р.И. Природные антиоксиданты полифенольной природы (антирадикальные свойства
и перспективы использования) // Пищевые ингридиенты. Сырье и добавки. 2004. №2. С. 76–78.
2. Рыжикова М.А., Фархутдинова Р.Р., Сибиряк С.В., Загудиллин Ш.З. Влияние водных извлечений из лекарст-
венных растений на процессы свободно-радикального окисления // Экспериментальная и клиническая фарма-
кология. 1999. Т. 62, №2. С. 36–38.
3. Патент №2144674 (Россия). Способ определения антиоксидантной активности супероксидисмутазы и хими-
ческих соединений / Т.В. Сирота / 20.01.2000.
4. Рябинина Е.И., Зотова Е.Е., Пономарева Н.И., Рябинин С.В. Сравнительное исследование мелиссы лекарст-
венной и шалфея лекарственного на содержание полифенолов // Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология.
Фармация. 2009. №2. С. 32–36.
5. Малахова А.И., Федоровский Н.Н. Исследование состава травы мелиссы лекарственной и ее водного извлечения
// Науки о человеке : материалы VIII конгресса молодых ученых и специалистов. Томск, 2007. С. 230–231.
6. Государственная фармакопея СССР. XI изд. М., 1990. Вып. 2. 397 с.
7. Хасанова С.Р., Плеханова Т.И., Гашимова Д.Т., Галиахметова Э.Х., Клыш Е.А. Сравнительное изучение ан-
тиоксидантной активности растительных сборов // Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. 2007.
№1. С. 163–166.
8. Мисин В.М., Сажина Н.Н., Завьялов А.Ю., Яшин Я.И. Измерение содержания фенолов в экстрактах лекарст-
венных трав и их смесях амперометрическим методом // Химия растительного сырья. 2009. №4. С. 127–132.
9. Gutteridge V., Westermarck T., Halliwell B. Oxygen damage in biological systems / Free radical, Aging and Degen-
erative Disease. Ed. By Yohson Y. New York, 1986.
Поступило в редакцию 8 сентября 2010 г.

После переработки 16 декабря 2010 г.