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Rev Cubana Farm 2002;36(1):56-61
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Productos Naturales
Centro de Estudios de Biotecnología Industrial
Facultad de Ciencias Naturales y Matemáticas, Universidad de Oriente

Validación de un método potenciométrico para la determinación de


nitrógeno amínico en hidrolizados proteicos de microalgas
/Humberto Joaquín Morris Quevedo,1 Ángel Almarales Arceo,2 Katherine
Romero Viamonte3 y Milene Vidal Colás3/ <#cargo>//

Resumen
El sistema de valoración de aminoácidos o de mezclas de aminoácidos en
presencia de un exceso de formaldehído se utiliza como método analítico,
particularmente para monitorear la formación de aminoácidos libres
durante la hidrólisis de las proteínas. Se realizó la validación del
método potenciométrico de valoración con formaldehído (USP XXIV, 2000)
para la determinación cuantitativa de nitrógeno amínico en hidrolizados
proteicos de la microalga /Chlorella vulgaris/. Teniendo en cuenta la
clasificación del método, se evaluaron los parámetros: linealidad,
precisión, exactitud y especificidad. La técnica es fiable ya que no es
afectada por interferencias provocadas por otras sustancias presentes en
el hidrolizado; además, el procesamiento estadístico de los datos
evidenció la linealidad, precisión y exactitud del método. El
procedimiento validado es simple y rápido, por lo que puede ser aplicado
en la cuantificación de nitrógeno amínico en lotes de hidrolizado
proteico obtenidos en nuestros laboratorios.
DeCS: POTENCIOMETRIA; AMINOACIDOS/análisis; NITROGENO/análisis; ALGAS
VERDES; HIDROLISADOS DE PROTEINA/análisis; HIDROLISADOS DE PROTEINA/uso
terapéutico; CHLORELLA; DIETOTERAPIA; BIOTECNOLOGIA.
Diversos han sido los estudios experimentales y clínicos que han
aportado numerosas evidencias relacionadas con la utilización de los
hidrolizados proteicos como preparados bioestimulantes en los sectores
médico-farmacéutico, biotecnológico y nutricional. El uso de dietas
basadas en hidrolizados proteicos es muy útil en la terapia nutricional
de enfermedades de la mucosa gastrointestinal, en pacientes
hipercatabólicos, síndromes de malnutrición1 y en la disminución de las
reacciones anafilácticas atribuidas a proteínas y macropéptidos.2
Otros efectos terapéuticos asociados con la administración de
hidrolizados proteicos están relacionados con el incremento de la
función destoxificadora del amonio en el tejido muscular3 y por otra
parte, se ha sugerido que los hidrolizados de las proteínas influyen en
la regulación endocrina de los procesos metabólicos.4
Entre los principales indicadores de calidad de estos productos figuran
los parámetros relacionados con el contenido de nitrógeno. Se destaca el
N-amínico como un indicador de gran utilidad para monitorear la marcha
de la hidrólisis y establecer la eficiencia final del proceso. En la
literatura aparecen reportados varios métodos para la determinación del
N-amínico en hidrolizados proteicos, como el método gasométrico de
Van-Slyke, por valoración directa de los grupos amino liberados en
disolución acetónica con HCl y a-naftol como indicador, o en disolución
de ácido acético glacial con ácido perclórico y azul cresol como
indicador y por precipitación de las sales cúpricas de los aminoácidos
según el método de Pope y Stevens.5
Por el alto grado de complejidad de estos métodos, desde el punto de
vista práctico de ejecución, en la USP XXIV se propone un procedimiento
que consiste en una valoración potenciométrica con hidróxido de sodio en
presencia de un exceso de formaldehído.6 El presente trabajo se propone
la validación de este método potenciométrico para la determinación de
N-amínico en hidrolizados proteicos de microalgas teniendo en cuenta las
regulaciones establecidas para asegurar el cumplimiento de las buenas
prácticas de laboratorio (BPL).

Métodos
Se utilizó un lote de hidrolizado proteico de la microalga /Chlorella
vulgaris/ con una concentración de N-amínico de 0,39 mg/mL obtenido en
el Centro de Investigaciones de Energía Solar (CIES) con un preparado de
bromelina de producción nacional (Centro de Bioplantas, Ciego de Ávila).
La determinación de N-amínico se realizó según el método potenciométrico
descrito en la USP XXIV (2000)6 en presencia de un exceso de
formaldehído. Se utilizó como agente valorante una disolución de
hidróxido de sodio 0,1 mol/L. Las valoraciones se efectuaron en un
potenciómetro digital Pracitronic MV 870 con electrodo combinado de
vidrio calomel y equipo de agitación magnética. Se calibró de acuerdo
con el procedimiento establecido, midiendo los valores de pH de las
disoluciones tampones utilizadas en la calibración del equipo después de
cada 5 mediciones en el potenciómetro.7
Cada mililitro de hidróxido de sodio 0,1 mol/L consumido durante la
valoración equivale a 1,4 mg de N-amínico.
Los parámetros que se tuvieron en cuenta para la validación del método
fueron linealidad, precisión, exactitud y espe-cificidad.8
En el ensayo de linealidad se valoraron hidrolizados de concentraciones
comprendidas entre 40-240 mg%. Se realizó un análisis de regresión
lineal simple y adicionalmente, se aplicó la prueba de la t de Student
con la finalidad de determinar la significación de la correlación lineal.9
En el ensayo de precisión se tomaron en consideración los criterios de
repetibilidad y reproducibilidad. El análisis de repetibilidad se
realizó procesando una muestra de concentración 125 mg% 20 veces el
mismo día bajo idénticas condiciones experimentales y para la
reproducibilidad se procesó dicha muestra durante 20 d consecutivos. Los
resultados fueron evaluados en términos de la desviación estándar y el
coeficiente de variación.
En el estudio de la exactitud del método fueron analizadas por
triplicado 5 muestras de concentraciones comprendidas en el rango
lineal: 65, 125, 160, 190 y 220 mg%. Se determinó la correlación entre
las cantidades teóricas con los valores encontrados experimentalmente y
se precisaron los intervalos de confianza del intercepto y de la
pendiente para los niveles de significación de 0,05 y 0,01.10
Con el objetivo de estudiar las posibles interferencias de otras
sustancias diferentes de los aminoácidos y péptidos presentes en el
hidrolizado proteico, se añadió 1 mL del hidrolizado de la microalga
/Chlorella vulgaris/ a alícuotas de una solución estándar de alanina con
una concentración de N-amínico de 2,5 mg/mL. Se compararon los valores
teóricos y experimentales de N-amínico en las muestras y se realizó un
análisis de regresión lineal simple, estimando las ecuaciones de
regresión y los coeficientes de determinación.

Resultados
Los valores de pH de las disoluciones tampones medidos después de cada 5
valoraciones realizadas en el potenciómetro se mantuvieron dentro de los
rangos establecidos7 (7,00 ± 0,02 CV=0,28 % y 9,18 ± 0,04 CV=0,44 %),
por lo que los resultados de las valoraciones aportados por el equipo se
consideran correctos.
El método evaluado presentó una respuesta lineal en el intervalo
comprendido entre 40 y 240 mg% (tabla 1) y el coeficiente de correlación
mostró un valor cercano a la unidad. El coeficiente de variación del
coeficiente de regresión (pendiente) fue menor que el establecido de 5
%11 y el intervalo de confianza del intercepto incluye al cero.
Tabla 1. Resultados del ensayo de linealidad de la técnica para la
determinación potenciométrica de N-amínico
Rango lineal (mg %)
40-240
Ecuación de regresión
y=35,011x-0,067
Coeficiente de correlación (r)
0,9999
Coeficiente de determinación (r2)
0,9998
Desviación típica del coeficiente de regresión (sb)
2,09 x 10-4
Coeficiente de variación del coeficiente de regresión (CVb)
5,97 x 10-4
Límites de confianza del coeficiente de regresión (b ± ttabsb)
35,0110 ± 0,0004
Desviación típica del intercepto (sa)
0,00733
Límites de confianza del intercepto (a± ttabsb)
(-0,0670) ± 0,0148
Correlación lineal (t1)
158,098
Volumen de NaOH 0,1 N consumido (mL) vs. mg% de N-amínico.
En el ensayo de precisión (tabla 2), los coeficientes de variación de la
repetibilidad y reproducibilidad están por debajo del 5 %. Las
variaciones introducidas en el ensayo de reproducibilidad no influyeron
sobre los resultados.
Tabla 2. Resultados del ensayo de precisión de la técnica
potenciométrica para la determinación de N-amínico
Ensayo
Criterios
Repetibilidad
Reproducibilidad
n
20
20
x (mg%)
125,63
132,06
S (mg%)
1,97
3,73
CV (%)
1,60
2,80

Concentración de N-amínico en la muestra: 125 mg %.


Las evidencias obtenidas en el estudio de exactitud (tabla 3)
demostraron la no existencia de errores sistemáticos constantes ni
proporcionales. En todos los casos el porcentaje de recobrado estuvo
entre 98 y 101 %.
Tabla 3. Resultados del ensayo de exactitud de la técnica
potenciométrica para la determinación de N-amínico
Ecuación de regresión
y=(-2,9797) + 1,0247 x
Coeficiente de correlación (r)
0,9996
Coeficiente de determinación (r2)
0,9993
Desviación típica de la pendiente (sb)
0,0155
Desviación típica del intercepto (sa)
1,2801
Nivel de significación
0,05
0,01
Intervalo de confianza de la pendiente (b ± sb)
1,0247 ± 0,0365

1,0247 ± 0,0905
Intervalo de confianza del intercepto (a ± sa)
-2,9797 ± 3,0121

-2,9797 ± 7,4771

En el ensayo de especificidad (tabla 4), el porcentaje de recobrado


medio fue del 100,2 % y la desviación estándar del 1,32 %. Al aplicar el
test t no se encontraron diferencias significativas entre las cantidades
teóricas y las detectadas experimentalmente con un grado de probabilidad
superior al 99 %. Por otra parte, las ecuaciones de regresión (tabla 5)
mostraron que los valores de los coeficientes de regresión (pendientes)
correspondientes a la solución patrón y a la solución patrón más 1 mL
del hidrolizado son muy similares.
Tabla 4. Análisis de la especificidad del método potenciométrico para la
determinación de N-amínico (I). Estudio de recobrado
Solución
mg de N-amínico
mg de N-amínico
Cantidad calculada
Cantidad encontrada
Recobrado
patrón (mL)
añadidos
del hidrolizado
(mg de N-amínico)
( mg de N-amínico)
(%)
1,0
2,50
0,39
2,89
2,95
102,1
2,0
5,00
0,39
5,39
5,35
99,2
2,5
6,25
0,39
6,64
6,65
100,1
3,0
7,50
0,39
7,89
7,84
99,4

Tabla 5. Análisis de la especificidad del método potenciométrico para la


determinación de N-amínico (II). Ecuaciones de regresión y parámetros
asociados

Solución patrón
Solución patrón + 1 mL del hidrolizado
Ecuación de regresión
y=62,857x + 1,428
y=61,280x + 12,23
Coeficiente de determinación (r2)
0,9992
0,9998
Desviación típica del coeficiente de regresión (sb)
1,350
3,920
Coeficiente de variación del coeficiente de regresión (CVb)
2,15
6,397
Límites de confianza del coeficiente de regresión (b ± ttabsb)
62,857± 3,942
61,280 ± 11,446
Discusión
La linealidad del método evaluado en el intervalo comprendido entre 40 y
240 mg % (coeficiente de correlación cercano a la unidad) indica la
existencia de una proporcionalidad entre las concentraciones de
N-amínico y el volumen de NaOH 0,1 mol/L consumido en las valoraciones,
con un grado de probabilidad superior al 99,9 %.
Los coeficientes de variación tanto de la repetibilidad como de la
reproducibilidad, inferiores al 5 %, se consideran aceptables para este
tipo de análisis.
En el estudio de exactitud se excluyó la existencia de errores
sistemáticos constantes y proporcionales al cumplirse los requisitos10
de que para ambos niveles de significación el intervalo de confianza de
la pendiente debe incluir al 1 y el del intercepto al 0.
Los resultados del ensayo de especificidad demostraron la no existencia
de sustancias que puedan interferir en el procedimiento.
El método de valoración potenciométrica validado para la determinación
cuantitativa de N-amínico en hidrolizados proteicos de microalgas
resultó lineal en la región estudiada, es exacto, preciso y específico,
lo que garantiza la obtención de resultados fiables. A diferencia de los
otros métodos citados en la introducción, la técnica es simple y rápida
y no requiere de grandes cantidades de reactivos y muestras, por lo que
puede ser aplicado en el control de la calidad de los lotes hidrolizados
proteicos obtenidos en nuestros laboratorios.

Summary
The system of assessment of amino acids or of amino acid mixtures in the
presence of an excess of formaldehyde is used as an analytical method to
monitor the formation of free amino acids during protein hydrolysis. The
potentiometric method of assessment with formaldehyde (USP XXIV, 2000)
was validated for the quantitative determination of aminic nitrogen in
protein hydrolysates from Chlorella vulgaris microalga. The following
parameters were evaluated taking into account the classification of the
method: lineality, accuracy, exactitude and specificity. The technique
is reliable, since it is not affected by interferences caused by other
substances present in the hydrolysate. Besides, the statistical
processing of the data proved the lineality, accuracy and exactitude of
the method. As the validated procedure is simple and rapid, it may be
applied to the quantification of aminic nitrogen in batches of protein
hydrolysate obtained in our laboratories.
Subject headings: POTENTIOMETRY; AMINO ACIDS/analysis;
NITROGEN//analysis; ALGAE, GREEN; PROTEIN HYDROLYSATES/analysis; PROTEIN
HYDROLYSATES/therapeutic use; CHLORELLA; DIET THERAPY; BIOTECHNOLOGY.

Referencias bibliográficas
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Recibido: 2 de octubre del 2001. Aprobado: 14 de noviembre del 2001.
M.Sc. Humberto Joaquín Morris Quevedo. Agramonte No. 58, entre Veteranos
y Correoso, El Cristo, Santiago de Cuba, CP 94310, Cuba.

1 Master en Bioquímica de la Nutrición. Investigador Agregado. Centro de


Estudios de Biotecnología Industrial, Universidad de Oriente.
2 Licenciado en Química. Aspirante a Investigador. División de
Biotecnología Solar. Centro de Investigaciones de Energía Solar.
3 Licenciada en Farmacia. División de Biotecnología Solar. Centro de
Investigaciones de Energía Solar. <#autor>

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