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Relatório de Trabalho Prático – Laboratório Aberto do IPATIMUP, Porto

Transformação genética
em Escherchia Coli
Inserção e expressão do gene GFP através do vector pGLO
Cláudia Franco | Cláudia Lobo | Edgar Couto | Sofia Osório

Resumo
Após concluída a Actividade Prática Laboratorial Bactérias Fluorescentes, no
laboratório aberto do IPATIMUP, elaborou-se o seguinte relatório, no qual se esclarecem os
conceitos de Técnica do DNA recombinante e de como esta permite induzir novas
características fenotípicas em bactérias Escherichia Coli, utilizando como vector,
geneticamente modificado através de enzimas de restrição, o plasmídeo pGLO; e o gene
responsável pela fluorescência GFP (Green Fluorescent Protein). Esclarece ainda o conceito de
Técnica de Gram, Gram negativo e Gram positivo e ainda as vantagens de ter conhecimento da
composição da membrana bacteriana.

Abstract
Once completed the Practical Activity Fluorescent Bacteria, in the open laboratory of
IPATIMUP, this report was written to clear concepts such as recombinant DNA technique and
how it may induce new phenotypic characteristics in Escherichia Coli bacteria, using pGLO
plasmid as a vector, genetically modified by restriction enzymes; and the gene which is
responsible for fluorescence GFP (Green Fluorescent Protein). It also clarifies Gram Technique
concept, positive and negative Gram and the advantages of knowing the composition of the
bacterial membrane.

Palavras Chave: Técnica do DNA Recombinante, Características Fenotípicas, Bactéria,


Escherichia Coli, Enzimas de Restrição, pGLO, Gene GFP, Técnica de Gram, Gram Negativo,
Gram Positivo, Membrana Bacteriana.

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Introdução
A cada dia que passa o mundo já não é o mesmo, a vida transforma-se, a Biologia
reinventa-se.

É o caso da engenharia genética, um exemplo perfeito de como a junção do passar do


tempo com as potencialidades da mente humana colaboram em perfeito uníssono.

Todos os dias novas descobertas são feitas, por experimentação, teoria e prática
obtêm-se novas potencialidades capazes de alterar ideias prévias e neste caso testar métodos
alternativos com o objectivo de quebrar barreiras.

Em especial, o IPATIMUP (Instituto de Patologia e Imunologia Molecular da


Universidade do Porto) merece ser mencionado pois serve de referência no campo da
engenharia genética por descobertas significativas e pioneiras, e também por teses e artigos
publicados nesta área.

Um dos parâmetros estudados e relevantes dentro da engenharia genética e posto em


prática na ida dos autores deste paper ao Laboratório Aberto deste instituto, são as
actividades com bactérias fluorescentes e a respectiva manipulação do seu DNA tendo em
vista responder às seguintes perguntas: Como introduzir um plasmídeo numa bactéria? Será
possível manipular o seu DNA de modo a torná-la mais resistente a um antibiótico específico?

O objectivo da actividade realizada no IPATIMUP é igualmente partilhado pelo


objectivo deste documento científico, alargar conhecimentos relativos a DNA recombinante,
bactérias, antibióticos e indução de novas características fenotípicas.

Esta actividade realizada devido à oportunidade proporcionada pelo Laboratório


Aberto, permite uma relação directa com a disciplina de Biologia por abranger conceitos tais
como: processos de manipulação de genes num dado organismo (geralmente fora do processo
reprodutivo normal deste), isolamento, manipulação e introdução de DNA num chamado
corpo de prova (ou hospedeiro), tendo como objectivo a expressão de um gene específico
previamente identificado e categorizado.

A importância teórica e prática da experiência realizada, residiu na oportunidade dada


aos participantes de explorar e pôr em prática conteúdos abordados na disciplina assim como
assistir ao resultado dessa mesma experimentação.

O presente paper está dividido em duas partes principais: Parte I. Bactérias


Fluorescentes e Parte II. Técnica de Gram.

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I. Bactérias Fluorescentes
Fundamentos Teóricos

Bactéria
As bactérias são procariontes unicelulares tendo, por isso, uma constituição muito
simples. São seres que não apresentam organelos membranares, nem núcleo individualizado,
tendo o DNA disperso no citoplasma e não associado a histonas. Para além da molécula de
DNA principal, as bactérias possuem ainda porções de DNA circular em cadeia dupla
denominadas Plasmídeos. Estes replicam-se independentemente da molécula de DNA
principal e não são essenciais à
sobrevivência da bactéria.

Organelo Função
Membrana Captação de elementos
Citoplasmática necessários e excreção de toxinas
Parede Celular Rigidez e Protecção
Hidratação
Cápsula Protecção contra Fagocitose
Maior adesão a outras células
Pili Prender o Alimento

Flagelo Locomoção

Ribossomas Síntese Proteica

Plasmídeos Mecanismo de Defesa


Material Genético
Nucleóide Codifica as características da
célula

Figura 1 - Bactéria

Técnica do DNA recombinante


A Técnica do DNA recombinante é utilizada em engenharia genética para possibilitar
que determinada espécie adquira características fenotípicas não inatas ao seu genoma. É
introduzida uma porção de DNA exógeno previamente seleccionado através de enzimas de
restrição. Esta técnica tem um elevado poder económico pois possibilita a produção em massa
de substâncias necessárias à sobrevivência (potencia tratamentos) das quais é exemplo a
insulina, tão necessária para insulinodependentes.

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Para modificar geneticamente um organismo é necessário alterar todas as suas células,
já que todas elas possuem o genoma do indivíduo. Sendo assim, nesta técnica são utilizados
organismos como as bactérias ou leveduras devido à sua unicelularidade e à maior facilidade
de manipulação do seu conteúdo genético pela sua simplicidade, pelo reduzido número de
nucleótidos que o constituem e pela sua rápida e eficaz reprodução, originando clones.

Figura 1 -União entre o grupo fosfato ligado ao Figura 3 -Esquematização da acção de uma Enzima de
carbono 5′ e o grupo hidroxila ligado ao carbono 3’ Restricção (EcoRI)
das moléculas de desoxiribose presentes no DNA.

É utilizado um vector (molécula capaz de transportar o gene escolhido para a célula


hospedeira) que contém o gene recolhido da molécula de DNA dadora, neste caso, o
plasmídeo. Ambos, plasmídeo e molécula dadora, são tratados com a mesma enzima de
restrição. Os fragmentos de restrição (provenientes do DNA dador), e os plasmídeos cortados
têm extremidades em cadeia simples (extremidades coesivas). Colocam-se, posteriormente, os
fragmentos de restrição junto aos plasmídeos e as extremidades coesivas de ambos
emparelham por complementaridade de bases, formando pontes de hidrogénio. É introduzida
uma enzima específica, DNA ligase, que estabelece a ligação entre as duas cadeias simples
(ligações covalente – fosfodiéster), originando uma nova molécula de DNA – rDNA (DNA
recombinante).

O plasmídeo resultante deste processo de alteração da sequência nucleotídica, agora


denominado plasmídeo recombinante, é posto em contacto com as células hospedeiras
(bactérias). Este vector recombinante é ainda portador de um gene que lhe confere resistência
a determinado antibiótico para posterior selecção das bactérias transformadas.

As bactérias que incorporaram o plasmídeo recombinante iniciam a síntese da nova


proteína codificada pelo gene exógeno introduzido no plasmídeo.

O resultado pretendido será, então, a produção em massa de determinada


biomolécula codificada pelo gene recolhido da molécula dadora.

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Zona Codifica
Ori (Origin) Origem da replicação plasmídica
Bla
Resistência à ampicilina (antibiótico)
( -lactamase gene)
GFP
Síntese da proteína que confere
(Green Fluorescent
fluorescência
Protein)
ara-C Controlo da expressão do GFP em função
(bifunctional da presença ou ausência de Arabinose no
regulatory protein) meio

Plasmídeo pGLO
É através da técnica resumidamente descrita acima que é sintetizado,
laboratorialmente, o plasmídeo pGLO. A constituição deste plasmídeo é responsável pela sua
utilização na experiência “Bactérias Fluorescentes” e destacam-se quatro zonas principais.

O plasmídeo em causa, posto em contacto com as células hospedeiras, iniciará a


síntese da proteína que lhes confere fluorescência
quando observadas à luz ultravioleta.

Os procariontes que integrarão o


plasmídeo pGLO, neste caso Escherichia Coli,
tornar-se-ão resistentes ao antibiótico Ampicilina
(devido ao gene bla), característica que não
possuiam naturalmente. Sendo assim, este gene
pGLO
servirá para seleccionar na cultura bacteriana, os
indivíduos que incorporaram o plasmídeo,
expondo-os à ampicilina. Apenas os que
sobrevivem contêm o vector manipulado. Esta
seleção permite certificar que apenas as bactérias
modificadas se reproduzem, clonando o gene de Figura 4 - Representação do Plasmídeo recombinante pGLO
interesse sucessivamente.

A zona ara-C é responsável pela regulação da expressão do gene GFP, este apenas é
transcrito na presença de Arabinose (dissacarídeo). É um operão indutível, constituído por um
operador, um promotor e três genes estruturais que codificam a síntese das proteínas
necessárias à degradação da Arabinose: o araA, que codifica a isomerase, o araB que codifica a
ribulocinase e o araD, que codifica a ribulose 5-fosfato epimerase.

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Operão Arabinose
Um operão é a unidade regulatória completa de um conjunto de genes agrupados. É
constituído por um gene regulador, responsável pela síntese de uma proteína repressora; um
gene operador, responsável pela fixação da proteína repressora ao operão; um gene
promotor, responsável pela fixação da RNA polimerase; e um conjunto de genes estruturais,
responsáveis pela codificação dos aminoácidos que, juntos, formarão as proteínas
responsáveis pela degradação da arabinose.

Só é necessária a síntese das proteínas degradadoras do dissacarídeo se este estiver


presente no meio. Caso contrário será um desperdício de energia. Sendo que as bactérias
apenas produzem ATP através da Fermentação (o balanço final são duas moléculas de ATP)
não podem fazer desperdícios.

Na ausência de arabinose no meio a proteína repressora é sintetizada na forma activa,


fixa-se ao operador incapacitando a fixação da RNA polimerase. Não há transcrição dos genes
estruturais, consequentemente não há tradução nem síntese proteica.

Figura 5 - Esquema do Operão Arabinose I

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Na presença de arabinose no meio a proteína repressora é sintetizada na forma activa,
as moléculas de lactose desactivam-na. Esta não se liga ao operador e, por isso, a RNA
polimerase fixa-se ao promotor, iniciando a transcrição, para posterior tradução. Há síntese
proteica.

Figura 6 -Esquema do Operão Arabinose II

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GFP
A GFP (Green Fluorescent Protein) é uma proteína que confere fluorescência
esverdeada sintetizada pelo cnidário Aequorea Victoria. O primeiro cientista a isolar este gene,
Osamu Shimomura, ganhou o prémio Nobel da Química em 2008, quando já tinha 80 anos.

Figura 7 - Aequorea Victoria


Figura 8 -Estrutura Molecular da proteína GFP Figura 9 -Estrutura Tridimensional da
proteína GFP

A sua descoberta foi extremamente importante para as evoluções em engenharia


genética nos últimos dois anos, mas é também utilizada em microbiologia e em fisiologia. É
devido à sua ubiquidade que se revela tão promissor no estudo da expressão génica tanto em
culturas de células como em tecidos, ou até mesmo sistemas inteiros (animais e plantas).
Funciona como uma espécie de marcador biológico devido à sua fácil detecção, não só de
organismos mas também de proteínas, organelos e outros compartimentos celulares. É, ainda,
útil na avaliação da capacidade de expressão de determinados promotores.

A sua estrutura em cilindro deve-se ao conjunto das onze cadeias- . No centro


encontra-se uma hélice- . É constituída por 238 aminoácidos.

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Material
Micropipetas Solução de Transformação
Ansas Esterilizadas Plasmídeos pGLO
Microtubo Placa de Petri contendo meio LB,
Suporte de Microtubos antibiótico (ampicilina) e arabinose
Recipiente com gelo Câmara de Incubação
Aparelho de Banho-maria Luz Ultra-Violeta
Meio Nutritivo (LB) Luvas de Latex

Método / Procedimento
Com a experiência “Bactérias Fluorescentes”, desenvolvida no Laboratório Aberto do
IPATIMUP, pretendia-se compreender o processo complexo utilizado em engenharia genética.
Como introduzir um plasmídeo numa bactéria? Como torná-la resistente a determinado
antibiótico?

A actividade proposta permite, recorrendo à técnica do DNA recombinante, a


manipulação de bactérias e a sua comparação com bactérias não manipuladas.

Após toda a informação teórica recolhida e percebida, criaram-se as seguintes hipóteses:

As bactérias geneticamente modificadas, ou seja, que incorporaram o plasmídeo


recombinante, emitem fluorescência quando observadas à luz Ultra Violeta se
estiverem na presença de Arabinose; expostas ao antibiótico (Ampicilina), estas
bactérias sobrevivem.

As bactérias que não foram postas em contacto com o plasmídeo recombinante, não o
incorporaram, logo não sobreviverão em meios de cultura onde esteja presente o
antibiótico Ampicilina. Da mesma forma, não apresentarão fluorescência devido à
ausência do GFP.

Com o objectivo de validar estas hipóteses foi executada a experiência da seguinte


maneira.

1. Micropipetação de 250 l de Solução de Transformação (CaCl2) para o microtubo.


2. Recolha de uma pequena porção de Bactérias da espécie Escherichia Coli com a Ansa
descartável e inserção das mesmas no microtubo.
3. Recolha de uma película de plasmídeos pGLO com outra Ansa descartável e inserção
dos mesmos no microtubo.
4. Incubação do microtubo em gelo, após devida identificação1, durante
aproximadamente 3 minutos.

1
Sendo que o microtubo continha plasmídeos pGLO foi identificado com um + (=mais), todos os que não continham
DNA plasmídico foram identificados com um – (=menos).

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5. Transferência do microtubo para o Banho Maria a 42oC durante aproximadamente 1
minuto.
6. Nova incubação em gelo durante aproximadamente 2 minutos.
7. Agitação do microtubo
8. Micropipetação de 100 l da preparação contida no microtubo para a placa de Petri
previamente preparada com meio nutritivo (LB – Luria Bertani broth), ampicilina e
arabinose.
9. Utilização de uma nova Ansa descartável para uniformizar a preparação, agora contida
na placa de Petri
10. Incubação das placas de Petri, invertidas, a 37oC durante 24h.
11. Observação das placas à Luz Ultravioleta
12. Registo dos resultados

Resultados2

Substâncias Reacção das Bactérias


contidas na placa + pGLO - pGLO
de Petri Crescimento Fluorescência Crescimento Fluorescência
LB + Ampicilina Sim Não Sem alterações
LB Não testado Sim Não
LB + Ampicilina +
Sim Sim Não testado
Arabinose

Discussão
Após observação dos resultados pôde observar-se que o único meio de cultura em que
são expressos, na totalidade, os genes presentes no plasmídeo recombinante é o que é
constituído por LB (meio nutritivo), Ampicilina e Arabinose.

Depois de observados e tratados os resultados, pode, então, passar-se à análise e


exploração dos mesmos, bem como ao aprofundamento da compreensão de toda a
experiência.

A escolha de bactérias como a Escherichia Coli deve-se à sua unicelularidade e


simplicidade. Para além disso, esta espécie de bactérias tem outras características que as
situam à frente de muitas outras espécies bacterianas em Engenharia Genética. As bactérias
Escherichia Coli reproduzem-se a cada 20 min., ou seja, de 20 em 20 minutos, cada indivíduo
dá origem a dois novos clones. Pode, assim, concluir-se que este facto constitui, mais uma vez,
uma vantagem para a técnica de rDNA, que pretende que o gene responsável pelo novo
fenótipo seja transcrito vezes suficientes para a produção em massa de proteínas.

2
Estão presentes os resultados de todos os grupos de trabalho, para posterior análise e discussão.

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Outra característica favorável à utilização da Escherichia Coli é o facto de esta ser
inofensiva ao organismo humano, tanto é que vive em simbiose com este e com outros
animais saudáveis, impedindo o crescimento de espécies bacterianas nocivas e sintetizando
apreciáveis quantidades de vitaminas (K e do complexo B). Assim, a sua rápida multiplicação
em laboratório é completamente inócua tanto para humanos como para o ambiente. Por
outro lado, esta espécie não sobrevive se não estiver num meio de cultura favorável, o que
impossibilita a sua expansão e colonização fora do laboratório.

A Engenharia Genética é, de facto, uma componente essencial na ciência da


actualidade e abre todo um conjunto de portas e respostas a problemas do dia a dia.

O plasmídeo pGLO é um dos frutos desta engenharia. É um plasmídeo genéticamente


modificado muito utilizado em actividades práticas destinadas a alunos de ciências com o
objectivo de desenvolver o pensamento crítico e a criatividade em Biologia. É fácil de perceber
a sua utilização numa experiência destinada ao Ensino Secundário, já que, considerando a
complexa imensidão do mundo genético, este plasmídeo é relativamente simples, com quatro
zonas principais e necessárias à experiência em causa. O gene que codifica a GFP é outro factor
importante, já que é facilmente observável a fluorescência das bactérias modificadas, podendo
ser distinguidas a olho nu.

Quanto ao Operão Arabinose, tão necessário à expressão do gene GFP, pode dizer-se
que foi bastante útil a aplicação dos conhecimentos das aulas de Biologia relativas ao operão
Lactose. Foi essencial perceber a aplicação do que é um operão indutível numa biomolécula
completamente diferente.

Para que o plasmídeo recombinante entre nestes unicelulares, é necessário provocar


reações que tornem a sua membrana permeável. A este processo chama-se Competência
Adquirida, e pode ser conseguido de duas maneiras: Electroporação ou Choque Térmico.

Na Electroporação as células são submetidas a um pulso eléctrico, formando poros na


membrana celular destas. Apesar de esta ser a técnica mais eficaz, também é a mais cara
devido à necessidade da utilização de um Electroporador. Assim, na nossa experiência
utilizámos o método do Choque Térmico, no qual se submetem as bactérias a uma Solução de
Transformação (CaCl2) que destabiliza a membrana celular e permite a aproximação do
plasmídeo recombinante à mesma. Depois, as bactérias sofrem choques térmicos sendo
incubadas em gelo, e depois em banho-maria a 42oC. Este choque permite o aumento da
porosidade da membrana e, consequentemente, a entrada do plasmídeo recombinante na
célula. Voltaram a ser incubadas em gelo para que a membrana estabilizasse e os poros
fechassem, impedindo a saída da molécula de rDNA.

O passo seguinte foi a micropipetação do conteúdo do microtubo (bactérias na


presença do pGLO ou não) para placas de Petri com diferentes meios de cultivo. O objectivo foi
verificar em que condições o gene de interesse (gene GFP) se expressava.

Foram incubadas as quatro caixas de Petri invertidas a 37oC, o que faz todo o sentido e
confirma o que já havia sido dito. Sendo que as bactérias Escherichia Coli vivem em simbiose
no organismo humano, que temperatura poderia ser mais eficaz na sua reprodução do que a

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desse próprio organismo. Assim, 37oC, a temperatura do corpo humano, é também a
temperatura ideal para o desenvolvimento das culturas bacterianas de Escherichia Coli.

As duas caixas de Petri, onde foram colocadas as bactérias não modificadas, serviriam
como montagens de controlo. Deste modo, foi possível observar que, no seu genoma natural,
as Escherichia Coli , não possuem o gene que lhes confere resistência à Ampicilina, sendo que
na caixa de Petri que continha meio nutritivo LB e Ampicilina não se verificou alteração no
crescimento. Como no meio de cultivo que apenas continha LB se deu crescimento e formação
de colónias, a morte da outra montagem terá sido, inequivocamente, devida à presença de
Ampicilina no meio.

Por outro lado, ambas as montagens que continham as células modificadas, tinham
presente Ampicilina, e em ambas se verificou o crescimento populacional das bactérias,
formando colónias. Estes resultados permitem concluir que as bactérias modificadas através
da incorporação do plasmídeo pGLO adquirem resistência à Ampicilina, devido ao gene -
lactamase (Bla).

A última observação feita das caixas de Petri é precisamente a expressão, ou não, do


gene GFP. Não se esperava que nenhum dos meios que contêm as bactérias não modificadas
evidenciasse fluorescência, e assim se verificou. No entanto, ambos os meios com bactérias
modificadas, ou seja, portadoras no plasmídeo recombinante pGLO, dariam resposta às
hipoóeses propostas anteriormente. A única diferença entre os dois meios era a presença ou
ausência de Arabinose. Ao serem observadas à luz ultravioleta, verificou-se que apenas o meio
que continha Arabinose emitia fluorescência. Isto veio provar outro facto: a expressão do gene
GFP depende do operão Arabinose. Se este último for transcrito (arabinose presente no meio)
o gene GFP é transcrito e a proteína é sintetizada conferindo à Escherichia Coli uma
fluorescência esverdeada que não é característica do seu genoma natural; no caso deste
operão não ser transcrito (ausência de arabinose no meio) o gene GFP também não o é, não
havendo síntese da GFP. Desta forma as bactérias não emitem fluorescência.

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II. Técnica de Gram
Fundamentos Teóricos
Como já foi referido na parte I deste paper, as bactérias são seres procariontes
unicelulares muito simples. No entanto, estas possuem membrana celular, tal como todas as
células, e a composição dessa membrana é variável. O conhecimento dessa membrana
depende a Técnica de Gram.

A técnica de Gram consiste na coloração de preparações histológicas que permite


distinguir os dois principais grupos de bactérias por observação ao microscópio óptico. Esta
coloração trata-se de um método diferencial já que permite diferenciar microorganismos com
base na composição química e integridade da sua parede celular, bem como a sua morfologia
(cocos ou bacilos). Com base na cor que adquirem são classificadas em Gram positivas ou
Gram negativas. As bactérias mais patogénicas são reconhecidas, por terem Gram negativo, na
maior parte dos casos. Estas últimas são ainda constituídas por lipopolissacarídeos que
agravam as infecções.

Foi descoberta pelo físico dinamarquês Hans Christian Gram em 1884. Este cientista
obteve com a coloração realizada uma melhor visualização das bactérias em amostras de
material infectado. Verificou, no entanto, que nem todas as bactérias coravam com este
método o que o levou a sugerir a possibilidade de ser usado um contrastante. Gram morreu
em 1935 sem ter conseguido que fosse dada a devida importância ao seu método de
coloração.

No entanto, com o tempo foi dada a devida importância a esta técnica, sendo muito
utilizada em algo tão importante como a Taxonomia e identificação de bactérias, sendo uma
técnica de rotina em laboratórios de bacteriologia.

A principal diferença entre Gram positivas e Gram negativas é o teor lipídico da sua
membrana. A parede celular das bactérias Gram negativas tem um teor lipídico elevado na sua
membrana externa e uma camada de peptidoglicano que envolve a membrana plasmática.

A parede celular das bactérias Gram positivas é principalmente constituída por uma
grossa camada de peptidoglicano. O seu teor lipídico é muito baixo, ou mesmo nulo
(característica rara em espécies bacterianas).

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Material
Lâmina Garrafa de Esguicho com Etanol
Lamela MOC
Suporte de Tubos de Ensaio Lamparina
Corante Violeta de Genciana Suporte de Lâmina
Corante Soluto de Lugol Ansa Esterilizada
Corante Safranina Pipeta de Pasteur descartável
Garrafa de Esguicho com Água
Destilada

Método / Procedimento
Antes de efectuar a experiência e baseados nos conhecimentos teóricos anteriormente
descritos, elaboraram-se as seguintes hipóteses:

Se as bactérias Escherichia Coli forem Gram positivas, prevê-se que adquiram uma
coloração arroxeada, devido ao Corante Primário (Violeta de Genciana)

Se as bactérias Escherichia Coli forem Gram negativas, verificar-se-á uma cor


avermelhada, devido ao Corante Secundário (Safranina).

A experiência seguiu-se da seguinte maneira:

1. Colocação de uma gota de água na lâmina, com o auxílio do esguicho.


2. Recolha de uma porção da colónia de bactérias Escherichia Coli, com a ansa
esterilizada, e colocação da mesma na lâmina.
3. Fixação da preparação com o auxílio da lamparina.
4. Colocação de 1ml de corante Violeta de Genciana.
5. Lavagem da lâmina com o esguicho.
6. Colocação de 1ml de corante Soluto de Lugol.
7. Escorre-se o corante Soluto de Lugol.
8. Lavagem da lâmina com Etanol.
9. Colocação de 1ml de corante de Safranina.
10. Lavagem da lâmina com água destilada.
11. Colocação da lamela por cima da preparação.
12. Observação ao MOC (Microscópio Óptico Composto).
13. Utilização de Óleo de Imersão quando ampliado a 100x3

3
O Objectivo do Óleo de Imersão é melhorar a nitidez da imagem.

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Resultados
Após todo o procedimento efectuado correctamente, observaram-se as bactérias ao
MOC. Os resultados foram completamente claros. As bactérias Escherichia Coli apresentaram
uma coloração avermelhada, e têm, nitidamente, forma de Bastonete (ou Bacilos).

Figura 10 - Bactéria Escherichia Coli ao ME 10 000x Figura 11 - Bactéria Escherichia Coli ao MOC 100x

Discussão
Durante todo o procedimento recorre-se a lavagens sucessivas da lâmina que contém
a porção colonial de Escherichia Coli. Todos esses passos têm o objectivo de caracterizar a
parede celular destes procariontes.

Como foi já referido, a parede celular de uma bactéria é constituída por


peptidoglicanos, podendo também ser circundada por uma bicamada fosfolipídica.

Figura 12 - Parede Celular Gram Negativa Figura 13 -Parede Celular Gram Positiva

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Bactérias Gram negativas têm, na constituição da sua parede celular, uma fina camada
de peptidoglicanos, sendo esta revestida por uma bicamada fosfolipidica. Sendo assim,
durante o procedimento experimental, quando se recorre à lavagem da preparação com
Etanol, parte dos lípidos são dissolvidos pelo ácool, formando poros na parede celular. O
Corante Primário, anteriormente absorvido pelas células, sai do interior das mesmas. Estas
ficam transparentes, sendo posteriormente coradas novamente pelo Corante Secundário.

Nas bactérias Gram positivas isto não se verifica, pois a parede celular destas é
constituída por uma espessa camada de peptidoglicanos, sem ser revestida pela bicamada
fosfolipidica. A camada de peptidoglicanos actua como barreira, impedindo a saída do corante
primário. Assim sendo, a cor destas células será a do Corante Primário.

Com os resultados obtidos, pôde verificar-se que, tendo as E.Coli adquirido uma
coloração avermelhada, estas são Gram negativas. Assim, a sua parede celular é constituída
por uma fina camada de peptidoglicanos, que está circundada por uma bicamada fosfolipídica,
idêntica à da membrana celular.

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Agradecimentos
Agradecemos sinceramente aos professores Manuel Leite e Manuela Pereira, por
terem sido os únicos disponíveis a acompanhar-nos na visita de estudo. Agradecemos,
também, ao Laboratório Aberto do IPATIMUP que nos proporcionou condições para a
sedimentação dos conhecimentos teóricos abordados nas aulas de Biologia de 12º ano.

Referências
www.microbiologybytes.com
www.cientic.com
www.e-escola.pt
biotecnologia-na-escola.up.pt
www.cve.saude.sp.gov.br/htm/hidrica/Ecolinet.htm
www.science.uva.nl/research/molphot/research/sm/peterSMS.html
onubiol217.blogspot.com/2011/01/module-3-lab-08-section-2-genetic.html
NASCIMENTO, A., ESPREAFICO, E., LARSON, M., MONESI, N., ROSSI, N. – “Tecnologia
do DNA recombinante”, Universidade de S.Paulo, Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto, 2003
Correia, R., “Controlo da Expressão Genética em Procariotas”, Licenciatura em
Bioquímica ISCS-N, Biotecnologia – 3º ano
Martins, C., Ferreira, J., Siqueira, L., Ferreira, L., Bazzo, M., Franchini, M., Berro, O.,
Valle, S., “Técnica de Coloração de GRAM”, Ministério da Saúde, Secretaria de Políticas
de Saúde, Programa Nacional de DST e Aids, Brasília, 2001

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