Laboratorio de Virología Molecular

Universidad de la República
Regional Norte
Salto

REOVIRIDAE

Fernando López Tort

fernandolopeztort@gmail.com
GENOMA FORMADO POR SEGMENTOS DE ARN DOBLE CADENA
FAMILIAS VIRALES CON GENOMA ARN DOBLE HEBRA (ADNdh)

Mertens, 2004
FAMILIA REOVIRIDAE: 12 GENEROS

Mertens, 2004
Familia: Reoviridae

Genero: Rotavirus

Serogrupo: Rotavirus del grupo A

Barth, 2006
 GASTROENTERITIS

Definición: variedad de estados patológicos del tracto gastrointestinal – Inflamación

Causa principal: agentes infecciosos que invaden la mucosa (virus, bacterias y parásitos).

Manifestación principal: diarrea, que puede venir acompañada de náusea, vomito, fiebre y
dolor abdominal; y en algunos casos hay presencia de moco con sangre.

Principal causa de internación y/o mortalidad: Gastroenteritis Aguda (GA) o Diarrea Aguda
(DA).
GA x virus x bactérias x parasitos mismas manifestaciones clínicas

Diagnostico Laboratorial

Fueron las técnicas de ME y Biología Molecular que demostraron

la real importancia de las Gastroenteritis de etiología viral
 GASTROENTERITIS
MORBIDAD Y MORTALIDAD EN NIÑOS MENORES DE 5 AÑOS / AÑO

2 billones de casos
111 millones de casos domiciliares
25 millones de asisténcias médicas

18 millones de hospitalizaciones
1.8 millones de muertes

40 - 60% de los casos estan asociados a infecciones virales

Aho et al., 2000; Mitchell, 2002; Kosek, 2003; Parashar et al., 2003 ; WHO 2005
 GASTROENTERITIS

Diarreas son la 3er causa principal de muerte en niños menores de 5 años de

edad en todo el mundo

Bryce et al. 2005

 GASTROENTERITIS

Agentes de Gastroenteritis
aguda

Bactérias Parasitos Virus

 GASTROENTERITIS DE ETIOLOGÍA VIRAL
Virus Asociados a la Gastroenteritis Aguda
Rotavírus

Adenovírus
Norovírus Entericos

Astrovírus

Otros virus:

Coronavirus Bredavirus Bocavirus

(Torovirus)
 METAGENÓMICA
40% casos de GA – ag. etiológico desc.

Análisis Metagenómico (intestino, mat. fecal diarrea):

Co-infección, nuevos genotipos, nuevos virus entéricos!!

COMUNIDAD VIRAL: Aichivirus, Picobirnavirus, Anellovirus (TTV), Sapovirus, Nuevos

Picornavirus (Parechoviruses, Cardiovirus, Cosavirus), Enterovirus (Coxaki), Nodavirus
(peces), Circovirus (porcino), Dicistrovirus (insectos), virus de vegetales, ...

¿Estos nuevos virus entéricos están implicados en la etiología de la diarrea humana?

Breitbart et al., 2003; Zhang et al., 2006; Finkbeiner et al., 2008; Victoria et al., 2009
 ENFERMEDAD: ROTAVIROSIS
Causa mas común de diarrea
severa infantil
Principales Síntomas
Diarrea
Vomito
Fiebre
Deshidratación
Shock
Muerte

- Transmisión fecal-oral
- Diarrea aguda: tres o mas evacuaciones liquidas/semi-liquidas, en un período de 24 horas y
con menos de 14 días de duración
- Dosis infectante: 10 partículas
- Eliminación: 1 trillón de partículas infectantes / gr materia fecal
- Período de incubación: 1 a 3 días
- Duración media de la diarrea: 4 a 7 días
- Edad de infección: 0-5 años (4 a 24 meses mayor gravedad)
 ENFERMEDAD: ROTAVIROSIS

Enfermedad por Rotavirus: incidencia y riesgo

(Glass et al. 2006)
 ENFERMEDAD: ROTAVIROSIS
Distribución mundial estimada de las 600.000 muertes anuales
provocadas por la infección de Rotavirus

1 punto = 1000 muertes

Parashar et al., 2006

 ENFERMEDAD: ROTAVIROSIS
Países Desarrollados Países Subdesarrollados

Parásitos Desconocido

Desconocido Rotavirus Otras Rotavirus

bacterias

Escherichia
coli

Bacteria Adenovirus Adenovirus

Astrovirus Calicivirus Astrovirus Calicivirus
La incidencia de la enfermedad provocada por Rotavirus es similar en
países en desarrollo como en países desarrollados
Mejoras en las condiciones sanitarias no reduce significativamente la incidencia de la
enfermedad – RESPONSABLE DE 39% DE HOSPITALIZACIONES POR DIARREA
INDEPENDIENTEMENTE DEL NIVEL ECONOMICO DEL PAIS!

NECESIDAD DE VACUNAS PARA PREVENIR CASOS DE GA!!

POR LO CUAL, ES IMPRECINDIBLE ESTUDIAR LOS ASPECTOS EPIDEMIOLOGICOS Y

MOLECULARES DE LOS ROTAVIRUS CIRCULANTES
Kapikian & Chanock, 2003; Chandran et al., 2010
 HISTORIA

 1973: Flewet y col. Primera identificación de RV por ME.

 1977: Linhares y col. Primera detección de RV en América Latina – Rotavirus o
Duovirus?
 1978: Flewet y col. Proponen nuevo genero dentro de la familia Reoviridae, los
Rotavirus.

Nombre derivado del latin “Rota: rueda”,

aspecto de rueda de la partícula viral
observada por ME utilizando contrastación
negativa

Barth, 2006
 MORFOLOGÍA

70-100nm de diámetro

Sin envoltura lipídica

Simetría icosaédrica

Virión: Tres cubiertas proteicas

(Core, Cápside interna y
Cápside externa)

Genoma: ARN doble hebra

segmentado, 11 segmentos
genómicos, 667pb (seg. 11) –
3.302pb (seg. 1)
Modificado de Estes, 2001
Proteínas: 6 estructurales (VPs) (1 a 6)
6 no-estructurales (NSPs) (1 a 6)
 MORFOLOGÍA

Pesavento et al., 2001; Jayaram et al., 2004

 MORFOLOGÍA

Adaptada de Estes (2001)

ARNmv: - CAP en el extremo 5´

- No existe poli-A en el extremo 3´ (motivo de unión

a NSP3)

- Traducción via mecanismo de formación de loop,

unión ext. 5´ y 3´.
 REPLICACIÓN

Citoplasma
Replicación en citoplasma de los enterocitos maduros del tercio apical de las
microvellosidades del intestino delgado
Modificado de Lopez, 200
REPLICACIÓN

ADSORCIÓN
 REPLICACIÓN
VP4
ADSORCIÓN
VP7

Receptor celular – ÁCIDO SIÁLICO

VP4 clivada en VP8* y VP5* por proteasa celular Tripsina
VP8*- ác. Sialico (inicialmente), VP5* (lipofílica) - Integrinas (pasos posteriores)
VP7 también interviene: modula adsorción de VP4, interacción con otras prots. cel.

Lopez & Arias, 2004

 REPLICACIÓN
DLPs y transcripción
endógena del genoma

Citoplasma

Modificado de Lopez, 2008

 REPLICACIÓN
VP6 DLPs y transcripción
endógena del genoma

DLPs: forma transcripcionalmente activa, transcripción de ARNdh que se encuentra dentro

de la partícula

Luego de la penetración, perdida de cápside externa dejando DLP expuesta al citoplasma

Concentración baja de calcio del citosol favorece la disociación de trímeros de VP7

VP7 es la clave para mediar este desnudamiento mediado por calcio dejando DLP activa
trancripcionalmente.
Lawton et al., 1997
REPLICACIÓN

VIROPLASMA

Citoplasma

Modificado de Lopez, 2008

 REPLICACIÓN
VIROPLASMA

Cuerpos de inclusión citoplasmáticos

Donde ocurre: ensamblaje del Core, replicación y encapsidación del genoma y

posiblemente de transcripción viral – procesos que aun no se conocen completamente

NSP2 y NSP5 inducen su formación, “reclutan” a las otras proteínas virales (NSP2 se une
a VP1, y NSP5 a VP2), y a los segmentos de ARNdh para su replicación

Fabbretti et al., 1999; Jayaram et al., 2002

 REPLICACIÓN
MORFOGENESIS,
FORMACIÓN DE TLPs Y
EGRESO

Citoplasma

Modificado de Lopez, 2008

PATOLOGIA

Infección limitada a la mucosa

gastrointestinal

Infección y daño de enterocítos maduros de

las microvellosidades intestinales
 PATOLOGÍA – NSP4

La replicación de RV adentro de los enterocitos altera el metabolismo de estos

provocando mala absorción intestinal y diarrea osmótica.
La progenie viral de RV egresa de los enterocitos que infectaron provocando LISIS
CELULAR
 La NSP4 aumenta la concentración de calcio intracelular, lo que altera el citoesqueleto y
las uniones celulares, aumentando la permeabilidad de las células.
La NSP4 induce la diarrea a través del aumento del calcio intracelular, y además produce
una estimulación del sistema nervioso entérico que induce diarrea secretora y aumenta la
movilidad intestinal.
Angel et al., 2007
 PATOLOGÍA – NSP4
 Proteína multifuncional

 Segmento 10

• Receptor intracelular – VP6 (DLPs) y VP4 (DLPs

con envoltura transitoria) - Morfogenesis viral

• Mecanismo de patogénesis: NSP4 desestabiliza

la membrana del RE provocando lisis del mismo,
Aumento de Ca++ intracelular, Secreción de iones Cl-,
Diarrea secretoria

• Activa canales dependientes de Ca++ en el Intestino

• 1er Enterotoxina Viral descripta >>> Residuo tóxico 114-135

• Posee propiedades imunogenicas, siendo capaz de inducir una respuesta inmune

eficiente

• Todos los estudios basados en los mecanismos que envuelven a la NSP4 de los
rotavirus pueden contribuir para la elaboración de estrategias capaces de amenizar la
gravedad de la enfermedad.
Bowman et al., 2000; Ball et al., 2005; Lopez et al., 2005
 OTROS MECANISMOS MOLECULARES DE RV

Los RV provocan la detención de la síntesis proteica de la célula – SHUT-OFF CELULAR

Proteína NSP3 compite con

“Poli-A binding protein
(PABP)” por la unión al factor
de inicio de la traducción
eIF4G1 – NSP3 se une con
mayor afinidad al eIF4G1 –
complejo NSP3-eIF4G1 se
une a extremo 3' de ARNmv y
favorece su traducción frente
a la traducción de los ARNm
celulares
(Prion et al., 1998; Prion et al., 1999;
Deo et al., 2002) Modificado de Prion et al., 1998

Los rotavirus inhiben síntesis de IFN-1 (alfa) durante infección por medio de degradación
de IRFs

Proteína NSP1 inhibe expresión de IFN-1 mediante degradación de

“Interferon Regulatory Factors (IRFs)” – degradación de IRF-3, IRF-5 e IRF-7
vía proteosoma
(Barro & Patton, 2005; Barro & Patton, 2007)
 CLASIFICACIÓN
CLASIFICACIÓN ANTIGÉNICA / Proteína VP6
En base a determinantes antigénicos presentes en VP6 – GRUPOS
En grupo A, en base a presencia o ausencia de epítopos presentes en VP6 – SUBGRUPOS

I
II
A 4 SUBGRUPOS
noI +noII
B
I + II
C
7 GRUPOS D
E VP6
F
G
 CLASIFICACIÓN
CLASIFICACIÓN ANTIGÉNICA / Proteínas VP4 y VP7
En base a determinantes antigénicos presentes en VP7 – SEROTÍPOS “G”
En base a determinantes antigénicos presentes en VP4 – SEROTÍPOS “P”

Segmentos Segmentos
genómicos genómicos
21 1
2
3 3
4 4

5 5
6 6

7 SEROTIPOS P 7 SEROTIPOS G
8 8
9 9
“P” de sensible “G” de Glicoproteína
10 a Proteasa 10

11 11
 CLASIFICACIÓN
CLASIFICACIÓN GENÉTICA / Electroferotípos
De acuerdo a “perfiles electroforéticos” de los segmentos genómicos de ARNdh en PAGE

ELETROFEROTIPOS DE ROTAVIRUS REARREGLO DE SEGMENTO ARNdh

Perfil: Largo, Corto o Supercorto – migración

de segmentos 10 y 11
Laemmli, 1970; Pereira et al., 1983
 CLASIFICACIÓN
CLASIFICACIÓN GENÉTICA / Genotipos G y P[ ]
SISTEMA DE CLASIFICACIÓN BINARIA PARA LOS ROTAVIRUS DEL GRUPO A
De acuerdo a variaciones en la secuencia de los genes de VP4 (P[ ]) y VP7 (G)

genotipos G: 23 Genotipos P[ ]: 31

Humanos

Cepas comunes: G1P[8], G3P[8], G4P[8], G9P[8] (recientemente), y G2P[4]

Cepas inusuales: G5, G8, G10, G12, P6, P9, P10

Abe et al., 2009; Solberg et al., 2009; Matthijnssens et al., 2008; Schumann et al., 2009; Ursu et al., 2009
 CLASIFICACIÓN
CLASIFICACIÓN GENÉTICA / Genoma completo (2008)
De acuerdo a variaciones en la secuencia de todos los genes de RV-A

Fueron secuenciados los genomas completos de 53 cepas prototipos de RV humanos y

animales!!
 CLASIFICACIÓN
CLASIFICACIÓN GENÉTICA / Genoma completo (2008)

Gx-P[x]-Ix-Rx-Cx-Mx-Ax-Nx-Tx-Ex-Hx

VP7-VP4-VP6-VP1-VP2-VP3-NSP1-NSP2-NSP3-NSP4-NSP5/6

Matthijnssens et al., 2008

 CLASIFICACIÓN
CLASIFICACIÓN GENÉTICA / Genoma completo (2008)

RCWG = Rotavirus Clasification Working Group

(Especialistas en: virologia molecular, infectología, epidemiología y salud pública)

Matthijnssens et al., 2008

MECANISMOS DE EVOLUCIÓN MOLECULAR

1. Mutación puntual

2. Recombinación genética

3. Reestructuración de segmentos (Reassortments)

4. Rearreglos genéticos (Rearrangements)

 MECANISMOS DE EVOLUCIÓN MOLECULAR
1. Mutación Puntual – Variabilidad Intragenotípica
G2

Araujo et al., 2007

G1

Araujo et al., 2007

Araujo et al., 2007 Phan et al., 2007
 MECANISMOS DE EVOLUCIÓN MOLECULAR

2. Recombinación Genética – Inter e Intragenotípica

RV-A G1 RV-A G9 G1 con G3

Co-infecção
G4: sublinajes Ib con Ic
Recombinação genética
Replicação
viral
Segmento
recombinado

G1 con G9

Progênie viral com segmento

recombinado G1-G9

G1: linajes y sublinajes

 MECANISMOS DE EVOLUCIÓN MOLECULAR

3. Rearreglos Genéticos – Rearrangements

Partial head-to-tail duplication

 Inicialmente solamente descriptos en inmunodeprimidos (HIV)

 Mayoría registrados en los genes NSP1 y NSP5, también en NSP3

 Recientemente, Schnepf y colaboradores (2008) descrivierón rearreglos em pacientes

imunocompetentes.
 MECANISMOS DE EVOLUCIÓN MOLECULAR
4. Reassortments – Nuevos genotipos, transmisión interespécie
Reassortment
Humano–Animal

RV-A RV-A
humano animal

Co-infecção

Reassortment de um
segmento
Replicação e
morfogênese
viral

Infecciones
Progênie viral de RV-A com mixtas
Reassortment Humano-animal

Más frecuentes en  Condiciones de higiene y salud precarias. y mayor

 defensas inmunológicas limitadas. probabilidad de
países desarrollados. que estos
 estrecho relacionamiento hombre-animal eventos ocurran
MECANISMOS DE EVOLUCIÓN MOLECULAR
Transmisión interespécie

Humanos Animales
 MECANISMOS DE EVOLUCIÓN MOLECULAR
Reassortment y Transmisión Interespécie

La transmisión interespécie es más frecuente en países en desarrollo debido a las precarias

condiciones de saneamiento básico e higiene, defensas inmunes bajas (infecciones de parásitos,
desnutrición) y el relacionamiento cercano entre el hombre y animales domésticos y salvajes (suínos,
bovinos, ovinos, conejos, gallinas, gatos, perros, etc) aumentando la probabilidad de infecciones mixtas,
aumentando a probabilidad de eventos Reassortment.

1) Infección heterologa (virión entero de animal a humano) – menos común

1) Reassortment humano-animal durante coinfección – la mas común

Reassortments
 DIAGNOSTICO
 Microscopia electrónica (ME) o Inmunomicroscopia electrónica (IME)

 Cultivo celular: MA-104, VERO

 Serología – EIE (Ensayo Inmunoenzimatico): anticuerpos policlonales o monoclonales dirigidos

al antígeno común de grupo (VP6)

 PAGE (EGPA: Electroforesis en Gel de Poliacrilamida)

 Hibridización (“dot-blot”) de ARNdh genómico con sondas moleculares

 Genotipaje – RT-PCR: clasificación binaria de RV, determinación de genotipos G y P

 Genotipaje – por secuenciación parcial de los genes VP4 y VP7 – clasificación binaria
 EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR
 Por año globalmente : - 111 millones de episodios de GA
- 25 millones de consultas
- 2 millones de hospitalizaciones
- 527.000 muertes (85% ocurre en países en subdesarrollados)
 Amplia distribución mundial
 Cuadro de GA infantil: - Epidémico en regiones de clima templado.
- Endémico en regiones de clima tropical.
 Sazonalidad: - Regiones de clima templado, brotes y epidemias en los meses más
frio y secos del año.
- Regiones de clima tropical, infecciones por RV-A durante todo el año.
 Diferentes genotipos G y P pueden co-circular en una misma región y el genotipo prevalente en una
región pude cambiar anualmente.
 El genotipo prevalente en una región puede variar en intervalos de 1-3 años, probablemente como
resultado de la acumulación progresiva de individuos inmunes.
 Son cinco los genotipos más comúnmente detectados en el mundo: G1P[8], G2P[4], G3P[8], G4P[8] y
G9P[8]

Para la edad de 5 años casi todos los niños han cursado una infección por RV
1 de 65 será hospitalizado
1 de 293 morirá
Cada minuto, un niño muere debido a Rotavirus

CDC: rotavirus surveillance – worldwide, 2001-2008. Morb Mortal Wkly Rep

 EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR
Países Desarrollados Países Subdesarrollados

Parásitos Desconocido

Desconocido Rotavirus Otras Rotavirus

bacterias

Escherichia
coli

Bacteria Adenovirus Adenovirus

Astrovirus Calicivirus Astrovirus Calicivirus
La incidencia de la enfermedad provocada por Rotavirus es similar en
países en desarrollo como en países desarrollados
Mejoras en las condiciones sanitarias no reduce significativamente la incidencia de la
enfermedad – RESPONSABLE DE 39% DE HOSPITALIZACIONES POR DIARREA
INDEPENDIENTEMENTE DEL NIVEL ECONOMICO DEL PAIS!

NECESIDAD DE VACUNAS PARA PREVENIR CASOS DE GA!!

POR LO CUAL, ES IMPRECINDIBLE ESTUDIAR LOS ASPECTOS EPIDEMIOLOGICOS Y

MOLECULARES DE LOS ROTAVIRUS CIRCULANTES
Kapikian & Chanock, 2003; Chandran et al., 2010
 EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR
GENOTIPOS DE ROTAVIRUS CIRCULANDO EN LOS DIFERENTES CONTINENTES

Santos & Hoshino, 2005

• Diversidad de cepas circulantes:

PAISES SUBDESARROLLOADOS > PAISES DESARROLLADOS

TRATAMIENTO Y PREVENCIÓN

•Transmisión oro - fecal

 TRATAMIENTO Y PREVENCIÓN
• 1970s – OMS recomienda uso de Soluciones de Rehidratación Oral (SRO) para casos de
internación por GA con cuadro de deshidratación – ESTA SOLUCIÓN SALVO MILLONES DE
VIDAS!

• En casos de niños que no estén completamente consientes o no puedan beber la SRO, se

recomiendo el uso de hidratación intravenosa, con la introducción de SRO tan pronto como sea
posible.

• En la década de los 70s la comunidad medica creía que la alimentación durante un cuadro de
diarrea era dañina para el paciente, se debía dejar “descansar el intestino”. En los 80s diferentes
estudios mostraron que la alimentación continua durante una diarrea es segura y mejora el
resultado del tratamiento.

• Uso de Zinc en SRO mejora la respuesta inmune y el proceso de curación, OMS recomienda el
uso de Zinc junto con SRO en el tratamiento de diarrea aguda, durante 10 a 14 días.

• Uso de antibióticos no tiene ningún efecto benéfico en el tratamiento de GA provocada por RV.

• Uso de drogas con efecto antimovilidad (ej. Loperamida) o antisecreción (ej. Racecadotril)
intestinal, o agentes de unión a toxinas, no se recomienda en casos de pacientes pediátricos.

• Mejor forma de prevención de Rotavirosis es la vacunación. Mejora en condiciones de

higiene no previene la enfermedad significativamente.

Chandran et al., 2010

 VACUNAS

Vacunas contra RV-A - Estratégias de desarrollo

 Estratégia Jenneriana Monovalente – Virus atenuados de animales

- Bovino (RIT 4237, WC3)

- Ovino (LLR)

 Estratégia Jenneriana Modificada – Virus reestruturados Humano-Animal – Multivalente

- Rhesus-humano (Wyeth, RotaShield™) Tetravalente (G1, G2, G3 e G4)

- Bovino-humano (Merck, Rotateq™) Pentavalente (G1, G2, G3, G4 e P[8])

 Vacunas de origen humana – Virus atenuado de origen humano – Monovalente

- Muestra 89-12 / clone RIX4414 (GSK, Rotarix™) Genótipo G1P[8]

 VACUNAS

Phase I Phase II Phase III Licensed

Wyeth RotashieldTM
Ayerst
Lanzhou
Institute LLR
of Biological
Products, China
Rotateq®
MSD G1-4P[8]

GSK Rotarix®
G1P[8]
University of RV3
Melbourne, G3P[6]
Australia
US National UK-
Institutes of reassortant
Health strain
Neonatal
Bharat strains
Biotech Ltd, 116E
India and I132

Glass et al., 2004

 VACUNAS

Wyeth Ayerst - Rota Shield

•Rhesus-Humano ( vacuna Tetravalente)

•Licenciada por la FDA en Agosto de 1998

•Retirada del mercado en Octubre de 1999 devido al

surgimento de casos de “intusucepción”
 VACUNAS
INTUSUCEPCIÓN

- Invaginación intestinal, generalmente del intestino delgado en el grueso, con clínica de

obstrucción intestinal

- Ocurre en lactantes entre el 2do y 3ero trimestre de vida

- Debe ser tratada quirúrgicamente

VACUNAS
 VACUNAS

• Todas las vacunas han demostrado ser eficaces en:

- Reducir los casos de mortalidad por GA provocada por RV-A

- Reducir casos graves de GA provocada por RV-A – Hospitalización

- Seguridad - Intususcepción intestinal

- Protección para genotipos predominantes

- Reducir impacto Socio-Económico – Costo / Efectividad

- Viabilidad operacional – vio oral de inmunización

 CONSIDERACIONES FINALES

Si pudiéramos prevenir rotavirus:

Salvaríamos la vida de 1,400 niños/día
Ahorraríamos a nuestros países preciosos recursos humanos y económicos.

RotarixTM RotaTeqTM
 Laboratorio de Virología Molecular
Universidad de la República
Regional Norte
Salto

MUCHAS GRACIAS POR LA ATENCIÓN!!