Вы находитесь на странице: 1из 11

ФАРМАКОМ 3-2017

Стандартизація лікарських засобів


і валідація методик контролю якості
УДК 543.544.5.068.7+543.8+615.07

Андрющенко Т. Л., Верушкин А. Г., Куликов А. Ю., Верушкина О. С.


Государственное предприятие «Украинский научный фармакопейный центр качества
лекарственных средств»
Санитарно-гигиенический отдел воинской части А4510, г. Харьков

Разработка и валидация методики количественного определения


аллантоина в препарате «Йодиксол» методом обращенно-фазовой ВЭЖХ
Разработана экономичная методика для количественной оценки содержания аллантоина в препарате «Йодиксол» с
использованием метода обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Отделение
аллантоина от других действующих и вспомогательных компонентов проводили на С18-сорбентах с внедренными
полярными группами типа Symmetry Shield, Supelcosil LC-ABZ с использованием фосфатного буферного раствора
рН 3.0 в качестве подвижной фазы. Для разработанной методики проведена процедура валидации в соответствии
с требованиями Государственной Фармакопеи Украины. Показано, что методика по валидируемым параметрам
(специфичность, линейность, диапазон применения, правильность, прецизионность, робастность) удовлетворяет
рассчитанным критериям и может быть рекомендована фармпедприятиям для количественного определения
аллантоина в препарате «Йодиксол» или его аналоге.
Ключевые слова: аллантоин, «Йодиксол», обращенно-фазовая ВЭЖХ, валидация.

Аллантоин (2,5-диоксо-4-имидазолидинил- Количественное определение аллантоина


мочевина) — гетероциклическое органиче- как в косметических средствах, так и в фарма-
ское соединение, производное пурина (Рис. 1). цевтических препаратах проводят хроматогра-
Основные химические свойства аллантоина за- фическими методами, в основном используя
ключаются в вяжущем и противовоспалитель- высокоэффективную жидкостную хромато-
ном эффекте; он также широко используется графию (ВЭЖХ); хотя в литературе описаны и
для заживления поврежденных тканей — по- спектрофотометрические методики, и методи-
сле его нанесения на кожу происходит быстрая ки кислотно-основного титрования [6].
регенерация клеток за счет их пролиферации. Можно выделить 3 основных хроматогра-
Это обусловило применение аллантоина в кос- фических метода для определения аллантоина:
метических средствах (смягчение и увлажнение ВЭЖХ на нормально-фазовых сорбентах (си-
кожи, ранозаживляющее действие), а также в ликагель с привитыми аминными группами),
клинической практике для лечения медленно HILIC-хроматография (хроматография гидро-
заживающих ран, ожогов и повреждений ко- фобных взаимодействий) и обращенно-фазовая
жи [1-3]. Согласно требованиям документации хроматография (ОФ-ВЭЖХ) с использованием
FDA (Управление по санитарному надзору за предколоночной дериватизации.
качеством пищевых продуктов и медикаментов Наиболее распространенным является метод
— агентство Министерства здравоохранения и ВЭЖХ на аминофазах [7-9]. При всех преиму-
социальных служб США) [4, 5] допустимое со- ществах данной методики, она обладает двумя
держание аллантоина в препаратах составляет существенными недостатками: большой расход
от 0.1 % до 2.0 %. органического растворителя (ацетонитрила) и
малый срок службы хроматографической ко-
Рисунок 1 лонки при анализе аллантоин-содержащих пре-
паратов — привитые аминогруппы образуют
H O основания Шиффа, вследствие чего сорбент
N теряет свои химические и хроматографиче-
H
ские свойства (Рис. 2).
N H
Хроматография гидрофобных взаимодей-
O ствий в настоящее время широко рекламиру-
N
N ется и продвигается разработчиками HILIC-
H сорбентов для применения в том числе и в фар-
H O мацевтическом анализе. Опубликован ряд ра-
Структурная формула аллантоина бот [10-13], в которых описано использование

7
3-2017 ФАРМАКОМ
HILIC-сорбентов для количественного опреде- тивном документе (АНД) на препарат «Йодик-
ления аллантоина в косметических средствах. сол» количественное определение аллантоина
К сожалению, использование подвижных фаз проводят методом ВЭЖХ с использованием
с большим содержанием органического моди- хроматографического сорбента с привиты-
фикатора (70-90 %) делает данный метод доро- ми аминогруппами. Такая методика оказалась
гостоящим при его использовании в рутинном не вполне приемлемой для поточного анализа
анализе. (Рис. 2), так как при длительном использовании
Высокая гидрофильность аллантоина колонки начинает изменяться форма хромато-
(ClogP = –2.34) затрудняет использование графического пика, что отрицательно влияет на
обращенно-фазовой ВЭЖХ для его количествен- количественную оценку содержания алланто-
ного определения. Поэтому для его определения ина в препарате и в конечном итоге делает ее
либо используют производные аллантоина, на- невозможной.
пример, с 2,4-динитрофенилгидразоном [14, 15], Поэтому целью данной работы была разра-
либо применяют введение в состав подвижной ботка и валидация хроматографической мето-
фазы ион-парных реагентов для увеличения его дики для количественной оценки содержания
удерживания [16, 17]. аллантоина в препарате «Йодиксол», которая
Использование хроматографических методов позволяла бы проводить длительный поточный
для количественного определения аллантоина хроматографический анализ готового лекар-
в готовых лекарственных средствах дает воз- ственного средства.
можность его быстрого (экспрессность) и точ- Экспериментальная часть
ного определения с минимальными затратами
(экономичность) и минимальным влиянием Реактивы и растворы
других компонентов лекарственного средства Субстанция аллантоина с содержанием
[18]. В утвержденном аналитическом норма- основного вещества 99.9 % была предоставлена

Рисунок 2

ВЭЖХ-хроматограммы определения аллантоина в препарате «Йодиксол» на новой колонке


(аминофаза) (А) и после 3 месяцев поточных анализов препарата (Б)

8
ФАРМАКОМ 3-2017
ООО «Микрофарм» и использовалась в каче- вместимостью 100 мл и получали 60 г раствора
стве стандартного образца аллантоина. Лития плацебо «Йодиксола». Раствор плацебо храни-
дигидрофосфат, этанол 96 %, пропиленгликоль, ли в плотно укупоренной таре в защищенном
фосфат натрия додекагидрат, кислота лимон- от света месте при температуре около 10 °С и
ная безводная, кислота фосфорная концен- использовали в течение 7 сут.
трированная — производства Sigma-Aldrich. Модельную смесь препарата готовили следу-
Субстанция повидон-йод с содержанием йо- ющим образом: в мерную колбу вместимостью
да 11.7 % (производство Ashland, США) также 25 мл помещали 2.0 мл стандартного раствора
была любезно предоставлена ООО «Микро- аллантоина, 1.00 г раствора плацебо «Йодиксо-
фарм». Реактивы и субстанции соответствуют ла», доводили объем раствора подвижной фа-
требованиям Государственной Фармакопеи зой до метки и перемешивали. Раствор исполь-
Украины (ГФУ). зовали свежеприготовленным.
Препарат «Йодиксол» различных серий Испытуемый раствор препарата готовили
производства был предоставлен ООО «Ми- следующим образом: 1.00 г (точная навеска)
крофарм». препарата помещали в мерную колбу вместимо-
стью 25 мл, доводили объем раствора подвиж-
Оборудование
ной фазой до метки и перемешивали. Раствор
Хроматографические измерения были про- использовали свежеприготовленным.
ведены на жидкостном хроматографе Shimadzu
LC-20 (Shimadzu Corp, Duisburg, Germany). Хро- Результаты и обсуждение
матографические колонки: Symmetry Shield RP18 Выбор состава подвижной фазы и
(150 мм × 4.6 мм, 5 мкм, Waters Corp, Milford, хроматографических условий
USA) и Supelcosil LC-ABZ (150 мм × 4.6 мм,
5 мкм, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Высокая гидрофильность аллантоина делает
Germany). Разделение проводили при темпера- затруднительным его количественное опреде-
туре (30.0 ± 0.1) °С; скорость подвижной фазы ление с использованием метода ОФ-ВЭЖХ, так
составляла 1.0 мл/мин; объем вводимой про- как его удерживание на сорбентах с привитыми
бы — 10 мкл; длина волны детектирования — С18-группами достаточно слабое. В настоящее
220 нм. время для анализа соединений высокой гидро-
Значение рН подвижных фаз контролиро- фильности все чаще используют специфические
валось с помощью рН-метра Beckman Ф-200 сорбенты с включенными полярными группами
pH meter (Beckman Instruments, Fullerton, CA, [19] — сорбенты с полярным эндкеппингом или
USA). с внедренными полярными группами. Особен-
Обработку хроматограмм проводили с ис- ность таких сорбентов заключается в том, что
пользованием программы LCSolution (Shimadzu внедренные полярные группы создают вокруг
Corp, Duisburg, Germany). сорбента «электростатический щит», который
в значительной степени меняет селективность
Приготовление растворов С18 сорбентов в сторону увеличения удержи-
Стандартный раствор аллантоина готови- вания гидрофильных соединений.
ли следующим образом: 0.0265 г стандартно- Работа на таких фазах требует использо-
го образца аллантоина помещали в мерную вания подвижных фаз с низким содержанием
колбу вместимостью 50 мл, растворяли в 10 мл органического модификатора или даже вообще
96 % этанола, доводили объем раствора водой без него. Так, адениновые нуклеотиды на та-
до метки и перемешивали. Срок годности рас- ких сорбентах разделяются с использованием
твора при его хранении в темном прохладном фосфатных буферных растворов с различной
месте — 14 сут. величиной рН [19].
Рабочие растворы аллантоина готовили раз- Аллантоин является неким «структурным
бавлением стандартного раствора подвижной аналогом» адениновых нуклеотидов, и поэтому
фазой до получения необходимой концентра- было решено использовать фосфатный буфер-
ции. Растворы использовали свежеприготов- ный раствор в качестве начального приближе-
ленными. ния для удерживания аллантоина и отделения
Раствор плацебо готовили следующим об- его от вспомогательных веществ препарата.
разом: навески повидон-йода, этанола 96 %, Были проведены исследования по влиянию
пропиленгликоля и других вспомогательных катиона (натрий, калий, литий, аммоний) фос-
компонентов (согласно прописи готового ле- фатного буферного раствора и величины его
карственного средства) помещали в емкость рН (от 2.0 до 5.0, с шагом 0.5 единицы рН) на

9
3-2017 ФАРМАКОМ
удерживание и асимметрию пика аллантоина — длина волны детектирования — 220 нм.
и на его способность отделяться от вспомога-
Содержание аллантоина (Х) в 1 г препарата,
тельных вещества препарата «Йодиксол». Было
в миллиграммах, рассчитывают по формуле:
отмечено, что использование фосфата аммо-
ния как компонента буферного раствора зна- Si × m0 × 2 × 25 × P × 1000 Si × m0 × P × 0.4
чительно уменьшает удерживание аллантои- X= = ,
S 0 × 50 × 25 × m × 100 S0 × m
на, сдвигая его к мертвому времени колонки.
Поэтому от использования данного компонен-
где Si — средняя площадь пика аллантоина,
та отказались.
рассчитанная из хроматограмм ис-
Замена других катионов практически не
пытуемого раствора;
оказывает влияния на удерживание и форму
S0 — средняя площадь пика аллантоина,
хроматографического пика, в отличие от рН.
рассчитанная из хроматограмм рас-
Отмечалось, что в кислых средах наблюдается
твора сравнения;
более приемлемое удерживание и асимметрия
m0 — масса навески стандартного образца
пика аллантоина. Поэтому на основании про-
аллантоина, в граммах;
веденных предварительных исследований и с
m — масса навески препарата, в грам-
целью увеличения срока службы колонки бы-
мах;
ло решено использовать в качестве подвижной
P — содержание основного вещества в
фазы буферный раствор на основе фосфата
стандартном образце аллантоина, в
лития с рН 3.0. С выбранной подвижной фазой
процентах.
была разработана методика количественного
определения аллантоина в препарате «Йодик- Содержание аллантоина в 1 г препарата
сол» и проведена ее валидация. должно быть от 0.90 мг до 1.10 мг.
Результаты считаются достоверными, если
Методика количественного определения
выполняются следующие условия:
аллантоина в препарате «Йодиксол»
— коэффициент симметрии пика аллантоина
Испытуемый раствор: около 1.00 г (точная должен быть не более 1.5;
навеска) препарата помещают в мерную колбу — эффективность хроматографической си-
вместимостью 25 мл, доводят объем раствора стемы, рассчитанная по пику аллантоина
подвижной фазой до метки и перемешивают. из хроматограмм испытуемого раствора и
Раствор используют свежеприготовленным. раствора сравнения, должна быть не менее
Раствор сравнения: около 0.025 г (точная на- 1600 теоретических тарелок;
веска) стандартного образца аллантоина (EP SCR — относительное стандартное отклонение пло-
или ФСО ГФУ) помещают в мерную колбу вме- щадей пиков аллантоина, рассчитанное по
стимостью 50 мл, растворяют в 10 мл 96 % эта- пику аллантоина из хроматограмм испытуе-
нола, доводят объем раствора 96% этанолом до мого раствора и раствора сравнения, должно
метки и перемешивают. Срок годности раство- соответствовать требованиям ГФУ, 2.2.46.
ра — 14 сут. 2.0 мл полученного раствора по-
мещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, Валидация методики количественного
доводят объем раствора подвижной фазой до определения аллантоина в препарате
метки и перемешивают. Раствор используют «Йодиксол»
свежеприготовленным. Валидацию методики проводили в соответ-
По 10 мкл раствора сравнения и испытуемо- ствии с требованиями ГФУ [20] и Руководства
го раствора хроматографируют на жидкостном СРМР/ICH/381/95.
хроматографе со спектрофотометрическим де- Для метода количественного определения
тектором в следующих условиях: валидация проводится по следующим харак-
— хроматографическая колонка Symmetry теристикам: специфичность, правильность,
Shield RP18 или Supelcosil LC-ABZ размером прецизионность, линейность, диапазон приме-
150 мм × 4.6 мм, заполненная сорбентом с нения. Также должна быть рассчитана полная
размером частиц 5 мкм; неопределенность методики количественного
— подвижная фаза: 0.01 М раствор дигидро- определения аллантоина.
фосфата лития, доведенный до рН 3.0 кис- Содержание аллантоина в 1 г препарата долж-
лотой фосфорной концентрированной (по- но быть от 0.90 мг до 1.10 мг (номинальное со-
тенциометрически); держание — 1 мг/г препарата), то есть ± 10 %
— температура термостата колонки — 30 °С; от номинального содержания (В = 10). Следо-
— скорость подвижной фазы — 1.0 мл/мин; вательно, максимально допустимая неопреде-

10
ФАРМАКОМ 3-2017
ленность результатов количественного опреде- раствора плацебо (Рис. 3Б) не наблюдается до-
ления аллантоина должна составлять: полнительных пиков, и, следовательно, первый
ΔAs ≤ В × 0.32 = 10 × 0.32 = 3.2 %. критерий выполняется. Выполнение второго
критерия наглядно демонстрируют хромато-
Неопределенность пробоподготовки долж-
граммы, приведенные на Рис. 3А (раствор стан-
на быть незначимой по сравнению с макси-
дартного образца аллантоина) и Рис. 3В (испы-
мально допустимой неопределенностью ана-
туемый раствор препарата); времена выхода
лиза [ГФУ]:
пика аллантоина на обоих приведенных хро-
ΔSp < ΔAs × 0.32 = 3.2 × 0.32 = 1.024 %. матограммах различаются незначимо.
Из всего вышесказанного можно сделать
Специфичность методики вывод, что методика определения аллантоина
Критерии приемлемости для характеристи- в препарате «Йодиксол» методом ВЭЖХ явля-
ки «Специфичность» следующие: 1) на хрома- ется специфичной.
тограмме раствора плацебо должны отсутство-
вать пики со временем удерживания, совпада- Линейность методики
ющим со временем удерживания пика аллан-
Зависимость между введенным (Сi/Сst) и
тоина, и 2) время удерживания пика аллантои-
найденным (Si/Sst) количеством определяемого
на на хроматограммах испытуемого раствора
вещества в области действия методики должна
должно совпадать со временем удерживания
пика аллантоина на хроматограммах раство- быть линейной (в нормализованной системе ко-
ра сравнения с точностью, не превышающей ординат), и быть представленной уравнением
статистически значимую разницу между вре- вида (Si/Sst) × 100 = b × (Сi/Сst) × 100 + a.
менами удерживания. Для характеристики «Линейность» должны
На Рис. 3 приведены хроматограммы, по- выполняться следующие условия:
лученные при изучении специфичности ме- 1) Свободный член (а) должен быть стати-
тодики. стически неотличим от нуля.
Как видно из Рис. 3, в области выхода пика Критерий статистической незначимости па-
аллантоина (около 3.25 мин) на хроматограмме раметра а не должен превышать свой довери-

Рисунок 3

Хроматограммы стандартного раствора аллантоина (А), раствора плацебо (Б) и испытуемого раствора
препарата (В), полученные в предлагаемых условиях хроматографирования

11
3-2017 ФАРМАКОМ
тельный интервал, а именно (для 11 растворов 3 параллельных определениях. График линей-
и 3 параллельных определений): ной зависимости найденного количества ал-
а ≤ Δа = t(95%,n — 2) × Sa = 1.6973 × Sa. лантоина от введенного представлен на Рис. 4,
а результаты расчета параметров линейной
Критерий практической незначимости рас- зависимости и соответствие их рассчитанным
считывают в случае, если не выполняется кри- критериям — в Табл. 1.
терий статистической незначимости, по фор- Как видно из данных, приведенных на Рис. 4
муле (В = 10 % и Хmin = 75 %): и в Табл. 1, предлагаемая методика удовлетво-
ряет всем рассчитанным критериям; методика
0.32 × Δ As (%) 0.32 × 3.2
a≤ = = 4.096. линейна в изучаемом диапазоне концентраций
1 − ( X min / 100) 1 − (75 / 100) аллантоина — от 75 % до 125 % по отношению к
номинальному содержанию аллантоина.
2) Относительное остаточное стандартное
отклонение (RSD0 — отношение остаточного Прецизионность (сходимость) и
стандартного отклонения RSDrest к тангенсу уг- правильность методики
ла наклона регрессионной прямой b) не долж-
Для оценки сходимости используют отно-
но превышать:
сительный доверительный интервал, который
Δ As должен быть меньше максимально допусти-
RSD0 = RSDrest / b ≤ = мой неопределенности результатов анализа:
t (95 %, n − 2)
ΔAs ≤ 3.2 % (при В = 10 %).
3.2 Для оценки правильности определяется сте-
= = 1.885 %.
1.6973 пень соответствия между известным истин-
ным значением и значением, полученным по
3) Коэффициент корреляции (r), рассчитан- данной методике, то есть методика не долж-
ный с использованием величины RSDY = 16.583 %, на иметь значимой систематической погреш-
должен превышать величину ности: Δ = |Z – 100| должна незначимо отли-
2 2
чаться от нуля.
⎛ RSD0 ⎞ ⎛ 1.885 ⎞ Для характеристики «правильность» долж-
r ≥ 1− ⎜ ⎟ = 1− ⎜ ⎟ = 0.99352.
⎝ RSDY ⎠ ⎝ 16.583 ⎠ ны выполняться следующие условия:
1) Критерий статистической незначимости (для
Линейность исследовали в диапазоне кон- 33 точек измерения): Δ% ≤ ΔAs / √n = 3.2/5.74 =
центраций аллантоина от 75 % до 125 % по от- 0.557.
ношению к номинальному значению; измере- 2) Критерий практической незначимости:
ния проводили для 11 растворов с шагом 5 % в Δ% ≤ 0.32 × 3.2 = 1.024 %.
Рисунок 4

График линейной зависимости найденного количества аллантоина от введенного

12
ФАРМАКОМ 3-2017
Диапазон применения методики для коли- исследуемой области концентраций и расчет
чественного определения — от 75 % до 125 % метрологических характеристик приведены
от номинального содержания аллантоина в в Табл. 2.
препарате. Из данных, приведенных в Табл. 2, следует,
Характеристики исследовали на модельных что методика количественного определения
растворах в диапазоне от 75 % до 125 % (шаг 5 %)
аллантоина характеризуется достаточной пра-
от номинального содержания аллантоина в пре-
парате. Модельные растворы готовили с исполь- вильностью и прецизионностью (сходимостью)
зованием раствора плацебо препарата. во всем диапазоне концентраций (от 75 % до
Правильность и прецизионность методики 125 %), так как полученные значения довери-
были проверены методом «введено/найдено». тельного интервала и систематической погреш-
Результаты количественного определения каж- ности не превышают рассчитанных критиче-
дого из компонентов в модельных растворах в ских величин. Методика является корректной
Таблица 1
Характеристики линейной зависимости найденной концентрации аллантоина от введенной
Параметры Значения Критерии приемлемости Заключение
b 0.9877
Sb 0.0080
Выдерживается по обоим
a 1.3054 < 1.3767 < 4.096
критериям
Sa 0.8111
RSD0 1.5886
RSD0/b 1.6084 < 1.885 Выполняются
r 0.99967 > 0.99352 Выполняются

Таблица 2
Результаты анализа модельных смесей препарата и их статистическая обработка
Введено в % Найдено в % к
Найдено в %
Концентрация от номинальной Средняя концентрации
№ р-ра к введенному,
аллантоина в мг/мл концентрации (Xi, площадь пика раствора
Zi = 100 × (Yi/Xi)
факт., %) сравнения (Yi, %)
1 0.0318 75.00 333787.6 74.33 99.11
2 0.0339 80.00 358528.3 79.94 99.92
3 0.0360 85.00 381210.3 85.08 100.09
4 0.0382 90.00 406733.3 90.86 100.96
5 0.0403 95.00 424539.3 94.90 99.89
6 0.0424 100.00 446719.8 99.92 99.92
7 0.0445 105.00 470294.3 105.27 100.25
8 0.0466 110.00 492501.3 110.30 100.27
9 0.0488 115.00 513467.7 115.05 100.05
10 0.0509 120.00 533284.7 119.54 99.62
11 0.0530 125.00 556513.2 124.81 99.85
Среднее, Z , % = 99.99
Относительное стандартное отклонение, RSDz, % = 0.45
Относительный доверительный интервал
0.77
Δz % = t(95 %,n – 2) × RSDz = 1.6973 × 0.45 =
Критическое значение для сходимости результатов δAs, % = 3.2
Систематическая ошибка δ % = 0.01
Критерий статистической незначимости δ < 0.557
Критерий практической незначимости δ < 1.024

13
3-2017 ФАРМАКОМ
и не имеет практически значимой системати- ское значение 3.2 %, и, следовательно, при вос-
ческой ошибки. произведении в других лабораториях методика
будет давать корректные результаты.
Прогнозирование полной неопределенности
методики Робастность методики
Для подтверждения корректности методи- Для подтверждения работоспособности ме-
ки при ее воспроизведении в других лабора- тодики была проверена ее робастность, то есть
ториях была рассчитана полная неопределен- влияние небольших изменений в условиях хро-
ность методики (ΔAscalc), которая включает в се- матографирования на результаты определения
бя неопределенность пробоподготовки (ΔSP) и аллантоина.
неопределенность конечной аналитической Проведенные исследования показали, что
операции (ΔFAO). изменения скорости подвижной фазы (± 10 %),
температуры колонки (± 5 °С), длины волны
Δ calc
As = Δ 2SP + Δ 2FAO . детектирования (± 2 нм) и рН подвижной фа-
зы (± 0.1 единица рН) не оказывают замет-
Рассчитанная полная неопределенность ме- ного влияния на результаты количественной
тодики не должна превышать максимально до- оценки содержания аллантоина в препарате
пустимую неопределенности результатов ана- «Йодиксол».
лиза: ΔAs ≤ 3.2 % (при В = 10 %). Наиболее сильное изменение при прове-
В Табл. 3 приведены данные и расчет полной дении количественного определения аллан-
неопределенности методики. тоина было отмечено при замене колонки
Таким образом, полная прогнозируемая нео- Symmetry Shield RP18 на аналогичную ей ко-
пределенность результатов при количественном лонку Supelcosil LC-ABZ (оба сорбента отно-
определении аллантоина не превышает критиче- сятся к группе «сорбент на основе силикагеля

Таблица 3
Расчет неопределенности методики количественного определения аллантоина
Расчет неопределенности пробоподготовки
Раствор сравнения Испытуемый раствор

Аналитическая операция Неопределенность, % Аналитическая операция Неопределенность, %


Взятие навески СО Взятие навески СО
0.80 0.02
аллантоина (25 мг) аллантоина (1000 мг)
Доведение до объема в Доведение до объема в
0.17 0.23
мерной колбе 50 мл мерной колбе 25 мл
Аликвота 2.0 мл 0.50

Доведение до объема в
0.23
мерной колбе 25 мл

Неопределенность пробоподготовки ΔSP = 1.012 ≤ ΔSPmax = 1.024.

Расчет неопределенности конечной аналитической операции


Раствор сравнения Испытуемый раствор
447096 447592
447741 447846
Площадь хроматографического
446953 448728
пика
447128 447821
447348 447955
Среднее значение 447253 447988
RSD, % 0.069 0.097
1
Δ iFAO = × t (95%, n0 − 1) × RSDi 0.062 0.087
5
Неопределенности конечной аналитической операции ΔFAO = 0.107 %.
Полная неопределенность методики ΔAscalc = 1.018 % ≤ ΔAs = 3.2%.

14
ФАРМАКОМ 3-2017
с привитыми полярными группами»). На Рис. 5 2. Показано, что по изучаемым валидаци-
приведены хроматограммы раствора плацебо онным характеристикам (специфичность,
препарата «Йодиксол», раствора стандартного правильность, прецизионность, линейность,
образца и испытуемого раствора препарата, по- диапазон применения, робастность) разрабо-
лученные на колонке Supelcosil LC-ABZ. Можно танная методика удовлетворяет требованиям,
отметить, что хроматографическое поведение описанным в ГФУ.
аллантоина практически одинаково на обеих 3. Рассчитана полная неопределенность ме-
колонках, в то время как удерживание осталь- тодики количественного определения алланто-
ных компонентов препарата «Йодиксол» доста- ина для оценки возможности воспроизведения
точно заметно отличается (Рис. 2 и 5). методики в других лабораториях и получения
Сравнение результатов количественного корректных результатов.
определения модельных смесей препарата «Йо-
ЛИТЕРАТУРА
диксол», полученных на колонках Symmetry 1. Final report of the safety assessment of allantoin and its
Shield RP18 и Supelcosil LC-ABZ, с использо- related complexes / C.L. Burnett, W.F. Bergfeld, D.V. Belsito,
ванием F-критерия показало, что результаты C.D. Klaassen et al. // International Journal of Toxicology. –
2010. – Vol. 29. – № 3_suppl. – P. 84S-97S.
различаются незначимо, и, следовательно, вы-
2. Posner A.M. Allantoin — its properties and uses // Journal
шеуказанные колонки являются взаимозаме- of Cosmetic Science. – 1958. – Vol. 9. – № 1. – P. 58-61.
няемыми. 3. Szymanska E. Allantoin – healing and anti-inflammatory
properties // Pediatria i Medycyna Rodzinna. – 2012. –
Выводы Vol. 8. – № 1. – P. 73-77.
4. Federal Register (1983). Staff Congressional Information
1. Разработана экспрессная и экономичная
Service Inc. National Archives and Records Administration,
методика количественного определения ал- Office of the Federal Register, USA. 48, 32, 6820-6833.
лантоина в препарате «Йодиксол». Для разра- 5. Federal Register (1990). Staff Congressional Information
ботанной методики была проведена процеду- Service Inc. National Archives and Records Administration,
Office of the Federal Register, USA. 55, 11, 25240-25281.
ра валидации в соответствии с требованиями 6. Chen X.B. Determination of allantoin in biological, cosmetic
фармакопеи Украины. and pharmaceutical samples / Chen X.B., Matuszewski W.,

Рисунок 5

Хроматограммы раствора плацебо (А), стандартного раствора аллантоина (Б) и испытуемого раствора
препарата (В), полученные в предлагаемых условиях хроматографирования (изучение робастности
методики) на колонке Supelcosil LC-ABZ

15
3-2017 ФАРМАКОМ
Kovalczyk J. // J AOAC Int. – 1996. – Vol. 79. – N 3. – УДК 543.544.5.068.7+543.8+615.07
P. 628-635. Резюме
7. Quantitative determination of an extremely polar compound Андрющенко Т. Л., Вєрушкін О. Г.,
allantoin in human urine by LC-MS/MS based on the separation Куліков А. Ю., Вєрушкіна О. С.
on a polymeric amino column / A. Berthemy, J. Newton, D. Wu, Державне підприємство «Український науковий фарма-
D. Buhrman // J. Pharm. Biomed. Anal. – 1999. – Vol. 19. – копейний центр якості лікарських засобів»
P. 429-434. Санітарно-гігієнічний відділ військової частини А4510,
8. Zaidi Z.R. Stability assay of allantoin in lotions and creams м. Харків
by high-pressure liquid chromatography / Zaidi Z.R., Sena F.J., Розробка та валідація методики кількісного визначення
Basilio C.P. // J. Pharm. Sci. – 1982. – Vol. 71. – № 9. – алантоїну в препараті «Йодиксол» методом обернено-
P. 997-999. фазової ВЕРХ
9. Trivedi R.J. Stability-Indicating Liquid Chromatographic Pro- Розроблено економічну методику для кількісної оцінки
cedure for Determination of Allantoin in Cosmetic Lotion // вмісту алантоїну в препараті «Йодиксол» з використанням
J. AOAC Int. – 1988. – Vol. 71. – № 2. – P. 290-294. методу обернено-фазової ВЕРХ. Відділення алантоїну від
10. Simultaneous measurement of diazolidinyl urea, urea, and інших діючих та допоміжних речовин проводили з вико-
allantoin in cosmetic samples by hydrophilic interaction chro- ристанням С18-сорбентів з інкорпорованими полярними
matography / Takahiro Doi, Keiji Kajimura, Satoshi Takatori групами, таких як Symmetry Shield, Supelcosil LC-ABZ, з
et al. // J. Chromatogr. B. – 2009. – Vol. 877. – Iss. 10. – використанням фосфатного буферного розчину рН 3.0 як
P. 1005-1010. рухомої фази. Для розробленої методики проведено проце-
11. Determination of urea and allantoin in cosmetics / Rohrer дуру валідації відповідно до вимог Державної Фармакопеї
J.S., Chen Jing, Xu Qun, Li Lang // LCGC. – 2008. – Jun України. Доведено, що методика за параметрами, що ва-
Application Notebook. – http://www.chromatographyon- лідуються (специфічність, лінійність, межа застосування,
line.com. правильність, прецизійність, робасність), відповідає роз-
12. Automated Solid Phase Extraction of Allantoin from Cos- рахованим критеріям та може бути рекомендована фар-
metics and Topical Pharmaceuticals Prior to Analysis by мацевтичним підприємствам для кількісного визначення
HPLC // Gilson Application Note. –http://www.gilson.com/ алантоїну в препараті «Йодиксол» або його аналогу.
UserFiles/file/Allantoin%20SPE%20Note%20PHA0110%20 Ключові слова: алантоїн, «Йодиксол», обернено-фазова
DEC%202010.pdf. ВЕРХ, валідація.
13. Determination of Urea, Allantoin and Lysine Pyroglutamate in
UDC 543.544.5.068.7+543.8+615.07
Cosmetic Samples by Hydrophilic Interaction Chromatography /
Summary
Dallet P., Labat L., Kummer E., Dubost J.P. // J. Chromatogr. B. – Andrjushenko T. L., Verushkin О. G.,
2000. – Vol. 742. – № 2. – P. 447-452. Kulikov A. Yu., Verushkina O. S.
14. Chen X.B. Measurement of allantoin in urine and plasma by State Enterprise «Ukrainian Scientific Pharmacopoeial Center
high-performance liquid chromatography with pre-column de- for Quality of Medicines», Ukraine
rivatization / Chen X.B., Kyle D.J., Orskov E.R. // J.Chromatogr. Sanitary and hygienic division of military station A4510,
B. – 1993. – Vol. 617. – № 2. – P. 241-247. Kharkiv, Ukraine
15. Czauderna M., Kowalczyk J. Determination of allantoin
Development and validation of allantoin assay method in
in blood by high-performance liquid chromatography with
pharmaceutical drug «Iodiksol» using reversed-phased
pre-column derivatization // J. Animal Feed Sci. – 1995. – HPLC
Vol 4. – P. 351-358. The economic method for allantoin assay in pharmaceitu-
16. Simultaneous determination of chondroitin sulfate sodium, cal drug «Iodiksol» with using reversed-phase HPLC was de-
allantoin and pyridoxine hydrochloride in pharmaceutical eye veloped and validated. Allantoin separation from other active
drops by an ion-pair high-performance liquid chromatography ingredients (ethanol, povidone-iodine, menthol) and addi-
/ Pengfei Jin, Jie Ma, Xuejun Wu, Ding Zou et al. // J. Pharm. tives was done with using C18-sorbents with polar-embedded
Biomed. Anal. – 2009. – Vol. 50. – P. 293-297. groups such as Symmetry Shield, Supelcosil LC-ABZ; lithium
17. A rapid determination of allantoin by high-performance liq- phosphate buffer solution pH 3.0 was used as mobile phase.
uid chromatography using tris(hydroxymethyl)aminomethane- At mobile phase flow-rate 1.0 ml/min the allantoin retention
HCl buffer as a mobile phase / Yamomoto R., Seki M., Ouchi time was about 3.3 min, and total analysis time was near 15 min,
K., Koyano S. et al. // Yakugaku Zasshi. – 1998. – Vol. 118. – depends on the used chromatographic column. The validation
№ 8. – P. 310-316. procedure according to the requirements of the State Pharma-
18. Аналитическая химия в создании, стандартизации и copoeia of Ukraine was carried out for the development meth-
контроле качества лекарственных средств: в 3 томах на od. It was demonstrated, that the proposed method according
русском языке / Под ред. чл.-кор. НАН Украины В.П. Ге- to the validation parameters (specificity, linearity, range, pre-
оргиевского. – Харьков: НТМТ, 2011. – Т. 1. – 464 с. – cision, accuracy) was satisfied to the calculated criterion. Pro-
Т. 2. – 474 с. – Т. 3. – 520 с. posed method is characterized good chromatographic stability
19. Куликов А.Ю. Обращенно-фазовая высокоэффектив- and can be recommended to the drug manufacturers for the
ная жидкостная хроматография / Куликов А.Ю., Верушкин allantoin assay in medicinal drug «Iodiksol» or its analogue
А.Г., Георгиевский В.П. // Аналитическая химия в созда- during routine analysis.
нии, стандартизации и контроле качества лекарственных Keywords: allantoin, Iodiksol, reversed-phase HPLC, vali-
средств: в 3 томах на русском языке / Под ред. чл.-кор. dation.
НАН Украины В.П. Георгиевского. – Харьков: НТМТ,
2011. – Т. 2. – С. 637-723. Андрющенко Татьяна Леонидовна. Окончи-
20. Державна Фармакопея України: в 3 т. / Державне ла Харьковский национальный университет имени
підприємство «Український науковий фармакопейний центр В.Н. Каразина (1998). Зам. заведующего лаборатори-
якості лікарських засобів». – 2-е вид. – Харків: Державне ей фармакопейного анализа ГП «Украинский науч-
підприємство «Український науковий фармакопейний центр ный фармакопейный центр качества лекарственных
якості лікарських засобів», 2015. – Т. 1. – 1128 с. средств», ст. науч. сотр.

16
ФАРМАКОМ 3-2017
Верушкин Алексей Геннадиевич. Окончил Харь- пейного анализа ГП «Украинский научный фарма-
ковский национальный университет имени В.Н. Ка- копейный центр качества лекарственных средств».
разина (1993). Ст. науч. сотр. лаборатории фармако- Д. х. н. (2014).
пейного анализа ГП «Украинский научный фармако-
пейный центр качества лекарственных средств». Верушкина Оксана Святославовна. Окончи-
ла Харьковский национальный университет имени
Куликов Артем Юрьевич. Окончил Харьков- В.Н. Каразина (1994). Врач-лаборант высшей кате-
ский национальный университет имени В.Н. Кара- гории санитарно-гигиенического отдела воинской
зина (1993). Ст. науч. сотр. лаборатории фармако- части А4510.

УДК 543.612:543.544.5.068.7:615.238

Бурмака А. В., Гуреева С. Н., Маргитич В. М.


ПАО «Фармак», г. Киев

Разработка методики контроля сопутствующих примесей субстанции


энисамиума йодида
Разработана методика контроля примесей субстанции энисамиума йодида с использованием метода высокоэффек-
тивной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Состав подвижной фазы, скорость ее потока, тип хроматографической
колонки подобраны таким образом, что позволяют определять примеси в единых хроматографических условиях.
Выбраны длины волн, оптимальные для детектирования примесей. Также подобрана концентрация испытуемого рас-
твора. Успешно выбран ион-парный реагент, обеспечивающий достаточное время удерживания пиков примесей, а
также пиков основного компонента.
В результате проведения стрессовых исследований, при которых субстанцию подвергали действию повышенной тем-
пературы, окислению, кислотному и щелочному гидролизу, а также влиянию света, подтверждено, что методика явля-
ется специфической по отношению к определению продуктов деградации субстанции энисамиума йодида.
Допустимые пределы содержания примесей для субстанции энисамиума йодида установлены в соответствии c реко-
мендациями Международной конференции по гармонизации технических требований к регистрации лекарственных
препаратов для человека (ICH).
Ключевые слова: энисамиума йодид, субстанция, ICH Q3A, сопутствующие примеси, ВЭЖХ.

Введение Метод высокоэффективной жидкостной


В связи с необходимостью повышения эф- хроматографии (ВЭЖХ) был выбран в связи
фективности и безопасности лекарственных с необходимостью достижения высокой чув-
средств повышаются требования к их качеству. ствительности и селективности анализа, так
Так, например, в рекомендациях ICH Q3A [1] как предел содержания примесей установлен
представлена информация относительно под- на уровне «не более 0.05 % каждой индивиду-
ходов к расчету допустимого содержания при- альной примеси».
месей в активных фармацевтических ингреди- Материалы и методы
ентах (АФИ).
Препараты на основе энисамиума йодида В качестве исследуемого материала исполь-
являются одними из широко используемых ле- зовали субстанцию энисамиума йодида с. 10415
карственных препаратов при ОРВИ [2-4]. производства ПАО «Фармак».
В научной литературе не описаны методики При разработке методики были задействова-
контроля, позволяющие выполнять контроль ны следующие приборы: жидкостный хромато-
примесей энисамиума йодида на рекоменду- граф производства Agilent Technologies серии
емом ICH уровне. Существует метод тонкос- 1260, весы электронные Mettler Toledo AB54S
лойной хроматографии для определения со- (Швейцария), спектрофотометр Specord 250 Plus
путствующих примесей, но чувствительность (Германия). Также была использована мерная
метода недостаточна для обеспечения контроля посуда класса А фирмы Simax (Чехия).
примесей на уровне не более 0.05 %. В процессе приготовления проб и подвижной
Целью данной работы является разработка фазы использовали следующие реактивы и стан-
методики контроля сопутствующих примесей дарты: натрия октан-1-сульфоната моногидрат
энисамиума йодида: бензиламина, изоникоти- Sigma-Aldrich, кат. № 74882; динатрия гидроген-
новой кислоты, бензиламида изоникотиновой фосфат безводный Sigma-Aldrich, кат. № 04276;
кислоты и других неизвестных примесей. ацетонитрил Sigma-Aldrich, кат. № 34851; фос-
В данной работе впервые представлены ре- форная кислота 85% Sigma-Aldrich, кат. № 04107;
зультаты разработки ВЭЖХ-методики контро- натрия гидроксид Sigma-Aldrich, кат. № 06203;
ля примесей АФИ энисамиума йодида. вода очищенная, полученная на установке Milli Q

17