INTRODUÇÃO

Bioquímica possui, como objetivo básico, mostrar como moléculas destituídas de

vida conseguem interagir entre si perpetuar a vida como se conhece,isto é,
mostrar em termos químicos a vida em suas diferentes formas
As proteínas são as moléculas orgânicas mais abundantes e importantes
nas células e perfazem 50% ou mais de seu peso seco. São encontradas em
todas as partes de todas as células, uma vez que são fundamentais sob todos os
aspectos da estrutura e função celulares. Existem muitas espécies diferentes de
proteínas, cada especializada para uma função biológica diversa. Alem disso, a
maior parte da informação genética expressa pelas proteínas. Pertencem a classe
dos peptídeos, pois são formadas por aminoácidos ligados entre si por ligações
peptídicas. Uma ligação peptídica é a união do grupo amino e de um aminoácido
com o grupo carboxila de outro aminoácido, atiravas da formação de uma amida.
São os constituintes básicos da vida. Nos animais, as proteínas correspondem a
cerca de 80% do peso dos músculos desidratados, cerca de 70% da pele e 90%
do sangue seco. Mesmo nos vegetais as proteínas estão presentes. As
importâncias das proteínas, entretanto, estão relacionadas com sua função no
organismo, e não com sua quantidade. Todas as enzimas conhecidas, por
exemplo, são proteínas; muitas vezes, as enzimas existem em porções muito
pequenas. Mesmo assim, estas substâncias catalisam todas as reações
metabólicas e capacitam aos organismos à construção de outras moléculas -
proteínas, Ácidos nucléicos, carboidratos e lipídios - que são necessárias para a
vida. O estudo de aspectos importantes da bioquímica nos leva, invariavelmente,
ao estudo de proteínas. A purificão e caracterização de uma proteína baseiam-se
em suas características físico-químicas. Reações de coloração de proteínas
devido as suas ligações peptídicas e a presença de diferentes aminoácidos, as
proteínas reagem com uma variedade de reagentes, formando produtos coloridos.
Algumas reações de coloração são específicas para aminoácidos encontrados na
composição das proteínas, por exemplo, reação com ninhidrina, reação com
biureto e a precipitação de proteínas.

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A ninhidrina é um poderoso agente oxidante que reage com aminoácidos, entre pH 4 e
8, originando um composto de cor púrpura, que não apresenta sempre a mesma
intensidade de coloração. Os aminoácidos prolina e hidroxiprolina são exceções, pois
apresentam coloração amarela. Reações do Bureto são devidas as ligações peptídicas,
dando positiva para proteínas e peptídeos com três ou mais resultados de aminoácidos. A
reação são também positiva para as substâncias que contem dois grupos carbônicos
ligados diretamente ou através de um átomo de carbono ou nitrogênio. Este é o caso do
biureto que reage positiva e de onde provem o nome da mesma. As proteínas ou
peptídeos, quando tratados por uma solução de sulfato de cobre, em meio alcalino, dão
uma coloração violeta caracterÃstica. Precipitação de ProteÃnas com
Desnaturação As proteÃnas possuem uma estrutura tridimensional bem definida que
está relacionada com suas propriedades fÃsicas e biológicas. A modificação na
estrutura tridimensional nativa de uma proteÃna, com a conseqüente alteração de
suas propriedades é conhecida como desnaturação. A desnaturação envolve
alterações nas estruturas quaternária, terciária e secundária de proteÃnas, mas
não da primária. A desnaturação, usualmente decresce a solubilidade das proteÃ-
nas. A diminuição da solubilidade pode ser explicada pela exposição de radicais
hidrofóbicos e outros que prejudiquem a interação proteÃna-água e favoreçam a
interação proteÃna-proteÃna. A desnaturação é o evento primário e importante.
A floculação e a coagulação, que muitas vezes são confundidos com
desnaturação de proteÃnas, são simplesmente manifestações visÃveis das
alterações estruturais causadas pelos agentes desnaturantes. Existem vários agentes
desnaturantes de proteÃnas, tais como: calor, ácidos, álcalis, solventes orgânicos,
soluções concentradas de uréia e guanidina, detergentes, sais de metais pesados,
etc. Entre as alterações que se observam em decorrência da desnaturação
protéica, pode-se citar: diminuição da solubilidade, perda de atividade biológica (por
exemplo, da ação enzimática, da ação hormonal), aumento da reatividade de
radicais da cadeia polipeptÃdica, alterações na viscosidade e coeficiente de
sedimentação, etc. A precipitação com desnaturação, além de serem utilizadas
para caraterizar a presença de proteÃnas em solução, também são úteis para
proceder a desprotenização de lÃquidos biológicos para análise de componentes
não protéicos.

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Precipitação por Ação do Calor A estrutura terciária de uma proteÃna é mantida
por interações hidrofóbicas entre os radicais apolares que se abrigam no meio
aquoso, procurando se agruparem no interior do glóbulo protéico, pelas atrações
iônicas entre os radicais carregados com cargas opostas, pelas pontes dissulfeto, pontes
de hidrogênio, interações hidrofóbicas ou ainda pelas Forças de Van der Waals. Ao
fornecer energia a um meio aquoso contendo proteÃnas, atrações entre os radicais
são desfeitas e a proteÃna é "desenrolada", expondo, ao meio aquoso seus radicais
apolares que estavam contidos no seu interior. Isto é que leva à desnaturação.
Precipitação por reação com os reagentes para alcalóides Determinados agentes,
como os reagentes para alcalóides podem ser usados na precipitação de proteÃnas,
o que é útil na desproteinização de materiais biológicos, como o sangue: ânions
de ácidos complexos (tricloroacético, tânico, fosfotúngstico) formam sais insolúveis
onde a proteÃna funciona como cátion. Precipitação por Reação com Sais de
Metais Pesados A adição de sais de metais pesados, tais como mercúrio, chumbo,
cobre e zinco, levam à formação de sais denominados "quelatos" entre os
aminoácidos ácidos e estes metais. A proteÃna precipita porque estes sais são
insolúveis em água e também porque, com a quebra das ligações iônicas, os
aminoácidos hidrofóbicos ficam mais expostos ao meio aquoso. Precipitação por
Ação de Solventes Orgânicos A adição de solventes orgânicos, como o etanol,
éter etÃlico e acetona, à s soluções aquosas de proteÃnas pode levar Ã
precipitação das mesmas. Isto pode ser explicado pelo fato destes solventes
apresentarem uma constante dielétrica inferior à da água. Solventes orgânicos em
baixas temperaturas (0º C ou menos) são úteis para a separação de misturas
protéicas, porque as proteÃnas podem ser precipitadas sem sofrerem desnaturação.
Entretanto, a temperatura mais elevada, os solventes orgânicos podem levar Ã
desnaturação por romperem pontes de hidrogênio e interações apolares,
importantes na manutenção da conformação protéica. A água tem uma alta
constante dielétrica, assim a força de atração entre moléculas protéicas
contendo radicais com cargas opostas é baixa, predominando a interação proteÃna-
água em vez da interação proteÃna-proteÃna. A adição de solventes, pode
inverter esta situação, levando à agregação e precipitação das moléculas
protéicas.

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Solubilização (Salting In) Efeito da Força Iônica sobre a Solubilidade das ProteÃnas
A capacidade dos sais neutros de influenciar a solubilidade das proteÃnas, é uma
função de sua força iônica, que tanto depende de sua concentração como na
valência de cátions e ânions que formam o sal. Em concentração reduzida, os sais
aumentam a solubilidade de muitas proteÃnas, um fenômeno denominado â œsalting-
inâ , provavelmente devido à interação da proteÃna com os sais causando
diminuição da interação proteÃna-proteÃna e, portanto, aumentando a solubilidade.
Precipitação (Salting Out) Reações de Precipitação sem Desnaturação As
proteÃnas podem ser precipitadas sem sofrer desnaturação por ação de solventes
orgânicos, como foi explicado anteriormente, variação do pH e por alterações da
força iônica do meio. A variação do pH pode ser usada para precipitar proteÃnas no
seu ponto isoelétrico, pH no qual a repulsão eletrostática entre as moléculas é
mÃnima. Este efeito é denominado de â œsaltingoutâ . As proteÃnas podem ser
ressolubilizadas mantendo as suas caracterÃsticas estruturais nativas por uma
variação de pH acima ou abaixo do ponto isoelétrico.

2. OBJETIVOS â ¢ Caracterizar a presença de proteÃnas em material biológico. â ¢

Verificar experimentalmente a precipitação de proteÃnas com e sem desnaturação.
⠢ Relacionar as observações práticas com a teoria de propriedades gerais,
estrutura e isolamento de proteÃnas.

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3. MATERIAIS UTILIZADOS E METODOLOGIAS Experimento 01 - Reações de
Coloração de ProteÃnas Reação da ninhidrina Inicialmente, numerou-se dois tubos
de ensaio, acrescentando-se no primeiro 2ml de solução de ninhidrina com 5 gotas de
proteÃnas. Enquanto que no segundo tubo, foram colocadas 2ml de solução de
ninhidrina com 5 gotas de glicina. Ambos os tubos foram aquecidos na chama do bico de
bunsen por dois minutos com agitação contÃnua. Reação do biureto Foram
numerados três tubos de ensaio, sendo que no primeiro colocou-se 1ml de solução de
proteÃnas, 5 gotas de NaOH, 2,5M e 3 gotas de sulfato de cobre 1%. Enquanto que no
segundo acrescentou-se 1ml de solução de glicina com 5 gotas de NaOH 2,5M e 3
gotas de sulfato de cobre 1%. Já no terceiro tubo, misturou-se água destilada com 5
gotas de NaOH 2,5M e 3 gotas de sulfato de cobre 1%. Em todos os tubos foi observada
a mudança de coloração das soluções.

Experimento 02 â ³ Reações de precipitação de proteÃnas com desnaturação

Reação de precipitação por aquecimento Colocou-se 2ml de solução de proteÃ-
nas em um tubo de ensaio que foi aquecido diretamente na chama. Reação de
precipitação com reagentes para alcalóides Em um tubo de ensaio, colocou-se 1ml de
solução de proteÃnas e de ácido tricloroacético a 10% (TCA). Reação de
precipitação com sais de metais pesados Adicionou-se 1ml de solução de proteÃ-
nas e 1ml de acetato de chumbo a 5%. Reação de precipitação por ação de
solventes orgânicos Em um tubo de ensaio acrescentou-se 1mL de solução de
proteÃna e 2mL de álcool etÃlico.

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Experimento 03 ⠳ Reações de precipitação sem desnaturação Efeito da força
iônica sobre a solubilidade da ovoglobulina â œSalting â ³ inâ Colocou-se 3mL de
clara de ovo juntamente com 2mL de água destilada em um béquer pequeno. Tal
solução foi agitada com um bastão de vidro até o aparecimento de um precipitado .
Em seguida, adicionou ⠳ se solução de cloreto de sódio ⠳ cerca de 30 gotas -
até redissolução do precipitado. â œSalting â ³ outâ Com o auxÃlio de uma
pipeta adicionou-se 2mL da solução anterior (â œsalting â ³ inâ ) em um tubo de
ensaio. Posteriormente, acrescentou-se 2mL de solução saturada de sulfato de
amônio até a percepção de um precipitado de proteÃnas. Então, juntou-se 4 a
6mL de água destilada.

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4. RESULTADOS E DISCUSSÇES

Experimento 01 â ³ Reações de coloração de proteÃnas Reação da ninhidrina

Após o aquecimento de ambos os tubos de ensaio, observou-se que as soluções
adquiriram coloração violeta, sendo esta mais intensa no segundo tubo. Tendo em
vista que tanto a glicina quanto a proteÃna foram utilizadas com o mesmo volume, a
diferença na intensidade da coloração de ambas as amostras deve-se a maior
superfÃcie de contato do aminoácido (glicina) que contém uma maior quantidade de
grupamentos amina disponÃveis para reação. Porém, isso não ocorre com a
proteÃna em função da presença de ligações peptÃdicas entre seus
aminoácidos, diminuindo assim, sua superfÃcie de contato. ÃÅ importante ressaltar que
houve erro grosseiro no fornecimento de calor aos tubos o que possivelmente influenciou
a intensidade da cor. Reação do biureto Todos os tubos tiveram sua coloração
inicial alterada após a adição de sulfato de cobre (CuSO4). O primeiro tubo adquiriu
coloração púrpura; o segundo, azul claro e o terceiro adquiriu um tom levemente
azulado. Uma vez que a reação do biureto é caracterizada por identificar a
presença de proteÃnas e peptÃdeos com três ou mais resÃduos de aminoácidos, no
qual uma substância adicionada, o sulfato de cobre, interage com as ligações peptÃ-
dicas ,pode-se concluir que a primeira amostra adquire coloração púrpura, devido a
presença de proteÃnas. Já a segunda amostra, por conter somente aminoácidos,
não adquire coloração roxa, indicando assim a ausência de ligações peptÃdicas
nessa, a qual apresenta coloração azulada semelhante à terceira amostra que
continha água destilada.

Experimento 02 â ³ Reações de precipitação de proteÃnas com desnaturação

Reação de precipitação por aquecimento Colocou-se 2ml de solução de proteÃ-
nas em um tubo de ensaio que foi aquecido diretamente na chama. Nesse experimento, a
formação do coágulo branco ocorre graças ao calor que, ao provocar a
Presidente Prudente, 24 de março de 2010 8
agitação térmica da molécula protéica, rompe as interações entre os átomos,
afetando sua estrutura tridimensional e consequentemente, diminui a solubilidade da
proteÃna. Reação de precipitação com reagentes para alcalóides Foi possÃvel
identificar a formação de um precipitado esbranquiçado e viscoso grudado na parede
do tubo logo que se adicionou o ácido tricloroacético (TCA). Nesse experimento, o sal
serve como â ×ponte⠌/interage entre a proteÃna e o meio, auxiliando assim, as
interações proteÃna-água. O fato de se adicionar ácido tricloroacético solução
de proteÃnas, reduz o ph do meio, tornando positiva a carga da proteÃna, o que contribui
para a formação de um complexo insolúvel â ³ o tricloroacetato de proteÃna. Além
disso, vale ressaltar que o sal atua como uma ponte entre a proteÃna e o meio.
Adicionando-se o ácido, diminui a concentração de sal e a interação proteÃna-
água. Reação de precipitação com sais de metais pesados Observou-se pequenos
precipitados semelhantes a fios brancos na solução. O acetato de chumbo ,na
solução protéica, dissocia-se, liberando seus cátions e torna o meio alcalino. Essa
caracterÃstica do meio â ³ pH situado no lado alcalino do ponto isoelétrico das proteÃ-
nas - é favorável à combinação de algumas proteÃnas com os cátions do sal,
formando proteinatos insolúveis. Reação de precipitação por ação de solventes
orgânicos Formou-se uma mistura esbranquiçada. A interação proteÃna-água é
maior que a interação proteÃna-proteina devido à baixa força de atração entre as
moléculas protéicas, fazendo com que a proteÃna se solubilize na água. Com a
adição do álcool etÃlico (solvente orgânico) na água, ocorre sua solubilização,
rompendo as interaçoes proteÃna-água, proporcionando a interação proteÃna-
proteÃna; o fato de a temperatura estar elevada (temperatura ambiente) leva à sua
desnaturação devido à quebra das pontes de hidrogênio e interações apolares,
importantes na manutenção da estrutura protéica.

Presidente Prudente, 24 de março de 2010

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Experimento 03 ⠳ Reações de precipitação sem desnaturação Efeito da força
iônica sobre a solubilidade da ovoglobulina â œSalting â ³ inâ : Após agitação da
solução de água destilada e clara de ovo, formou-se um precipitado (globulinas)
semelhantes a pontos brancos na solução. Com a adição de 30 gotas de
solução de cloreto de sódio, houve a redissoluçao desse precipitado. ⠜Salting
â ³ outâ : Formou-se duas fases: a de baixo era esbranquiçada e a de cima,
transparente. Então, após o acréscimo de 4 a 6mL de água destilada houve a
redissolução desse precipitado Tais fenômenos estão relacionados Ã
precipitação da proteÃna sem que ocorra a sua desnaturação. O â œsalting â ³
inâ dá-se pela solubilização do precipitado elevando-se a concentração de sais
no meio e também as interações proteÃna-água. Enquanto o â œsalting â ³ outâ
corresponde à precipitação da proteÃna através da adição de sais com alta
força iônica (sais higroscópicos) que ligam-se a água, havendo a predominância da
interação proteÃna-proteÃna. Nesse caso, analisando-se as duas fases formadas, a
primeira â ³ esbranquiçada â ³ corresponde à s primeiras proteÃnas a se precipitarem,
as globulinas. Já a porção transparente refere-se à água. ÃÅ importante ressaltar
que a precipitação de proteÃnas pela alta concentração de sais é um processo
muito importante para a separação de misturas complexas de proteÃnas, uma vez que
a concentração de sal necessária para precipitar diferentes proteÃnas é variável.

Presidente Prudente, 24 de março de 2010

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5. CONCLUSÃO As reações de coloração e precipitação (com ou sem
desnaturação) de proteÃnas permitem a caracterização dessas pela análise de
suas propriedades quÃmicas e fÃsicas, entre elas, a presença de ligações peptÃ-
dicas, estrutura molecular, solubilidade, força iônica e concentração molar. A
detecção de proteÃnas em materiais biológicos envolve reações especificas com
determinados reativos, os quais originam substâncias coloridas que absorvem luz na
região visÃvel, permitindo a sua quantificação. No entanto, as reações de
coloração não alteram a estrutura tridimensional da proteÃna, ao contrário das
reações de precipitação que podem alterar as estruturas quaternárias, terciárias e
secundárias das proteÃnas como as reações por ação térmica, presença de
alcalóides, sais de metais pesados e solventes orgânicos. Já as reações
denominadas â œ Salting-inâ e â œSalting-outâ precipitam o material sem a
desnaturação. Apesar de alguns erros grosseiros quanto à manipulação dos
aparelhos, todos os resultados atingiram as caracterÃsticas pré-estabelecidas pelos
conceitos teóricos.

Presidente Prudente, 2São Paulo: Sarvier, 2006. Moreira, Ana Beatriz & Gonçalvez,
Joaquim. Processos de desnaturação protéica. Universidade do Porto, 2008.

Presidente Prudente, 24 de março de 2010

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