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UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA PROGRAMA DE POSTGRADO: ZOOTECNIA Y GESTIÓN SOSTENIBLE: MÁSTER EN ZOOTECNIA Y GESTIÓN SOSTENIBLE:

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA PROGRAMA DE POSTGRADO: ZOOTECNIA Y GESTIÓN SOSTENIBLE:

MÁSTER EN ZOOTECNIA Y GESTIÓN SOSTENIBLE:

GANADERIA ECOLOGICA E INTEGRADA

Calibraciones para la determinación de parámetros reológicos de la leche de cabra mediante espectroscopía en el infrarrojo cercano (NIRS)

Tesis presentada como requisito para optar al grado de

Master en Zootecnia y Gestión Sostenible

por:

Paula Toro Mujica

Directores:

Dr. Juan Manuel Serradilla Dr. Juan García Olmo

ÍNDICES

Índice General

  • 1. Resumen................................................................................................................

2

  • 2. Introducción y objetivo

 

4

  • 3. Revisión

7

  • 3.1. La reología de los productos alimenticios

 

7

  • 3.2. Características reológicas de la leche

.........................................................

8

  • 3.3. Factores que influyen en los parámetros reológicos de la leche

9

3.3.1.

Características físico-químicas .................................................................

9

3.3.1.1.

Tratamientos térmicos

12

  • 3.3.2. Métodos e instrumentos para la monitorización los parámetros reológicos

de la leche durante la

13

  • 3.3.2.1. reológicos. .......................................................................

Métodos

14

  • 3.3.2.2. térmicos. ..........................................................................

Métodos

15

  • 3.3.2.3. ultrasonidos. ................................................................

Métodos de

15

  • 3.3.2.4. ópticos. ............................................................................

Métodos

16

3.3.3.

La tecnología del coagulómetro Optigraph®

18

3.4.

La tecnología de espectroscopía en el infrarrojo

18

3.4.1.

Fundamentos de la tecnología NIRS

18

3.4.1.1.

Pretratamientos

22

  • 3.4.1.1.1. Promediado de espectros

22

  • 3.4.1.1.2. Corrección de la línea

22

  • 3.4.1.1.3. Derivación. .....................................................................................

23

  • 3.4.1.1.4. Corrección el efecto de dispersión de la radiación o efecto scatter

23

Índice General

3.4.1.1.4.1.

Corrección del efecto multiplicativo de la

23

3.4.1.1.4.2.

Standard Normal Variate (SNV)

24

3.4.2.

Calibraciones NIRS

24

  • 3.4.2.1. Selección de muestras del grupo de

25

  • 3.4.2.2. Métodos de

26

  • 3.4.2.2.1. Regresión lineal simple

...................................................................

26

  • 3.4.2.2.2. Regresión lineal

27

  • 3.4.2.2.3. Regresión por componentes principales (PCR)

...............................

28

  • 3.4.2.2.4. Regresión por mínimos cuadrados parciales (PLS)

.........................

28

  • 3.4.2.2.5. Regresión por mínimos cuadrados parciales modificados (MPLS)

29

  • 3.4.2.2.6. Regresión mediante redes neuronales

29

  • 3.5. Aplicación de la tecnología NIRS al análisis en la industria agroalimentaria.

 

................................................................................................................

30

3.5.1.

Uso de la tecnología NIRS en la industria láctea

31

4.

Material y Métodos

..............................................................................................

36

  • 4.1. Obtención de las muestras de leche

36

  • 4.2. Determinación de los parámetros reológicos

36

  • 4.3. Análisis de las muestras por

40

  • 4.3.1. Instrumento y software

40

  • 4.3.2. Preparación de las

41

  • 4.4. Toma de espectros

41

  • 4.5. Estudio de la variabilidad

42

Índice General

 
  • 4.6. Calibraciones

43

  • 4.7. Estadísticos de calibración y criterios de selección de las

45

5.

Resultados y discusión

50

  • 5.1. Caracterización reológica del colectivo de calibración utilizado en el

análisis

NIRS .......................................................................................................

50

  • 5.2. Caracterización espectral de la población

62

  • 5.3. Proceso de centrado de la

63

  • 5.4. Desarrollo de ecuaciones de calibración para los parámetros analizados

67

  • 5.4.1. Ecuaciones de calibración para el tiempo de coagulación (R)

67

  • 5.4.2. Ecuaciones de calibración para la firmeza del coágulo (AR)

68

  • 5.4.3. Ecuaciones de calibración para la firmeza del coágulo a dos veces el

tiempo de coagulación (A2R)

..............................................................................

69

  • 5.4.4. Ecuaciones de calibración para las variables velocidad de coagulación

70

  • 5.4.4.1. Velocidad de coagulación (S 2 )

70

  • 5.4.4.2. Velocidad de coagulación (S 4 )

71

  • 5.4.4.3. Velocidad de coagulación (S 6

72

  • 5.4.4.4. Velocidad de coagulación (S 8

73

  • 5.4.5. Ecuaciones de calibración para la firmeza de la cuajada a los 20 minutos

de iniciarse la coagulación (A20)

........................................................................

74

  • 5.4.6. Ecuaciones de calibración para la firmeza de la cuajada a los 30 minutos de

iniciarse la coagulación (A30)

.............................................................................

75

  • 5.4.7. Ecuaciones de calibración para firmeza de la cuajada al finalizar el

proceso de coagulación (Af)

................................................................................

76

Índice General

5.4.8. Ecuaciones de calibración para firmeza del coágulo a 20 mm. de

separación de los brazos de la horquilla (K20)

.....................................................

77

Conclusiones

  • 6. .......................................................................................................

81

Bibliografía

  • 7. .........................................................................................................

84

Índice de Tablas

Tabla N°1: Comparación de las características físico-químicas de los lípidos y la

estructura de la micela entre leche de cabra, oveja y

vaca. ...........................................

10

Tabla N°2: Coeficientes de correlación entre la composición físico-química y las

propiedades tecnológicas de la leche en la elaboración de quesos

11

Tabla N°3: Cambios en la leche debidos a tratamientos

13

Tabla N°4: Parámetros de evaluación nutritiva tradicionalmente analizados

31

Tabla N°5: Usos actuales de la tecnología NIR

31

Tabla N°6: Caracterización reológica de los colectivos de calibración para R, S 2 , S 4 , S 6 ,

S 8 , AR, A2R, A20, A30, Af y

K20. .............................................................................

50

Tabla N°7: Error típico de laboratorio para todas las muestras originales en cada uno de

los parámetros de

coagulación. ...................................................................................

53

Tabla N°8: Varianzas explicadas y acumuladas por cada una de las 20 componentes principales recomendadas en el último proceso de centrado del colectivo de calibración.

................................................................................................................................... Tabla N°9: Ecuaciones obtenidas para la variable tiempo de coagulación (R)

.............

64

67

Tabla N°10: Ecuaciones obtenidas para la variable firmeza del coágulo a una vez el

tiempo de coagulación (AR)

.......................................................................................

68

Tabla N°11: Ecuaciones obtenidas para la variable firmeza del coágulo a dos veces el

tiempo de coagulación (A2R)

.....................................................................................

69

Tabla N°12: Ecuaciones obtenidas para la variable velocidad de coagulación que genera

un cambio de tensión en la señal de 1000 V

(S2).........................................................

70

Tabla N°13: Ecuaciones obtenidas para la variable velocidad de coagulación que genera

un cambio de tensión en la señal de 2000 V

(S4).........................................................

71

Tabla N°14: Ecuaciones obtenidas para la variable velocidad de coagulación que genera

un cambio de tensión en la señal de 2500 V

(S6).........................................................

72

Índice de Tablas

Tabla N°15: Ecuaciones obtenidas para la variable velocidad de coagulación que genera

un cambio de tensión en la señal de 3000 V

(S8).........................................................

73

Tabla N°16: Ecuaciones obtenidas para la variable firmeza de la cuajada a los 20

minutos de añadir el cuajo (A20)

................................................................................

74

Tabla N°17: Ecuaciones obtenidas para la variable firmeza de la cuajada a los 30

minutos de añadir el cuajo (A30)

75

76

Tabla N°19: Ecuaciones obtenidas para la variable firmeza del coágulo a 20 mm. de

separación de los brazos de la horquilla (K20)

............................................................

77

Índice de Figuras

Figura N°1: Interacción de la luz con la

20

Figura N°2: Optigraph®

37

38

40

Figura N°5: Filtro utilizado para el secado de la

41

Figura N°6: Procedimiento de calibración y validación en el software WINISI

44

Figura N°7: Velocidad de coagulación (expresada como el inverso del tiempo requerido

para el cambio de voltaje)

51

........................................................................................... Figura N°8: Histograma del colectivo de calibración para tiempo de coagulación (R). 53

Figura N°9: Histograma del colectivo de calibración para la firmeza del coágulo a una

vez el tiempo de coagulación (AR)

.............................................................................

55

Figura N°10: Histograma del colectivo de calibración para firmeza del coágulo a una

vez el tiempo de coagulación (A2R)

...........................................................................

56

Figura N°11: Histograma del colectivo de calibración para velocidad de coagulación

(S 2

57

Figura N°12: Histograma del colectivo de calibración para velocidad de coagulación

(S 4

57

Figura N°13: Histograma del colectivo de calibración para velocidad de coagulación

(S 6

58

Figura N°14: Histograma del colectivo de calibración para velocidad de coagulación

(S 8

58

Figura N°15: Histograma del colectivo de calibración para firmeza del coágulo a los 20

minutos de la adición del cuajo (A20)

.........................................................................

59

Índice de Figuras

Figura N°16: Histograma del colectivo de calibración para firmeza del coágulo a los 30

minutos de la adición del cuajo (A30)

.........................................................................

59

Figura N°17: Histograma del colectivo de calibración para firmeza final del coágulo

(Af)

60

Figura N°18: Histograma del colectivo calibración para la variable K20

61

Figura N°19: Espectro medio de los colectivos de muestras de leche de las razas

Murciano-Granadina y

62

Figura N°20: Histograma de los valores de H para las muestras iniciales

65

Figura N°21: Histograma de los valores de H para las muestras después de los siete

procesos de

centrado. ..................................................................................................

66

1. RESUMEN

Resumen

1. Resumen

Se evaluó la capacidad de la tecnología NIRS para predecir los parámetros reológicos de la leche de cabra mediante un espectrofotómetro FOSS-NIRSystems 6500 System II (escaneando un rango de 1100 a 2500 nm.). Las ecuaciones NIRS fueron desarrolladas usando 1047 muestras de animales de las razas Murciano Granadina y Malagueña en diferentes estados de lactancia. La cuantificación de los parámetros reológicos fue realizada a través de un coagulómetro Optigraph®. Las ecuaciones para la predicción de los parámetros reológicos mostraron valores R 2 aceptables para tiempo de coagulación (0,75), tiempos transcurridos para alcanzar distintos grados de firmeza de la cuajada: S 2 (0,73), S 4 (0,72), S 6 (0,7), firmeza del coágulo a 20 minutos (0,74) y firmeza del coágulo a 20 milímetros (0,7). El resto de los parámetros evaluados presentaron valores de R 2 entre 0,52 y 0,69, siendo las ecuaciones útiles sólo para la categorización de las muestras en niveles bajo, medio y alto, lo que sin embargo puede ser de interés al clasificar tipos de leche, asignándoles intervalos de tiempo definidos para permitir la coagulación, según los datos obtenidos desde los espectros.

2. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO

Introducción y objetivo

  • 2. Introducción y objetivo

El conocimiento de la composición química de la leche en la industria alimentaria tiene una amplia importancia desde el punto de vista nutricional y de control de la calidad de los productos agroalimentarios, ya sea a nivel de productor y/o de consumidor. Sin embargo, los criterios clásicos de calidad, entre los que se encuentra la composición de grasa, proteína y extracto seco, deben ser ampliados cuando el objetivo final de la leche es la producción de queso.

Es así, como el rendimiento en la cuajada ha sido uno de los parámetros que se ha buscado mejorar, asociándolo a la grasa media y al extracto seco total y, en los últimos años, a otras características relacionadas con la proteína, como son el contenido de caseínas, la proporción con que cada fracción caseínica contribuye a la composición proteica total y el polimorfismo bioquímico de las proteínas lácteas.

Junto a las características químicas de la leche, es necesario conocer sus parámetros tecnológicos, los que dependen de las características de coagulación de la leche, entre las que se encuentran el tiempo de coagulación (R), la velocidad de coagulación (Sj), la dureza media de la cuajada (A30), la dureza máxima de la cuajada (Af), entre otras. Para la determinación de estos parámetros se han utilizado distintos instrumentos que pueden ser clasificados según su naturaleza en reológicos, térmicos, ultrasonidos y ópticos. La mayor parte de los métodos utilizados actualmente presentan un alto consumo de tiempo y dinero, además de ser exclusivos para la determinación de los parámetros de coagulación. Con la reciente utilización de la espectroscopía del infrarrojo (NIRS) en la determinación de la composición química de la leche, surge la inquietud de ampliar su utilización para la determinación de los parámetros de coagulación. Este uso tiene la ventaja de permitir con una sola medición obtener una gran cantidad de parámetros, como son los de composición, parámetros reológicos y algunos de calidad como por ejemplo el recuento de células somáticas. Otra ventaja, es permitir la realización del análisis en la línea de producción, a un gran número de muestras, y en un corto período de tiempo. Situación, que sumada a la menor manipulación y deterioro de las muestras, permite su utilización en esquemas de selección, ya que cada individuo puede ser identificado y categorizado según los parámetros de calidad de su leche.

Introducción y objetivo

De este modo, el objetivo del presente trabajo de tesis es la generación de ecuaciones de calibración para la determinación de parámetros reológicos de la leche de cabra mediante espectrofotometría en el infrarrojo cercano (NIRS), dada las ventajas que la ampliación del uso de la herramienta NIR presenta para la industria láctea.

3. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

Revisión Bibliográfica

  • 3. Revisión bibliográfica

    • 3.1. La reología de los productos alimenticios

Los alimentos, además de ofrecer un olor, un color y un sabor característicos, muestran un determinado comportamiento mecánico: es decir reaccionan de un cierto modo cuando se les intenta deformar. Para estimar o expresar este comportamiento mecánico existen dos procedimientos, uno de ellos consiste en tocar, estrujar, morder o masticar el alimento y describir las sensaciones recogidas, este es el método sensorial y como depende de apreciaciones individuales es un método subjetivo. El segundo procedimiento es utilizar métodos físicos, donde el valor apreciado no depende del individuo que efectúa la medición, a este estudio físico de los materiales se le denomina reología (Muller, 1973).

La reología es definida como el estudio de las deformaciones (de los flujos) de la materia (Roudot, 2004) incluyendo pequeñas y grandes deformaciones. El término reología es usado en forma intercambiable con textura, la que se refiere al flujo, deformación y desintegración de una muestra bajo fuerza. Aunque la reología representa la propiedades o características de alimentos sólidos y líquidos, en estricto término textura se relaciona a alimentos sólidos, mientras que viscosidad con alimentos fluidos (Tunick, 2000).

Existen cuatro razones fundamentales para justificar el estudio del comportamiento reológicos de los alimentos, ellas son:

? Contribuye al conocimiento de su estructura, ya que existe cierta relación entre el tamaño y forma molecular de las sustancias en disolución y su viscosidad, así como entre el grado de entrecruzamiento de los polímeros y su elasticidad.

?

Efectuar

medidas

reológicas

en

las

materias

primas

y

en

los productos en

elaboración es de utilidad para el control de los procesos de conservación y

transformación.

Revisión Bibliográfica

?

Presta una valiosa ayuda al diseño de las máquinas, debiendo adecuar tolvas,

tuberías

y

bombas

a

las

características

de

los

productos

con

que

van

a

ser

utilizados.

 

?

Las características reológicas influyen de modo considerable en la aceptación del producto (Muller, 1973).

  • 3.2. Características reológicas de la leche

La reología de un fluido lácteo está ampliamente influida por su viscosidad, siendo la viscosidad la propiedad física de un fluido para resistir su flujo; esta depende de la fricción interna dentro de un líquido y la relación entre movimiento cinético y la superficie libre. La viscosidad se incrementa con la coagulación de las proteínas y al aumentar el contenido de grasa (Park, 2007).

Las características reológicas en la leche durante la elaboración de quesos se relacionan con el proceso de coagulación. La actitud para coagular es una característica esencial de la leche cuando es utilizada para la fabricación de queso, esta es definida como la capacidad de formar un gel que, después del desuerado, mantiene la mayoría de los componentes sólidos contenidos en matriz original liquida. Esta característica es relevante, debido a que el rendimiento quesero es dependiente de la capacidad del gel para atrapar firmemente la mayor parte de los sólidos (Giangiacomo et al., 1998).

Los mecanismos involucrados en el proceso de coagulación de la leche son bien conocidos, pudiendo ser divididos en tres fases consecutivas:

?

Fase primaria o enzimática. La cadena de aminoácidos de la de la ?-caseína es cortada (enlace 105-106) por la acción de la quimosina.

?

Fase secundaria. Reestructuración de la micela de caseína, al disminuir su hidratación y disminuir su repulsión electroestática.

Revisión Bibliográfica

?

Fase terciaria. El calcio de las micelas se liga, y puentea las micelas que precipitan formando un gel tridimensional que atrapa a los demás componentes de la leche.

Para la descripción de estos mecanismos se han usado distintas técnicas analíticas, dirigidas a comprender, los pasos que tienen lugar en secuencias relativamente rápidas. Sin embargo, infortunadamente no existe un método rápido y fácil para describir en tiempo real que sucede durante cada fase del proceso de coagulación.

  • 3.3. Factores que influyen en los parámetros reológicos de la leche

    • 3.3.1. Características físico-químicas

Los parámetros reológicos o de coagulación de la leche dependen de sus propiedades físico-químicas, incluyendo el pH, tamaño de la micela de caseína, contenido de calcio en relación con el contenido de caseína y concentración de otros minerales (Ramos y Juárez, 2003).

En la Tabla N°1 es posible apreciar las diferencias entre los parámetros físicos químicos de leche de diferentes especies. Como se observa, la leche de cabra presenta características intermedias entre la leche de vaca y oveja, para la mayor parte de los parámetros evaluados; salvo en el índice de yodo, donde encontramos el menor valor. Se debe destacar el bajo valor del diámetro del glóbulo de grasa de la leche de cabra, en relación a la de vaca, propiedad que le confiere una mayor digestibilidad.

Revisión Bibliográfica

Tabla N°1: Comparación de las características físico-químicas de los lípidos y la estructura de la micela entre leche de cabra, oveja y vaca.

 

Característica

 

Cabra

Oveja

Vaca

Valores físico-químicos

       

Materia insaponificable de la grasa de la leche (%)

0,41±0,02

s.i.

0,41±0,02

Acidez

0,47±0,02

0,22–0,25

0,48±0,05

Índice de yodo

19–20

20–35

27,09±1,26

Valor de saponificación

 

228,6±5,24

230–245

232,3±7,61

Diámetro del glóbulo de grasa (µm)

3,49

3,30

4,55

Estructura de la micela

       

Caseína no centrifugable (% de la caseína total)

8,7

s.i.

5,7

Diámetro promedio (nm)

 

260

193

180

Hidratación de la micela (g/g MS)

 

1,77

s.i.

1,9

Mineralización

de

la

micela

(g/ca/100

3,6

3,7

2,9

caseína)

s.i: Sin información

Fuente: Park et al., 2007.

La proteína total y la soluble, la caseína, el fósforo inorgánico y el calcio soluble afectan el tiempo de coagulación, mientras la tasa de firmeza del gel está principalmente influida por el contenido de caseína y por el diámetro promedio de la micela (Park et al., 2007). A pesar de encontrarse correlaciones significativas (P<0.05) entre la composición láctea (grasa, proteína y pH) y los parámetros de coagulación, los coeficientes encontrados han sido menores que 0,5. Esto confirma que la coagulación de la leche está influida por otros factores complejos como la fracción de caseína, las características de la micela o la concentración de calcio (Jaramillo et al., 2008).

La Tabla Nº2 muestra los coeficientes de correlación entre la composición físico- química y las propiedades de la leche durante el proceso de elaboración de quesos.

Revisión Bibliográfica

Tabla N°2: Coeficientes de correlación entre la composición físico-química y las propiedades tecnológicas de la leche en la elaboración de quesos

 

RCT

RCA

F30

CHY

 

CD

Grasa

0,238*

  • - 0,433**

0,423**

0,824**

  • - Ns

 

P

0,392**

  • - 0,469**

  • - 0,473**

0,564**

-

0,342**

CSN

0,277*

  • - 0,352**

0,343**

  • - 0,283*

0,233*

 

L

  • - 0,486**

0,372**

 

0,470**

- 0,557**

 

Ns

TS

0,327**

  • - 0,511**

0,505**

  • - - 0,258*

0,856**

 

pH

0,434**

  • - 0,385**

  • - 0,357**

Ns

-

0,310**

RCT

1,000

  • - 0,701**

  • - 0,585**

ns

-

0,731**

RCA

  • - 0,701**

1,000

0,949**

- 0,268*

 

0,734**

F30

0,585**

  • - 0,949**

 

1,000

ns

 

0,662**

P: Proteína; CSN: Caseína; L: lactosa; TS: Sólidos totales; RCT: Tiempo de cuajado; RCA: Tasa de agregación de la cuajada; F30: Firmeza de cuajada; CHY: Rendimiento quesero individual; CD: Drenaje de cuajada. ns, No significativo * P < 0,05. ** P < 0,01. Fuente: Jaramillo et al., 2008.

De este modo, el contenido de caseína influye en forma directa sobre el tiempo de cuajado, el rendimiento quesero y el tiempo de drenaje de la cuajada y en forma inversa sobre la tasa de agregación de la cuajada y la firmeza de la cuajada. Sólo el rendimiento quesero está amplia y positivamente correlacionado con los sólidos totales, contenido de grasa y proteína. Sin embargo este factor no muestra correlación con los parámetros de coagulación excepto con la tasa de agregación de la cuajada (Jaramillo et al., 2008).

Las caseínas de la leche de cabra contienen más calcio, fósforo inorgánico, y caseínas no centrífugas, y pierden la ß-caseína más fácilmente que las caseínas de la micela bovina (Genes, 1980; Remeuf y Lenoir, 1986). A su vez hay varios factores, que han sido estudiados, que influyen sobre la agregación de las caseínas en micelas, entre los que destacan el efecto de la temperatura, el pH, la concentración de iones calcio, la

Revisión Bibliográfica

concentración de fósforo, la concentración de enzimas, la fuerza iónica y la concentración de proteína en la leche (Ruettimann y Ladisch, 1987).

  • 3.3.1.1. Tratamientos térmicos

La segunda fase de la coagulación enzimática de la leche no ocurre con temperaturas bajo 15°C o sobre 65°C, y la primera fase presenta una velocidad máxima dentro del rango de 40-42°C. La primera fase de la coagulación tiene una velocidad de reacción que se duplica por cada 10°C (Q10 = 2), similar a otras reacciones químicas. En contraste, la fase secundaria aumenta en 1,3 a 1,5 veces por cada grado de temperatura adicional (Bencini, 2002).

Los tratamientos térmicos han sido utilizados en la industria quesera como un método alternativo para prevenir los problemas microbiológicos producidos durante la manufactura del queso. Estos tratamientos con calor, realizados durante las operaciones de procesamiento comercial de la leche, resultan en cambios físico-químicos en los constituyentes de la leche, algunos de los cuales se enumeran en la Tabla N°3. La utilización de temperaturas superiores a 70°C, durante la realización de estos tratamientos, provoca la denaturalización de las proteínas del suero, limitando la coagulación debido a la interacción entre las proteínas del suero y la ?-caseína (Schreiber, 2001). La ß-lactoglobulina desnaturalizada se fija en la superficie de las micelas, por el establecimiento de un puente bisulfuro con la ?-caseína, disminuyendo la accesibilidad de la enzima al lugar de hidrólisis de la ?-caseína y, también, una disminución de la agregación de las micelas, provocando la formación de una cuajada suave (Van Hooydonk et al., 1987).

Revisión Bibliográfica

Tabla N°3: Cambios en la leche debidos a tratamientos térmicos.

Denaturación y agregación de las proteínas del suero Interacción de las proteínas del suero con la micela de caseína Reacción entre lactosa y proteína (Reacción de Maillard) Cambios en la estructura de la micela de caseína Transferencia de calcio y fosfato soluble a la fase coloidal Cambios en la membrana del glóbulo de grasa Disminución de pH

Fuente: Singh y Waungana, 2001

La precipitación del calcio en forma de fosfato de calcio, debida al tratamiento térmico, da lugar a una forma no idéntica a la del fosfato de calcio coloidal inicialmente presente en la micela, lo que perjudica la formación y al reforzamiento del coágulo. En la práctica, esta situación puede ser subsanada mediante la adicción de cloruro de calcio a la leche (Benradi, 2007).

3.3.2.

Métodos e instrumentos para la monitorización los parámetros reológicos de la leche durante la coagulación.

Como se señaló anteriormente, los parámetros reológicos miden la viscosidad en estado líquido de la leche y la textura de la cuajada que se obtiene durante el proceso de coagulación (Park, 2007). Los parámetros reológicos más importantes a nivel de la industria quesera corresponden a la velocidad de cuajado, la consistencia y estabilidad de la cuajada, siendo la variable dependiente de las anteriores, tiempo de corte, determinante en la elaboración de quesos. Es así, como el tiempo de corte ha motivado a numerosos investigadores para el estudio y desarrollo de equipos que puedan determinarlo en forma objetiva. De este modo, y basándose en los parámetros reológicos que determinan el tiempo de corte se han desarrollado equipos de distinta naturaleza (Castillo, 2001), los que se detallan brevemente a continuación.

Revisión Bibliográfica

  • 3.3.2.1. Métodos reológicos.

Dentro de los métodos reológicos para monitorizar la evolución del gel se encuentran:

?

Penetrómetros. Miden la fuerza o determinan la profundidad de penetración de un instrumento de deformación o probeta (cuchillo, disco de tamiz, etc.) en un determinado punto del gel.

?

Sistemas de cuerpos suspendidos. Miden la resistencia del gel a un instrumento de deformación (una bola o cono) que permanece colgado y es elevado lentamente durante la coagulación (Clark y Srinivasan, 1989).

? Métodos manométricos y viscosímetros de torsión. Obedecen al principio de ensayo armónico (un sistema de transmisión de presión en continuo y no periódico), en mayor o menor grado, y permiten realizar mediciones continuas. Los viscosímetros de torsión poseen una cuba que contiene leche en la cual se sumerge un cilindro; este cilindro está colgado de un hilo de torsión, actuando como detector y permitiendo el seguimiento de la resistencia del gel a la deformación. Estos métodos han sido ampliamente utilizados para la determinación del tiempo de coagulación y tiempo de corte (Castillo, 2001).

?

Métodos dinámicos. Permiten analizar la transición del estado natural de la leche al estado de gel. Los reómetros permiten la realización de ensayos armónicos para la obtención directa y continua de medidas de los módulos complejo, viscoso y elástico de rigidez. Por este motivo se han convertido en el método reológico de elección para el análisis del comportamiento viscoelástico de los geles y para realizar estudios cinéticos de endurecimiento. Permiten la determinación del tiempo de coagulación y la predicción del momento de corte (Castillo, 2001).

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  • 3.3.2.2. Métodos térmicos.

Son métodos basados en la transferencia de calor desde un hilo de platino caliente hacia la leche circundante. Este hilo se calienta mediante corriente eléctrica continua, actuando como una fuente constante de calor. La temperatura del hilo cambia debido al contacto con la leche, siendo este cambio registrado cada 5 segundos, en forma automática por medio de un sistema de adquisición de datos. La temperatura del hilo caliente es sensible al proceso de formación de la cuajada. Durante los primeros minutos tras la adición de la enzima dicha temperatura es independiente del tiempo pero, coincidiendo con el tiempo de coagulación visual, ésta aumenta drásticamente hasta que alcanza un valor de equilibrio. El sensor térmico es capaz de detectar el tiempo de coagulación y monitorizar todo el proceso de coagulación a tiempo real (Castillo, 2001).

  • 3.3.2.3. Métodos de ultrasonidos.

Gunasekaran y Ay (1994, 1996) proponen un método no destructivo y continuo basado en la aplicación de ultrasonidos para la determinación del tiempo de coagulación. Este método emplea la espectroscopía de ultrasonidos en la caracterización de las propiedades viscoelásticas en el queso y del tiempo de coagulación. El equipo consta de dos transductores de frecuencia conocidas, de los cuales uno actúa como emisor de ultrasonidos y otro como detector. Ambos están conectados a un emisor-receptor de ultrasonidos, y a su vez conectados a un ordenador personal a través de un osciloscopio. Los transductores son sumergidos en la leche, durante la coagulación la velocidad de propagación de los ultrasonidos disminuye inicialmente y después comienza a aumentar lentamente. En este equipo se usa la técnica de pulso-eco. La velocidad de atenuación sufre un decrecimiento regular durante la coagulación (la pérdida de energía es menor en un medio elástico), por lo que es utilizada para la monitorización de la coagulación.

Otro grupo de instrumentos lo constituyen los viscosímetros de ultrasonidos que permiten seguir el producto del coeficiente de viscosidad por la densidad hasta un estadio avanzado de la formación del gel (Marshall et al., 1982).

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  • 3.3.2.4. Métodos ópticos.

Los métodos ópticos de análisis son definidos como aquellos que miden la radiación electromagnética que emana de la materia o que interacciona con ella (Olsen, 1990). Se incluyen de esta forma en la definición todos los campos del espectro electromagnético, que abarca un gran intervalo de longitudes de onda y frecuencias, que comprende desde las radiaciones de alta energía como los rayos gamma hasta las de baja energía como las ondas de radio. Sin embargo, la región más interesante (200 nm a 25 µm) para los métodos ópticos sólo engloba las regiones del ultravioleta cercano, visible, infrarrojo cercano e infrarrojo medio.

Olsen (1990) divide los métodos ópticos de análisis en dos grupos: los espectroscópicos y los no espectroscópicos. Los métodos espectroscópicos miden la intensidad y longitud de onda de la radiación electromagnética. Todos estos métodos miden espectros, que son debidos a transiciones entre estados de energía característicos. El principal mecanismo de interacción energética, en estos métodos, es la absorción o la emisión, con la excepción de la espectroscopía Raman, basada en un tipo especial de interacción dispersiva y la espectropolarimetría, que determina la polarización en función de la longitud de onda. Estos métodos se identifican fácilmente ya que suelen llevar el prefijo “espectro”.Sin embargo, los métodos no espectroscópicos no se relacionan con las transiciones de energía, sino que se fundamentan en la interacción que se establece entre la radiación electromagnética y la materia, lo que produce un cambio de la dirección o de las propiedades físicas de la radiación. Las interacciones concretas que tienen lugar entre materia y radiación en los métodos no espectroscópicos son la refracción, la reflexión, la dispersión refractiva, la dispersión, las interferencias, la difracción y la polarización. A este grupo de métodos pertenecen la refractometría, la difracción de rayos X, la polarimetría, la turbidimetría y la nefelometría, entre otras.

La mayoría de los métodos de utilidad para el seguimiento de la coagulación de la leche se basan en interacciones como absorción, reflexión, refracción y dispersión. Cuando una radiación alcanza determinada materia, pueden suceder diferentes procesos (Abdou,

1987):

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?

la intensidad de la radiación emergente es idéntica a la de la incidente, sin que se produzca absorción de la radiación;

?

puede haber reflexión, refracción (transmisión) y/o dispersión;

?

la intensidad de la radiación emergente es inferior a la del haz incidente (cierto grado de absorción). Como consecuencia de la absorción las moléculas aumentan su energía desde el estado basal hasta un estado excitado; pero se mantienen en dicho estado sólo un breve lapso de tiempo (10 -8 -10 -9 s), ya que se relajan a niveles energéticos menores mediante cesión de energía en forma de fotones (emisión) o más frecuentemente por disipación de calor, lo que podría provocar un ligero aumento de la temperatura del medio (generalmente despreciable). La emisión es, por tanto, el proceso inverso a la absorción.

Los métodos actualmente utilizados en análisis a nivel de laboratorio para monitorizar la aptitud de coagulación de la leche son el método mecánico, mediante el equipo Foss Electric Formagraph®, y el método óptico, mediante el equipo Optigraph®. A través de ambos instrumentos es posible detectar la fase secundaria y terciaria (o de estabilización del gel) (Giangiacomo et al., 1998).

El Foss Electric Formagraph®, corresponde a un tromboelastógrafo, cuyas mediciones se basan en el movimiento de vaivén que realiza un pequeño péndulo introducido en una cubeta con leche, movimiento que va cambiando a medida que la leche va coagulando; el movimiento es registrado en papel por medio de un sistema fotográfico (Ares et al.,

2004a).

El coagulómetro Optigraph® corresponde al instrumento utilizado en la medición de los parámetros reológicos en el presente trabajo, cuya tecnología es descrita a continuación.

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  • 3.3.3. La tecnología del coagulómetro Optigraph®

El coagulómetro Optigraph® se basa en la medida de una señal del infrarrojo cercano, el instrumento calcula en tiempo real todos los parámetros requeridos para el proceso de fabricación de queso.

Las medidas con Optigraph® no se basan en los métodos reológicos sino en la medida de la atenuación de una señal del infrarrojo cercano. Durante el proceso de coagulación, la luz emitida, que pasa a través de la leche, es progresivamente atenuada debido a los cambios en la estructura de la caseína. La atenuación es medida con receptores y depende de varios factores como son el pH de la leche, la concentración de cuajo, la cantidad de proteína, etc. (Ysebaert, 2000).

  • 3.4. La tecnología de espectroscopía en el infrarrojo cercano.

El método espectroscópico se basa en la cuantificación de la vibración de las moléculas a partir de la energía de absorción medida por un espectrofotómetro. El valor de la energía de absorción se establece como comparación de la intensidad de energía transmitida o reflejada con la intensidad de energía incidente (Murray y Williams,

1987).

  • 3.4.1. Fundamentos de la tecnología NIRS

La espectroscopía de la reflectancia en el infrarrojo cercano (NIRS) es una técnica analítica no destructiva para estudiar las interacciones entre la luz incidente y la superficie de un material (Cheng et al., 2001). La zona NIR del espectro electromagnético se encuentra comprendida entre los 780 y 2.500 nm. La tecnología NIRS se basa en el hecho de que los principales componentes químicos (agua, lípidos, proteína, carbohidratos, etc.) de una muestra tienen diferentes propiedades de absorción en dicha región. Sin embargo, la región más útil para realizar el análisis NIRS se

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encuentra entre los 1.200 y 2.500 nm, debido a que por debajo de los 1.200 nm, las bandas de absorción son tan pequeñas que son difíciles de medir las características cuantitativas por reflectancia y por encima de 2.500 nm la fuerte absorción de las bandas vuelve a dificultar el análisis (Marten et al., 1985, citado por Vera, 2002). El método se basa en que, cuando la luz (energía) incide sobre una muestra, una parte de los fotones se transmite o es reflejada a través de la misma, siendo el resto absorbida. La absorción de energía por la muestra produce que los enlaces entre Carbono e Hidrógeno (C-H), Oxígeno e Hidrógeno (O-H) y Nitrógeno e Hidrógeno (N-H), principales constituyentes de la estructura básica de las sustancias orgánicas; vibren en distintas formas (Givens y Deaville, 1999).

Al ser sometidas las muestras a una radiación NIR, adsorben una cantidad de energía que puede ser evaluada por transmitancia o por reflectancia, según el lugar donde se sitúa el detector. El detector es un componente fundamental del instrumento NIRS que está encargado de la conversión de la energía radiante en señales eléctricas. La reflectancia es obtenida cuando el detector está situado delante de la muestra y la transmitancia cuando éste es ubicado por detrás de ella.

Los términos transmitancia (T) y reflectancia (R) se relacionan de la siguiente manera:

 

T = log(1/R)

Donde:

 

R

: I/I 0

I

: Energía emergente desde la muestra, transmitida para T y reflejada para R

I

0 : Energía incidente sobre la muestra

La interacción de la energía con la materia obedece a la ley de Lambert-Beer, que establece que la absorbancia a cualquier longitud de onda es proporcional al número o concentración de moléculas absorbentes presentes en el camino recorrido por la radiación (Alomar y Fuchslocher, 1998)

En términos más rigurosos, la energía total reflejada por una muestra, es la suma de la reflectancia especular (superficial o en forma de espejo) más la reflectancia difusa, que

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es aquella temporalmente absorbida y luego re-emitida por la muestra (Figura N°1). Sólo esta última forma (reflectancia difusa) entrega información útil acerca de la naturaleza o composición de la muestra, lo que pone de manifiesto el problema de dispersión de luz, que afecta a la reflectancia difusa y que depende del tamaño de partícula de la muestra. Esto complica el análisis NIRS, especialmente en reflectancia, en que no se controla el camino recorrido por la luz debido a la dispersión y hace indispensable el uso de un ordenador para poder procesar la señal (Alomar y Fuchslocher, 1998).

Reflectancia

especular

Luz incidente

Revisión Bibliográfica es aquella temporalmente absorbida y luego re-emitida por la muestra (Figura N°1). Sólo esta

Reflectancia difusa

Muestra
Muestra

Luz transmitida

Fuente: Alomar y Fuchslocher, 1998.

Figura N°1: Interacción de la luz con la materia.

Las muestras absorberán radiación según la Ley de Lambert-Beer en mayor o menor grado a diferentes puntos de longitud de onda, creando un patrón ondulante conocido como espectro, cuya forma es característica de las moléculas absorbentes presentes en la muestra y está afectado por la composición de las moléculas, presencia y magnitud de dipolos, interacción entre moléculas, capacidad de resolución del espectrofotómetro, eficiencia del detector a diferentes longitudes de onda, etc., (Vera, 2002).

La energía de absorción se puede expresar por la Ley de Lambert-Beer como:

A

?

k *c *l

?

Log?I

0

/ I?

?

Log?1/T ?

?

Log?1/ R?

Revisión Bibliográfica

Donde:

A

: Absorbancia

k

: Coeficiente de absorción molecular

c

: Concentración de las moléculas absorbentes

I

: Longitud de onda de la fuente radiante

La utilización de valores de reflectancia en lugar de los comúnmente usados de transmitancia, constituye uno de los rasgos más característicos de la técnica NIRS frente a los demás métodos espectroscópicos. Generalmente la espectroscopía NIR trabaja con datos de Log (1/R), dado que presentan los mejores resultados de correlación con la cantidad de constituyente presente en la muestra, aunque hay que tener presente, que dichos valores de reflectancia se ven afectados por el tamaño de las partículas de la muestra al incidir éste en la dispersión (Vera, 2002).

Una vez obtenidos los espectros mediante el instrumento NIRS, estos pueden ser utilizados en análisis cuantitativos o cualitativos. En un análisis cuantitativo se desarrollan ecuaciones de calibración en las que se relacionan los valores espectrales (Log (1/R)) con los datos obtenidos mediante un método analítico de referencia, utilizando un grupo de muestras de composición conocida (grupo de calibración). Una vez realizada la ecuación de calibración podemos predecir el contenido de otras muestras con características similares a las incluidas en el grupo de calibración. En tanto que en un análisis cualitativo se realizan comparaciones de espectros de un producto desconocido con una biblioteca espectral (“espectroteca”) o con un espectro estándar representativo, que permita categorizar el producto del que se ha obtenido el espectro (Castillo, 2001).

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  • 3.4.1.1. Pretratamientos espectrales.

Los componentes o efectos no deseados presentes en las señales obtenidas en espectroscopía se denominan comúnmente ruido. Este ruido puede tener diferentes causas u orígenes, lo que puede afectar de distinta forma al espectro. Orígenes de ruido son los componentes de la instrumentación utilizada para el registro del espectro (ruido instrumental), variaciones de temperatura, humedad u otras condiciones ambientales durante el registro (ruido ambiental), variaciones en la señal debidas a la propia naturaleza de la muestra. Una manera de corregir o reducir este ruido de los datos espectrales es a través de un pre-tratamiento espectral.

Los pre-tratamientos espectrales más habituales en espectroscopía, tanto en la región NIR como en el resto del espectro, son comentados a continuación.

  • 3.4.1.1.1. Promediado de espectros

El ruido de alta frecuencia es de naturaleza aleatoria, por lo tanto al promediar varias señales de una misma muestra se reduce la contribución del ruido, aumentando la relación señal/ruido. Esta forma de reducción del ruido es comúnmente usada en espectroscopía, siendo el espectro final el resultado de promediar un número determinado de espectros individuales.

  • 3.4.1.1.2. Corrección de la línea base.

Corresponde a un tratamiento que busca corregir determinadas tendencias en la línea base que aportan ruido a la señal. Existen varios tipos de corrección de línea base, dependientes del efecto que se desea corregir. Cuando se trabaja en NIR con Transformada de Fourier, es frecuente utilizar una corrección de la línea base llamada “Tilting” (Mark, 1992) que consiste en corregir el espectro, eliminando la curvatura de manera que se cumplan los requisitos de periodicidad para la transformación.

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Otro tipo de corrección de línea base es el llamado Ajuste de Línea Base (o DeTrending) que ajusta el espectro original a una función cuadrática, sustrayéndola posteriormente del espectro original, eliminando la característica curvatura ascendente a medida que aumenta la longitud de onda. De esta forma, el conjunto de espectros corregidos tiene como media el valor 0 y una varianza diferente de cero. Este pre- tratamiento se aplica a cada espectro individual, por lo tanto no depende de ningún espectro de referencia (Romero, 2001).

  • 3.4.1.1.3. Derivación.

Es utilizado para disminuir los problemas más característicos que se presentan en espectroscopía NIR: solapamiento de bandas y variaciones de línea base causados por efectos de dispersión. La utilización de la primera derivada elimina los términos constantes a todas las longitudes de onda, es decir, desplazamientos de línea base, mientras que la segunda derivada corrige además las desviaciones causadas por los términos que varían linealmente con la longitud de onda. Las derivadas de orden superior generalmente no se utilizan. La aplicación de las derivadas permite un aumento de la resolución de las bandas, pero por el contrario, aumenta el ruido (Romero, 2001).

  • 3.4.1.1.4. Corrección el efecto de dispersión de la radiación o efecto scatter

3.4.1.1.4.1. Corrección del efecto multiplicativo de la dispersión.

Habitualmente conocido como MSC (Multiplicative Scatter Correction), este método, propuesto por Geladi y colaboradores (Geladi et al., 1985) tiene la finalidad de corregir desplazamientos espectrales debidos al diferente tamaño de partícula de muestras. Es por lo tanto un método muy utilizado en NIR, ya que este efecto se presenta en medidas de reflectancia. La corrección se lleva a cabo aplicando a cada espectro original los parámetros de la recta obtenida por mínimos cuadrados representando los valores de absorbancia de un intervalo de longitudes de onda en el que el analito no absorbe frente

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a los valores de absorbancia de un espectro de referencia (normalmente el espectro medio del conjunto a tratar).

3.4.1.1.4.2. Standard Normal Variate (SNV)

SNV corresponde a otro pretratamiento utilizado en la corrección de los efectos de tamaño de partícula en espectroscopía NIR (Barnes et al., 1989). Este procedimiento de corrección consiste en centrar cada espectro, restando el valor medio de absorbancia del espectro a cada uno de los valores de absorbancia a cada longitud de onda, dividiendo el resultado por la desviación estándar del espectro.

En ocasiones resulta conveniente realizar más de un método de pretratamiento espectral para mejorar la calidad de los resultados, siendo común combinar el tratamiento DeTrending con la corrección SNV. Dhanoa et al., (1994) recomiendan realizar primero la corrección de la tendencia de los espectros para posteriormente proceder a la corrección de la dispersión espectral.

  • 3.4.2. Calibraciones NIRS

Para utilizar la información obtenida a través del espectrofotómetro (por tratarse de un método indirecto de análisis), es necesaria la realización de una calibración, mediante la que se relaciona la señal recibida del instrumento con la cantidad de compuesto presente en la muestra o con alguna de sus propiedades. Calibrar consiste en predecir información Y de medidas X obtenidas por el espectrofotómetro a través de una función f() (Ares et al., 2004a):

?

Y ?

f ?X ?

Para el establecimiento de una ecuación de calibración, es necesaria la realización de una serie de pasos, entre los que se incluyen:

?

Selección de muestras del grupo de calibración

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?

Aplicación de métodos de regresión

?

Métodos de pretratamiento de la señal espectroscópica

?

Detección y cuantificación de errores de calibración

?

Selección de la mejor ecuación de calibración

  • 3.4.2.1. Selección de muestras del grupo de calibración.

Corresponde a un paso fundamental en una calibración, dado que si la selección del colectivo de calibración no es adecuada, nunca podrá encontrarse un buen modelo de calibración (Ares et al., 2004b)

Fearn (1992, citado por Ares et al., 2004b) señala que el grupo ideal de calibración estaría formado por una gran cantidad de muestras elegidas al azar, sin embargo, en la práctica esto no siempre es posible, de tal manera que sólo se selecciona un subgrupo representativo del colectivo a estudiar en el caso de que se disponga de un gran número de muestras sobre el que trabajar y en caso contrario; es decir, al tener un número limitado de muestras, no se debe descartar ninguna durante el proceso de calibración, siendo necesario realizar esfuerzos para ampliar el grupo de calibración.

El problema radica en decidir que muestras elegir. Shenk y Westerhaus (1996) proponen un método basado sólo en la información espectral, lo que supone un gran avance en este sentido. El método consiste en obtener los espectros de un gran número de muestras de la población a analizar y a través de la información puramente espectral elegir sólo el grupo de muestras que abarquen la mayor variabilidad del mismo, descartando aquellas que ofrecen información redundante, para posteriormente analizar ese grupo seleccionado y usarlo en la calibración.

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  • 3.4.2.2. Métodos de regresión

Los espectros obtenidos corresponden a vectores, y como tales pueden ser descritos

como vectores y matrices, de manera que:

Y

?

?

?

y

ij

i

?

1

....

1,

j

?

1

....

J

?

?

?

X

?

?

?

x

ik

i

?

1

....1,

k

?

1

....

K

?

?

?

Donde:

Variables a predecir j= 1,2… J (Por ejemplo tiempo de coagulación)

Muestras sobre las que predecir i =1,2… l (Por ejemplo muestras de leche)

Variables sobre las que predecir k=1,2… K (Por ejemplo absorbancia a distintas

longitudes de onda).

  • 3.4.2.2.1. Regresión lineal simple.

Corresponde al método más sencillo de establecer una relación entre dos variables. En

este método se establece la relación entre una variable dependiente, Y, y una variable

independiente X; lo que se representa mediante:

?

Y ?

a ? bX

Los parámetros a y b corresponden a las constantes de la línea de regresión.

?

Y es una

estimación del valor de referencia, de manera que la diferencia entre

?

Y y Y corresponde

al error de la aproximación (e), dado que las relaciones de este tipo raramente son

exactas, sino que más bien son aproximaciones en las que se han omitido muchas

variables de importancia secundaria.

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El desarrollo de una calibración utilizando este modelo consistiría en hallar la longitud

de onda que minimice el error para seguidamente determinar las constantes de regresión

que den la mejor aproximación para todas las muestras del colectivo de calibración.

  • 3.4.2.2.2. Regresión lineal múltiple.

La regresión lineal múltiple es una técnica que intenta modelar probabilísticamente el

valor esperado de una variable Y, a partir de los valores de dos o más predictores. Es un

método muy poderoso y ampliamente utilizado en investigación (Canavos, 1988). La

ecuación general que define este tipo de regresión es:

?

Y

?

?

b

0

?

K

?

X

K

k ? 1

?

b

K

Donde

  • X K

corresponden a las diferentes longitudes de onda y los coeficientes estimados

?

b

0

y

?

b

k

son determinados a partir de los datos iniciales. La calibración consiste en

decidir cuantas longitudes de onda utilizar y tras fijar el grupo de longitudes más

adecuadas, encontrar los coeficientes correspondientes. Existen diferentes métodos para

elegir que longitudes de onda usar en la regresión. El procedimiento “paso a paso”

(step-up o el stepwise) escoge una primera longitud de onda con la mayor correlación

entre los valores NIR y los de referencia, ajustados como una regresión simple, luego

busca la mejor longitud para añadirla como segunda variable en una ecuación de dos

términos y así hasta que coincida con el criterio fijado para detenerse. Otro

procedimiento es el “paso a paso inverso” (step-down), en el que se parte de una

regresión múltiple con todas las longitudes de onda y se van eliminando según criterio

establecido (Ares et al., 2004a).

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  • 3.4.2.2.3. Regresión por componentes principales (PCR)

El objetivo principal de la regresión por componente principales es reemplazar las p

variables que definen una observación, por otras cuyo número es menor que p (Ipiña y

Durán, 2008).

La existencia de colinearidad entre todas variables de X, permite la utilización de este

método. Las variables eliminadas corresponden a aquellas con información redundante

y otras pequeñas variables debidas al ruido. El PCR permite utilizar una región amplia

del espectro sin la preocupación de acotarla, ya que se aprovecha la elevada correlación

entre variables espectrales para reemplazarlas por unas pocas variables que no están

correlacionadas entre sí. Estas nuevas variables se llaman variables latentes, factores o

componentes principales, y se calculan combinando linealmente todas las variables

originales. Por medio de la utilización del análisis PCR la compresión de los datos se

desarrolla de manera independiente al proceso de calibración, reflejando las

componentes principales encontradas la mayor parte de la variabilidad espectral. Cada

componente principal explica la máxima variación sistemáticamente, es decir, que la

primera componente explica la variación más importante, la segunda componente, la

segunda mayor parte y así sucesivamente.

  • 3.4.2.2.4. Regresión por mínimos cuadrados parciales (PLS)

Este método fue desarrollado por H.Wold en 1975 (Hajnal, 1978). La principal

diferencia con respecto a PCR radica en el hecho de que en PLS se intenta contener la

mayor información para la predicción de las muestras en los primeros componentes

principales. Para ello, durante la etapa de calibración, el algoritmo PLS utiliza tanto la

información contenida en la matriz de datos espectroscópicos (matriz X) como la

información contendida en la matriz de la propiedad a determinar (matriz Y),

obteniéndose unas variables auxiliares llamadas variables latentes, factores,

componentes PLS o factores PLS.

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  • 3.4.2.2.5. Regresión por mínimos cuadrados parciales modificados (MPLS)

Corresponde a una variante de la regresión por mínimos cuadrados parciales (PLS). La

regresión MPLS estandariza los residuales obtenidos después del cálculo de cada

término de regresión, dividiéndolos por la desviación típica de los residuales obtenidos

para cada longitud de onda, antes del cálculo del siguiente término de regresión

(González-Martín et al., 2007).

  • 3.4.2.2.6. Regresión mediante redes neuronales (RN).

Entre las propiedades de las RN que han llamado la atención de los estadísticos destacan

las relativas a su buen rendimiento ante problemas no lineales o datos con mucho

«ruido», y el poder utilizarse independientemente del cumplimiento de los supuestos

teóricos relativos a las técnicas estadísticas (Pitarque et al., 2000).

Mediante este tipo de regresión las variables de entrada X desembocan en las variables

de salida a través de otras variables intermedias, a las que se denomina frecuentemente

como variables ocultas. La información de todas las variables de entrada va a cada uno

de los nodos intermedios, estando cada uno de éstos conectados con todas las variables

de salida. Estos nodos estiman la suma de la información que aporta cada variable,

denominados pesos, los cuales se calculan mediante aprendizaje por procesos iterativos

continuos. Este aprendizaje consiste en el ajuste de los pesos de cada nodo basado en

los errores de los valores de salida.

Su uso esta recomendado para casos en los que no exista una colinearidad en los

espectros NIR y ésta implique a un número tan elevado de longitudes de onda que no

puedan ser simplemente eliminadas del grupo de calibración. Su uso mejora

notablemente las calibraciones en las que el grupo de muestras sea muy grande (lo que

aumenta la probabilidad de relaciones no lineales entre ellas) (Ares et al., 2004a).

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3.5.

Aplicación

de

la

agroalimentaria.

tecnología

NIRS

al

análisis

en

la

industria

La potencialidad de la técnica NIRS para la predicción de parámetros químicos clásicos

comienza a vislumbrarse desde la década de los 70 (Garrido et al., 1996), y

posteriormente gracias a las mejoras en instrumentación y software, y particularmente a

la expansión en el uso de equipos monocromadores, se expande la capacidad de la

tecnología, encontrándose día a día nuevas aplicaciones que agilizan y simplifican el

control de calidad en las fases de procesado y distribución de productos agrícolas.

Hoy día la tecnología NIRS se sigue utilizando con el propósito de conocer los

parámetros de evaluación nutritiva tradicionales, como por ejemplo la composición

química de la paja de arroz (Shengying y Hongzhang, 2007), la predicción de la

digestibilidad aparente, valor energético y composición química de cereales enteros

(Deaville et al., 2008), la evaluación de la ingesta y digestibilidad de forraje en

rumiantes (Decruyenaere, 2008), etc.; pero además se ha ampliado a parámetros más

complejos, como aquellas relacionadas al control de calidad de alimentos y que pueden

ser observadas a modo de ejemplo en los trabajos realizados por Guthrie et al., (2005)

(donde se evaluó la capacidad del NIR para predecir los parámetros de calidad interna

de mandarinas), en Galtier et al.,(2007) (donde se determinó el origen geográfico de

aceite de oliva virgen), en García et al., 2002 (para determinar el régimen alimenticio de

lomo fresco del cerdo ibérico), en González-Martín et al., (2003) (para determinar los

ácidos grasos en la grasa subcutánea de cerdo ibérico), Mirálbes (2004) (control de

calidad en la industria molinera), Cozzolino (2002) (para determinar la presencia de

harinas de origen animal en harinas de origen vegetal), etc.,

En las Tablas N°4 y N°5 es posible apreciar algunos de los parámetros en los que se ha

sido y esta siendo utilizada la tecnología NIRS.

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Tabla N°4: Parámetros de evaluación nutritiva tradicionalmente analizados NIRS.

Químicos

Biológicos

Materia seca

Digestibilidad in vitro, T&T

Proteína bruta

Digestibilidad enzimática

Fibra (FB, FND, FAD, LAD)

Digestibilidad in vivo

Extracto etéreo

Nutrientes Digestibles Totales

Cenizas

Ingestión de materia seca

Minerales

Energía (EB, EI), EM, EN)

Fuente: Garrido et al., 1996

Tabla N°5: Usos actuales de la tecnología NIR

Parámetro

Referencia

Contenido de azúcar y acidez en jugo de bayberry

Shao y He, 2007

Análisis rápido de contenido de azúcar en jugo de frutas

Rodríguez-Saona et al., 2001

Diferenciación de muestras de jugo de manzana en base a tratamiento por calor y variedad.

Reid et al., 2005

Firmeza y textura en queso

Cattaneo et al.,2002; Downey et al., 2005

Predicción de los compuestos fenólicos en la fermentación de vino tinto

Cozzolino et al., 2004

Identificación de la calidad, variedades y capacidad antioxidante de té

Chen et al., 2005; Chen et al., 2006; Zhang et al, 2004

Predicción de las características sensoriales de la carne de cordero

Andrés et al., 2007

Identificación de músculos de carne de animales

Cozzolino and Murray, 2004

Predicción de atributos de calidad de la carne de cerdo

Geesink et al., 2003

Predicción de la firmeza y pérdida de humedad en tomates almacenados

Van Dijk et al.,2006

Fuente: Adaptada de Woodcook et al., 2008.

  • 3.5.1. Uso de la tecnología NIRS en la industria láctea

El principal inconveniente del uso de la tecnología NIRS en la industria láctea se

presenta debido al alto contenido de humedad en leche y sus derivados. El contenido de

agua en la leche sobrepasa el 80%, en tanto que en quesos se encuentra en torno a un

60-70%, absorbiendo este componente del producto prácticamente toda la radiación

NIR. Para resolver este problema se han propuesto dos soluciones, el secado de la

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muestra, ya sea a través de liofilización o del secado en filtros de vidrio (método

DESIR) o mediante la corrección de los datos espectrales por medio de tratamientos

matemáticos (Núñez-Sánchez et al., 2008 y Ares et al., 2004b).

La tecnología NIRS en la industria láctea, al igual que en la de los demás productos

agroalimentarios, originalmente se utilizó para determinar los componentes de la leche,

siendo posible encontrar trabajos en las diferentes especies animales, así por ejemplo

Laporte y Paquin (1999) determinaron grasa, proteína y caseína en leche de vaca , Díaz-

Carillo et al., (1993), determinaron grasa, proteína, caseína y fracciones de caseína en

leche de cabra, en tanto que los componentes de la leche de oveja fueron estudiados por

Albanell et al., (2007) y Núñez-Sánchez et al., (2008).

Posteriormente, la tecnología NIRS se ha enfocado a la determinación de parámetros

relacionados con el control de calidad de la leche, así por ejemplo se han realizado

calibraciones para el recuento de células somáticas en leche (Pravdova et al., 2001 y

Tsenkova et al., 2001a, 2001b) determinar el efecto de la alimentación en el contenido

de grasa y proteína de leche de vaca (Purnomoadi et al., 1999). Recientemente, Brennan

et al., (2003) evaluó la utilización de un microespectrómetro NIR para medir el

contenido de grasa de la leche en la línea de ordeño. Posteriormente Kawasaki et al.,

(2008) han propuesto y validado un sistema que permite evaluar en tiempo real, los tres

principales constituyentes de la leche (grasa, proteína y lactosa), realizar un recuento de

células somáticas y medir el nitrógeno ureico en leche no homogenizada.

Woodcock et al., (2008) divide en dos grupos las investigaciones relacionadas con los

productos lácteos, la primera referente a los análisis de evaluación de calidad de la

leche, señalando que es el área donde se encuentra la mayor cantidad de

investigaciones, cuyo propósito es tener información sobre la calidad de la leche y una

segunda área para el análisis de los atributos de la leche, como por ejemplo el conteo de

células somáticas, para identificar la presencia de enfermedades como mastitis.

En la industria quesera, se ha utilizado la tecnología NIRS para detectar la disminución

de frescura del queso fresco Crescenza y definir el tiempo crítico de conservación

(Cattaneo et al., 2005), para analizar el contenido de grasa, humedad, proteína y

cloruros en quesos comerciales elaborados con mezclas de leche de vaca, oveja y cabra

Revisión Bibliográfica

(González-Martín et al., 2008), determinar el porcentaje de leche (vaca, oveja y cabra)

en quesos con diferente tiempo de maduración (González-Martín et al., 2007, Moreno et

al., 2004), predecir los atributos sensoriales y de madurez del queso Cheddar (Downey

et al., 2005), pronosticar el origen geográfico (Karoui et al., 2006) predicción de

determinados aminoácidos libres producidos durante la maduración de los diferentes

tipos de quesos (Skeie et al., 2006).

En cuanto a la utilización de la técnica NIRS en la medición de los parámetros

reológicos y de coagulación de la leche, existen ciertos antecedentes como por ejemplo

Giangiacomo et al., (1998), quienes evaluaron la posibilidad de detectar los principales

eventos críticos relacionados con los fase primaria del coagulado (los que aparecen

pocos minutos antes del cuajado y en el punto de cuajado), sugiriendo que esta

tecnología puede ser útil para su monitorización.

En lo referente a la estimación de los parámetros reológicos por medio de la utilización

de la tecnología NIRS, la mayor parte de las investigaciones (Payne et al., 1993;

O'Callaghan et al., 1999; Castillo et al., 2000) desarrollaron ecuaciones de predicción

usando regresiones lineales únicas o múltiples para una longitud de onda específica de

espectro. Es así como, Ustonol et al., (1991) monitorizó los perfiles de reflectancia

difusa a 950 nm. de leche coagulando, por medio de una sonda de fibra óptica y

comparó varios parámetros de coagulación en leche pasteurizada utilizando ocho

preparaciones comerciales de enzimas. Los perfiles fueron monitorizados durante 60

min. Con este estudio mostró que diferentes enzimas de coagulación de la leche,

estandarizadas para iguales tiempos de coagulación, tienen diferentes y característicos

perfiles al ser medidos por reflectancia difusa NIR a 950 nm.

Castillo et al., (2000) utilizaron un sensor de reflectancia difusa, con fibra óptica y

radiación en el infrarrojo cercano (NIR) a 880 nm, para determinar el momento de corte

visual y el tiempo de coagulación de la leche de cabra.

Payne et al., (1993), desarrollaron métodos basados en los cambios en la reflectancia

difusa durante la coagulación de la leche, por medio de la utilización de una sonda de

fibra óptica (utilizando como fuente de luz un fotodiodo a 940 y 950 nm.), para predecir

el tiempo óptimo de corte, encontrando correlación entre el punto de inflexión de la

Revisión Bibliográfica

curva de reflectancia difusa y el tiempo de corte medido mediante el equipo

Formagraph®. Un estudio similar fue desarrollado por Duffy et al.,(1997) quienes

evaluaron el comportamiento de un sensor NIR para un rango de diferentes procesos

relacionados con la fabricación del queso irlandés, con el propósito de desarrollar

ecuaciones de predicción del tiempo de corte basadas en la comparación con

instrumentos reológicos.

Laporte et al., (1998) monitorizaron el proceso de coagulación de leche de vaca

mediante la toma de espectros NIR entre 1100 y 2500 nm, durante 50 minutos,

(tomando un espectro cada 2 minutos) con el propósito de comparar dichos espectros

con los datos entregados por un coagulómetro basado en una sonda térmica elaborado

por el INRA. Para esto analizaron los datos por el método de mínimos cuadrados

parciales (PLS) y luego aplicaron la segunda derivada. Encontraron un alto grado de

correlación entre ambas técnicas, pero concluyeron que se requieren más

investigaciones que involucren un método de referencia para discriminar entre las

técnicas, a pesar de esto, observaron que la reflectancia NIR es sensible a

modificaciones producidas durante el proceso de coagulación y consecuentemente un

NIR podría ser más preciso que el coagulómetro utilizado para monitorizar la

coagulación de la leche.

En lo relativo a la leche de cabra utilizando una zona amplia del espectro, Ares et al.,

(2004a) analizaron siete parámetros relacionados con la coagulación, utilizando como

método de referencia un tromboelastógrafo, obteniendo ecuaciones aceptables para sólo

tres de los parámetros estudiados.

4. MATERIAL Y MÉTODOS

Material y Métodos

  • 4. Material y Métodos

    • 4.1. Obtención de las muestras de leche

Se tomaron un total de 1047 muestras de leche de cabra de las razas Murciano

Granadina y Malagueña. Las muestras de la raza Murciano Granadina procedían de dos

grupos, el primero de ellos ubicado en la Comunidad Autónoma de Murcia, donde se

recolectaron 447 muestras procedentes de 162 cabras entre el año 2003 y 2006, el

segundo grupo procedente de la provincia de Córdoba, siendo recolectadas 380

muestras de 173 cabras, entre los años 2006 y 2007. Ambos grupos formando parte del

proyecto AGL 2002-04304-C03 (“Efecto de los haplotipos de los genes de las caseínas

y de genes relacionados con el metabolismo de ácidos grasos sobre la composición y

propiedades de la leche de cabra Murciano-Granadina”). De la raza Malagueña se

colectaron 220 muestras de leche, procedentes de 77 animales, de explotaciones de la

provincia de Málaga, a través de un convenio específico con la Asociación Nacional de

Criadores de Cabra Malagueña (ANCCM). En ninguno de los grupos señalados se

realizó una selección de los animales por edad, número de partos o número de crías, por

lo que tal variabilidad fue incorporada a los datos obtenidos por medio de los análisis.

Se debe señalar que las muestras provenientes de la raza Murciano Granadina se

conservaron congeladas por un periodo de tiempo de aproximadamente 2 años antes de

la realización de los análisis por Optigraph® y NIRS.

  • 4.2. Determinación de los parámetros reológicos

La determinación de las características reológicas de la leche se realizo mediante la

utilización de un coagulómetro marca Optigraph®, el que incorpora un microordenador

con los programas informáticos necesarios para realizar la determinación de los

parámetros. Este equipo fue desarrollado en Francia en forma conjunta por

investigadores del Instituto Nacional de Investigación Agraria (INRA) y la empresa

YSEBAERT. Su funcionamiento se basa en los cambios de la señal óptica generada por

Material y Métodos

un haz de rayos infrarrojos de la intensidad elegida, que atraviesa cada una de las 10

microcubetas alineadas, de 1 cm. de ancho, que contienen las muestras de leche (Figura

N°2), que se encuentran situadas en un pocillo donde transcurre el proceso de

coagulación (YSEBAERT, 2000). La señal óptica se transforma en unas células

fotoeléctricas en una corriente eléctrica, cuyo voltaje se mide. Cada microcubeta posee

lateralmente dos ventanas de zafiro enfrentadas, para permitir el paso de la luz

infrarroja. A medida que la coagulación de la leche va avanzando, después de añadir el

cuajo, la intensidad de la radiación recibida disminuye progresivamente, debido al

cambio en la estructura de las caseínas. El registro en el tiempo de la señal recibida va

dando lugar a la curva óptica, a partir de la que se obtienen los valores de los parámetros

de interés (Guyonnet, 1999).

Material y Métodos un haz de rayos infrarrojos de la intensidad elegida, que atraviesa cada una

Figura N°2: Optigraph®

La Figura N°3 simboliza en forma esquemática el proceso ocurrido durante la

coagulación de la leche producida durante el análisis realizado mediante la tecnología

del Optigraph®; el estado líquido de la leche es representado como una línea continua, a

medida que avanza el proceso de coagulación y se produce el endurecimiento de la

cuajada la señal óptica sufre una perturbación en su voltaje, perturbación que es

representada como la apertura de dos líneas en forma de horquilla.

Material y Métodos

Af A fin A A 30 30 20 20 mm mm 30 30 min min K
Af
A fin
A
A 30
30
20
20
mm
mm
30
30
min
min
K 20
K 20
R
R

Figura N°3: Gráfica estándar obtenida mediante un Optigraph®

Los parámetros de coagulación determinados por el Optigraph® son los siguientes:

?

Tiempo de coagulación (R). Corresponde al tiempo estimado (medido en horas,

minutos o segundos) desde que se añade el cuajo a la leche hasta que el efecto de

la enzima coagulante sobre la caseína se evidencia. La coagulación de la leche

produce una gran atenuación de la señal eléctrica en un corto período de tiempo,

atenuación que es detectada por el sensor del aparato, indicando que se ha

comenzado el proceso de coagulación.

?

Velocidad de coagulación (S j ). Establece el tiempo (medido en minutos o

segundos) necesario para alcanzar una determinada firmeza del coágulo que

provoque una atenuación de la señal en una cantidad dada de j voltios. Se mide a

partir de la atenuación de la corriente eléctrica correspondiente al momento de

coagulación en cada cubeta. Se pueden elegir hasta 4 valores de atenuación

diferentes, siendo los elegidos en este estudio los siguientes S 2 = 1000 V; S 4 =

2000 V; S 6 =2500 V; S 8 =3000 V, que se corresponden con distintos estados de

firmeza del coágulo.

Material y Métodos

?

Firmeza del coágulo en tiempo real (AR, A2R). Es medida mediante la variación

de la tensión (en voltios) que tiene lugar en la corriente eléctrica generada como

consecuencia del proceso de coagulación en distintos momentos tras el

comienzo de la coagulación.

?

Firmeza del coágulo medida a una vez el tiempo de coagulación (AR). Es

equivalente a la amplitud alcanzada por la horquilla de un tromboelastógrafo

transcurrido un tiempo similar al necesario para el inicio de la coagulación.

?

Firmeza del coágulo medida a dos veces el tiempo de coagulación (A2R). Es

equivalente a la amplitud alcanzada por la horquilla de un tromboelastógrafo

transcurrido un tiempo dos veces el necesario para el inicio de la coagulación.

?

Firmeza de la cuajada. Corresponde a la amplitud alcanzada por la horquilla de

un tromboelastógrafo transcurrido un tiempo dado a partir del inicio de la

coagulación. Se mide en voltios. Se diferencian:

o

Firmeza de la cuajada a los 20 minutos después de la adición del cuajo

 

(A20).

 

o

Firmeza de la cuajada a los 30 minutos después de la adición del cuajo

 

(A30).

 

o

Firmeza de la cuajada al finalizar totalmente el proceso de cuajado (Af)

 

Corresponde a la amplitud máxima alcanzada por la horquilla en la

Figura N°3.

?

K20. Corresponde al tiempo transcurrido (medido en minutos) desde que la línea

en la Figura N°3 diverge hasta que las líneas se separan 20 mm., este parámetro

permite determinar objetivamente el tiempo de coagulación y realizar estudios

cinéticos del endurecimiento de la cuajada.

Material y Métodos

  • 4.3. Análisis de las muestras por NIRS

    • 4.3.1. Instrumento y software usado

El instrumento NIRS utilizado para tomar los espectros fue un espectrofotómetro FOSS

NIRSystems 6500 System I (Foss NIRSystems Inc., Silver Spring, MD, USA),

equipado con un módulo de giro (Figura N°4). Las muestras fueron analizadas por

reflectancia usando una cápsula circular, mediante la técnica DESIR (Método descrito

por Meurens y Alfaro (1990), y modificado por Díaz-Carillo et al., (1993)). Los

espectros fueron obtenidos usando el software WinISI 1.50 (Infrasoft International, Port

Matilda, PA, USA). Los espectros de reflectancia (log1/R) fueron recogidos por

duplicado.

La temperatura de la sala donde se encuentra el equipo NIRS permanece a 24°C debido

a la sensibilidad que presenta el espectro NIR a las oscilaciones de temperatura.

Material y Métodos 4.3. Análisis de las muestras por NIRS 4.3.1. Instrumento y software usado El

Figura N°4: Instrumento NIRS utilizado para obtener los espectros

Material y Métodos

  • 4.3.2. Preparación de las muestras.

La leche presenta alrededor de un 80-90% de humedad, la que absorbe la mayor parte

de la radiación infrarroja, debido a este problema es necesario realizar un secado previo

de la muestra.

Material y Métodos 4.3.2. Preparación de las muestras. La leche presenta alrededor de un 80-90% de

Figura N°5: Filtro utilizado para el secado de la muestra.

Para ello, se utiliza la metodología DESIR, (Meurens y Alfaro, 1990, Díaz-Carillo et al.,

1993) que consiste en calentar la muestra a 40°C y homogenizarla por agitación suave.

Sobre una placa de Petri impregnar un filtro de vidrio con la muestra (Figura N°5) y

ponerla en otra placa previamente identificada con una etiqueta. Luego pasarla a una

estufa a 40°C durante 6 horas. Las muestras se presentan al NIR en una cápsula del

mismo diámetro del filtro y se tapan con un cristal de cuarzo totalmente transparente a

la radiación infrarroja.

  • 4.4. Toma de espectros.

Como se señaló anteriormente, los valores de absorción de la energía se obtuvieron en

la región espectral que va desde 400 a 2500 nm, tomando intervalos cada 2 nm., y

teniendo de este modo 1050 valores, en la forma de log (1/R). El equipo cuenta con dos

detectores, recogiendo dos regiones espectrales comprendidas entre 400 y 1100 nm y

entre 1100 y 2500. Los datos espectrales se almacenan en ficheros con la extensión

“*.nir”.

Material y Métodos

  • 4.5. Estudio de la variabilidad espectral.

Para el estudio de la variabilidad espectral se utilizó un Análisis de Componentes

Principales, con el objeto de descubrir las categorías establecidas de manera natural

entre los datos.

Se parte de 1050 valores de absorbancia por muestra, pero dentro de esta amplia

cantidad de datos hay información redundante y una amplia correlación entre las

absorbancias de distintas regiones. El Análisis de Componentes Principales permite

reducir la dimensionalidad, describiendo con precisión los valores de p variables por un

pequeño subconjunto r <p de ellas, a costa de una pequeña pérdida de información. Se

analiza si es posible representar adecuadamente esta información con un número menor

de variables construidas por combinaciones lineales de las originales (Peña, 2002).

A través del programa CENTER del software WinISI (Infrasoft Internacional) se realizó

un Análisis de Componentes Principales, con el propósito de reducir el espacio vectorial

inicial, desde 1050 variables, a un número menor que explique casi la misma

información. Estas nuevas variables son una combinación lineal de las originales, y los

ejes que las definen son ortogonales, de manera que no existe correlación entre ellas.

Luego, se calcula la distancia de Mahalanobis o “H”, que determina la distancia entre el

centro de la población espectral y las distancias de las muestras a dicho centro, Se

considera, a través del algoritmo CENTER, que todas aquellas muestras con H>3 no

pertenecen a la población (Shenk y Westerhaus, 1991).

El programa permite identificar muestras cuyos espectros son considerados diferentes a

la media poblacional, conocidos como anómalos o “outliers” espectrales. La aparición

de estos espectros anómalos es debida a errores en la recogida de los espectros o a la

existencia de muestras que por sus diferencias con el resto de la población no pueden

ser consideradas parte de ella.

El programa CENTER elige el número de Componentes Principales en función del

número de muestras de la población y de la variabilidad que éstas recogen (Shenk y

Westerhaus, 1991).

Material y Métodos

Para realizar el centrado del colectivo lácteo se usó un tratamiento matemático de

notación (1,4,4,1) con lo que se enfatizan los pequeños picos de absorción, el

significado de cada uno de los dígitos es el siguiente:

?

1: Orden de derivación, en este caso la derivación es de primer orden

?

4: Anchura de la derivación, en este caso 4 nm

?

4: Corresponde a un procedimiento de suavizado, por el que se toman los datos

de absorbancia de un segmento y se sustituyen por la media de éstos. En este

trabajo se suavizo cada 4 nm.

?

1: Corresponde a un segundo suavizado, siempre se usa 1 nm.

El centrado se realizó utilizando todo el espectro (400 a 2500 nm) y no se utilizó

corrección para el efecto “scatter”.

  • 4.6. Calibraciones NIRS.

El proceso de calibración se inició con la unión entre los datos espectrales y los

parámetros reológicos obtenidos a través del instrumento Optigraph® en una misma

base de datos.

Posteriormente al colectivo de calibración de este trabajo se le aplicó el método de

regresión por mínimos cuadrados parciales modificados (MPLS).

Por medio del uso de esta regresión multivariante se reducen los datos espectrales a una

serie de variables fundamentales (términos de regresión o factores PLS), los que además

de resumir la mayor parte de la información espectral, tienen en cuenta la variabilidad

existente entre los valores de referencia. De este modo, a través de combinaciones

lineales de las longitudes de onda obtenidas a partir de los espectros originales se

reducen los datos espectrales (Martens y Naes, 1987).

El número óptimo de términos de la regresión se calcula a través de una “validación

cruzada”. Este algoritmo selecciona diferentes colectivos de calibración y validación

Material y Métodos

dentro del total de la población considerada, realizando con cada selección una

simulación del algoritmo de regresión. Cada simulación desarrolla ecuaciones con “n”

términos, desde 1 hasta el número máximo aconsejado. Finalmente el programa de

cálculo selecciona la ecuación que hace mínimo el error típico de validación cruzada

(ETVC) (Shenk y Werterhaus, 1996).

Teniendo una población inicial de 1047 espectros se asignó a cada uno de ellos los

valores para los 11 parámetros R, S 2 , S 4 , S 6 , S 8 , AR, A2R, A20, A30, K20, y Af,

obtenidos en el laboratorio.

Como consecuencia de errores en la determinación de las submuestras paralelas, que

proporcionaban amplios e incongruentes errores de laboratorio, y la limitación de no

poder repetir los análisis debido a la inexistencia de las muestras originales (por el

carácter perecedero de la leche), no se contó con valores de referencia obtenidos por

medio de Optigraph® para cada uno de los 1047 espectros.

Para el desarrollo del procedimiento de calibración se utilizó la opción “Develop

equations with the full spectrum” dentro del menú “Global Equations” dentro de la

barra de herramientas en la opción “Regression Equations” del Software WINISI II,

como se aprecia en la Figura N°6.

Material y Métodos dentro del total de la población considerada, realizando con cada selección una simulación

Figura N°6: Procedimiento de calibración y validación en el software WINISI II

Material y Métodos

Para cada uno de los parámetros se aplicaron cinco tratamientos matemáticos. El

primero de ellos corresponde a 0,0,1,1, en los cuatro tratamientos siguientes (“0,0,1,1”;

“1,4,4,1”; “2,4,4,2”;“1,10,5,1”), se realizó una corrección del efecto Scatter SNV+DT.

La región del espectro utilizada comprende entre 400 y 2500 nm, y se utilizaron como

límites el valor 2,5 del estadístico “T” de Student y el valor 10 del estadístico “H” de

Mahalanobis.

  • 4.7. Estadísticos de calibración y criterios de selección de las ecuaciones.

Posterior al desarrollo de las ecuaciones de calibración es necesario seleccionar la mejor

ecuación, basándose en una serie de estadísticos que permiten categorizar las ecuaciones

y seleccionar la que presente los mejores parámetros.

Los estadísticos utilizados para esta selección son los siguientes:

  • a) Error típico de laboratorio (ETL): Es un indicativo de la repetibilidad del método de referencia. Se obtiene a partir de las replicas de los análisis de laboratorio realizadas para cada muestra.

Donde:

ETL ?

2 ? N i ? 1 ( Y ? Y ) 1 i 2 i 2
2
?
N
i ? 1
(
Y
?
Y
)
1
i
2
i
2 N

Y i1 =

Valor de referencia de

la

réplica

1

para la

muestra i del constituyente

considerado.

Y i2 = Valor

de referencia de la

réplica 2 para

la muestra i del constituyente

considerado.

N = Número de muestras.

Material y Métodos

  • b) Error típico de calibración (ETC). Describe como se ajustan las muestras del colectivo de calibración al modelo de regresión utilizado para calcular la ecuación. Mientras menor sea su valor, menor será la diferencia entre lo predicho por NIRS y su valor de referencia que, en este caso, corresponde a los parámetros reológicos obtenidos mediante el Optigraph®.

Donde:

ETC ?

N i ? 1 ? 2 ? ( y ? y ) i i N ?
N
i ? 1
?
2
?
(
y
?
y
)
i
i
N
?
p
?
1

y i = Valor de referencia para la muestra i del grupo de calibración

y i

=

Valor predicho por la

ecuación (NIRS) para la muestra i del grupo de

calibración

N = Número de muestras del grupo de calibración

p = Número de términos de la regresión

Valores cercanos a cero de ETC indican un buen ajuste de la ecuación, dado que su

valor debe tender al ETL (error estándar de laboratorio), que del mismo modo, debe

ser minimizado.

  • c) Error típico de validación cruzada (ETVC): Este estadístico posee la misma fórmula de cálculo que el anterior, pero aplicada al colectivo de validación cruzada. Describe como se ajustan las muestras del colectivo de calibración cruzada al modelo de regresión utilizado para calcular la ecuación. Es un estimador más real que ETC en la predicción de muestras de rutina. Es aconsejable elegir la ecuación que presente los valores más bajos de ETVC. Además, es conveniente que ETVC y ETC se diferencien en menos de un 20%.

Material y Métodos

d) Coeficiente de determinación de la calibración (R 2 ): Corresponde al porcentaje de

la variación existente en el colectivo de calibración para el constituyente

considerado que puede ser explicada por el modelo de regresión. Es deseable que el

valor de R 2 sea lo más próximo a 1, de tal forma que la calibración será más precisa

cuanto mayor sea el valor de R 2 . El coeficiente de determinación del colectivo de

calibración se conoce como R 2 y el de validación cruzada como r 2 .

Donde:

2

R ?

SC

reg

SC

?

SC

res

?

SC

res

total

?

SC

total

SC

total

SC

total

? 1 ?

N

?

  • i ? 1

(

y

i

?

?

y

i

)

2

N
N

?

  • i ? 1

(

y

i

?

y

i

)

2

SC reg : Suma de cuadrados de la regresión

SC res : Suma de cuadrados residual

SC total : Suma de cuadrados total

El valor máximo de R 2 al que se puede aspirar depende tanto del error típico del valor

de referencia como de la desviación típica, en la forma:

Donde:

R

2

max

?

1

? ETL ?

? ?

?

?

DT

?

2

ETL = Error típico de laboratorio

DT = Desviación típica

Debido a esta relación el coeficiente de determinación será mejor cuanto mayor sea DT

en relación con ETL.

Shenk y Westerhaus (1996) indican que las calibraciones con valores mayores a 0,9

para R 2 poseen una excelente capacidad predictiva; cuando el valor de R 2 se encuentra

entre 0,90 y 0,70 las ecuaciones denotan una buena capacidad de predicción; ecuaciones

con R 2 comprendido entre 0,69 y 0,50 permiten una adecuada separación entre muestras

Material y Métodos

de alto, medio y bajo valor en una determinada característica; finalmente, aquellas que

presentan un valor de 0,50 permiten sólo una separación de muestras con valores altos y

bajos.

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Resultados y Discusión

  • 5. Resultados y discusión

    • 5.1. Caracterización reológica del colectivo de calibración utilizado en el análisis NIRS

Las características de coagulación del colectivo de calibración se obtuvieron como un

promedio de dos análisis de cada muestra, conseguidos a través del instrumento

Optigraph®. En la Tabla N°6 es posible apreciar la caracterización reológica de los

colectivos de calibración para tiempo de coagulación (R), velocidad de coagulación (S 2 ,

S 4 , S 6 , S 8 ), firmeza del coágulo en tiempo real (AR, A2R), firmeza de la cuajada (A20,

A30, Af) y K20.

Tabla N°6: Caracterización reológica de los colectivos de calibración para R, S 2 , S 4 , S 6 ,

S 8 , AR, A2R, A20, A30, Af y K20.

Parámetro

N

Media

Máximo

Mínimo

DT

ETL

R

 
  • 829 58,20

9,67

 

6,00

3,61

0,47

AR

 
  • 793 23,83

6,29

 

0,33

3,41

0,48

A2R

 
  • 674 27,14

7,43

 

0,16

4,06

0,50

S 2

 

2,59

  • 910 22,01

 

0,50

2,29

0,39

S 4

 
  • 702 28,49

4,22

 

1,00

3,05

0,45

S 6

 
  • 475 29,05

5,70

 

1,55

3,79

0,48

S 8

 
  • 299 29,30

6,83

 

2,30

3,98

0,51

A20

 
  • 705 20,64

6,19

 

0,19

3,88

0,49

A30

 
  • 660 27,88

7,37

 

0,01

4,28

0,49

Af

 
  • 541 99,98

9,50

 

0,03

11,91

0,50

K20

 
  • 545 23,51

5,41

 

2,90

2,38

0,44

N: Número de muestras de colectivo de calibración. DT: Desviación típica. ETL: Error típico de laboratorio.

El tiempo de comienzo de la coagulación (R) tomó un valor promedio de 9,67 minutos

con un ETL de 0,47 minutos. El conocimiento de este valor es útil para determinar el

tiempo de corte de la cuajada, el parámetro más importante a considerar en las

queserías, que suele tomar un valor de 2 a 3 veces el tiempo de coagulación, lo que

corresponde a un promedio de 20 a 30 minutos. Como se observa en la Figura N°6, el

rango en que se mueve este parámetro, presenta una gran amplitud, lo que es índice de

Resultados y Discusión

la dificultad de estandarizar el procedimiento con un tiempo de corte igual para todas las

partidas de leche.

Al observar las variables relacionas con la firmeza de la cuajada (AR y A2R) se aprecia

que su valor promedio es muy similar (6,3 y 7,4), lo que es indicativo de que el

promedio de la firmeza final del coágulo se adquiere muy pronto. Sin embargo, el rango

de variación de los datos dentro de cada una de las variables (AR o A2R) es muy

amplio, lo que indica una elevada heterogeneidad de las muestras.

La Figura N°7 representa la velocidad de coagulación, descrita mediante los parámetros

S 2 , S 4 , S 6 y S 8 , con relación a la alteración de voltaje producida por el endurecimiento

de la cuajada. Como se observa la velocidad de coagulación presenta una forma

asintótica, siendo lenta al inicio, luego presentando un alza considerable, para disminuir

abruptamente cuando el proceso de coagulación se encuentra en una etapa avanzada.

Velocidad (1/s 0 500 1000 1500 3500 3000 2500 2000 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Velocidad (1/s
0
500
1000
1500
3500
3000
2500
2000
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8

Voltaje (V)

Figura N°7: Velocidad de coagulación (expresada como el inverso del tiempo

requerido para el cambio de voltaje)

Los parámetros A20, A30 y Af, relacionados con la firmeza de la coagulación,

presentaron valores promedio de 6,19; 7,37 y 9,50, con varianzas de 3,88; 4,28 y 11,91,

respectivamente. Estos datos, al igual que los correspondientes a la velocidad de

Resultados y Discusión

coagulación, indican que la mayor parte del endurecimiento de la cuajada se produce en

los primeros minutos del proceso, ya que si se calculan los dos primeros parámetros

como porcentaje del endurecimiento final (Af), el 65% del endurecimiento se ha

producido como promedio a los 20 minutos, en tanto que a los 30 minutos el 77% del

endurecimiento final ha tenido lugar.

Como se aprecia en la Tabla N°6, existe un número diferente de datos para cada uno de

los parámetros analizados, esto es consecuencia de la selección de los datos que se ha

llevado a cabo, considerando la existencia de grandes diferencias entre las réplicas de la

misma muestra para cada parámetro particular. Sólo se usaron aquellos datos cuya

diferencia entre ambas réplicas no fuese mayor a un 5% para cada uno de los

parámetros estudiados.

La realización de un seguimiento exhaustivo de cada muestra, examinando el estado de

conservación de las muestras previo a la realización de los análisis y repitiendo aquellos

análisis que presenten muestras con amplias diferencias entre réplicas es indispensable,

sin embargo, en el presente estudio dicho tratamiento no fue posible, dado que se

trabajó con bases de datos existentes, que no contaban con un respaldo físico. Además,

se debe señalar que la utilización de muestras congeladas puede alterar sus propiedades

reológicas, de este modo, a pesar de existir muestras con réplicas similares, pueden

presentar valores para algunas variables que no necesariamente representen lo que

ocurría al realizar el análisis en muestras en estado fresco.

Lo señalado anteriormente, relativo a los valores de ETL, puede ser observado en la

Tabla N°7 donde se presentan los ETL obtenidos para cada uno de los parámetros

utilizando todos los datos originales. Otras razones, no menos importantes, responsables

del número diferente de datos, fue que algunos parámetros no pudieron ser valorados al

no alcanzarse la alteración de voltaje necesaria para su medición (S 4 , S 6 , S 8 ) y a que dos

veces el tiempo de coagulación (A2R) era mayor a 60 minutos (tiempo máximo dado

para la medición).

Resultados y Discusión

Tabla N°7: Error típico de laboratorio para todas las muestras originales en cada uno de

los parámetros de coagulación.

Parámetro

R

S2

S4

S6

S8

AR

A2R

A20

A30

Af

OK20

ETL

2,4

2,1

3,8

6,0

7,1

1,1

1,9

2,9

2,8

6,0

3,3

En cuanto a la distribución de cada uno de los parámetros medidos, se puede apreciar,

observando el conjunto de figuras entre las Figura N°8 y la Figura N°18, que en gran

parte de los parámetros evaluados la distribución no se asemeja a una distribución

normal, acercándose más a una distribución ? 2 .

En la Figura N°8 se muestra la distribución de valores del parámetro tiempo de

coagulación. Se observa que la mayor parte de los datos (98%) presenta tiempos de

coagulación menores a 18,5 minutos, e incluso más del 72% presenta valores menores a

11 minutos.

56-58,49 38,5-40,99 18,5-20,99 13,5-15,99 8,5-10,99 46-48,49 41-43,49 21-23,49 26-28,49 33,5-35,99 51-53,49 31-33,49 36-38,49 11-13,49 16-18,49 6-8,49
56-58,49
38,5-40,99
18,5-20,99
13,5-15,99
8,5-10,99
46-48,49
41-43,49
21-23,49
26-28,49
33,5-35,99
51-53,49
31-33,49
36-38,49
11-13,49
16-18,49
6-8,49
R
450
53,5-55,99
23,5-25,99
28,5-30,99
48,5-50,99
43,5-45,99
Número de mues
0
50
100
150
200
250
300
350
400

Figura N°8: Histograma del colectivo de calibración para tiempo de coagulación (R).

Resultados y Discusión

La no eliminación de los datos ubicados en el extremo superior se debió a la simetría

encontrada entre los pares de valores repetidos obtenidos para cada muestra analizada,

lo que confirma la fidelidad de estos valores, no obstante, no descarta problemas que se

puedan haber producido en la conservación de dichas muestras. El tiempo de

coagulación promedio obtenido, presenta un valor considerablemente menor al obtenido

por Ares et al., (2004a), que fue de alrededor de 25-26 minutos. La misma situación se

presentó con respecto a la desviación típica y al error típico de laboratorio, para los que

Ares et al., (2004a) observaron valores de 9,84 y 8,16 minutos, para la desviación

típica, y de 1,51 y 1,38 para el error típico de laboratorio. Mayor similitud se observó

con los datos de De La Torre (2006), donde los valores promedios para leche de cabras

de raza Malagueña, fluctuaron entre 8,5 y 12 minutos. Estos valores fueron obtenidos

por medio del coagulómetro Formagraph®, Sin embargo, Kübarsepp et al.,(2005)

comprobaron la fuerte correlación existente entre las mediciones realizadas por

Optigraph® y Formagraph®, indicando que los datos obtenidos por un método pueden

ser usados para la interpretación en estudios en los que se utilice el otro.

La Figura N°9 muestra la distribución de frecuencias del parámetro AR, presentando un

histograma negativamente sesgado; es decir, la mayor parte de los datos se ubican en el

lado izquierdo de la distribución, encontrándose más del 60% de las muestras por

debajo de los 6 voltios y un 95% con valores inferiores a 12 voltios. El parámetro AR

promedio de la muestra (6,29 V) se encuentra dentro del rango de valores (3 a 10

voltios) que observó De la Torre (2006).

Resultados y Discusión

13,5-14,99 6-7,49 0-1,49 3-4,49 9-10,49 1,5-2,99 7,5-8,99 15-16,49 18-19,49 12-13,49 21-22,49 19,5-20,99 10,5-11,99 16,5-17,99 180 AR
13,5-14,99
6-7,49
0-1,49
3-4,49
9-10,49
1,5-2,99
7,5-8,99
15-16,49
18-19,49
12-13,49
21-22,49
19,5-20,99
10,5-11,99
16,5-17,99
180
AR (V)
22,5-23,99
4,5-5,99
Número de mues
0
20
40
60
80
100
120
140
160

Figura N°9: Histograma del colectivo de calibración para la firmeza del coágulo a una

vez el tiempo de coagulación (AR)

La Figura N°10, corresponde al histograma del colectivo de calibración para A2R, este

parámetro al igual que el AR, presentó una distribución negativamente sesgada, aunque

con una mayor dispersión de los datos. El valor promedio se encuentra dentro del rango

de valores (3,3-11,7 V) señalados por De La Torre (2006) para la leche de esta misma

especie.

Resultados y Discusión

10,5-11,99 6-7,49 0-1,49 3-4,49 9-10,49 1,5-2,99 7,5-8,99 12-13,49 18-19,49 15-16,49 24-25,49 21-22,49 27-28,49 13,5-14,99 16,5-17,99 160
10,5-11,99
6-7,49
0-1,49
3-4,49
9-10,49
1,5-2,99
7,5-8,99
12-13,49
18-19,49
15-16,49
24-25,49
21-22,49
27-28,49
13,5-14,99
16,5-17,99
160
19,5-20,99
25,5-26,99
A2R (V)
22,5-23,99
4,5-5,99
Número de mues
0
20
40
60
80
100
120
140

Figura N°10: Histograma del colectivo de calibración para firmeza del coágulo a una

vez el tiempo de coagulación (A2R)

La distribución de la velocidad de coagulación, (Figura N°11 a Figura N°14), en todas

las diferencias de potencial eléctrico evaluadas (S 2 a S 8 ), presentó un patrón similar,

ubicándose más de un 90%, de las muestras bajo los valores de 4,95; 7,00; 10,50 y

11,00 minutos para las variables S 2 , S 4 , S 6 y S 8 , respectivamente ..

Resultados y Discusión

16,95-18,44 S 2 1,95-3,44 6,45-7,94 0,45-1,94 7,95-9,44 3,45-4,94 9,45-10,94 18,45-19,94 10,95-12,44 19,95-21,44 15,45-16,94 12,45-13,94 13,95-15,44 500
16,95-18,44
S 2
1,95-3,44
6,45-7,94
0,45-1,94
7,95-9,44
3,45-4,94
9,45-10,94
18,45-19,94
10,95-12,44
19,95-21,44
15,45-16,94
12,45-13,94
13,95-15,44
500
21,45-22,94
4,95-6,44
Número de mues
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450

Figura N°11: Histograma del colectivo de calibración para velocidad de coagulación

(S 2 ).

14,5-15,99 S 4 1-2,49 7-8,49 8,5-9,99 5,5-6,99 2,5-3,99 16-17,49 10-11,49 13-14,49 19-20,49 22-23,49 25-26,49 28-29,49 250
14,5-15,99
S 4
1-2,49
7-8,49
8,5-9,99
5,5-6,99
2,5-3,99
16-17,49
10-11,49
13-14,49
19-20,49
22-23,49
25-26,49
28-29,49
250
17,5-18,99
11,5-12,99
23,5-24,99
20,5-21,99
26,5-27,99
4-5,49
Número de mues
0
50
100
150
200

Figura N°12: Histograma del colectivo de calibración para velocidad de coagulación

(S 4 ).

Resultados y Discusión

19,5-20,99 S 6 6-7,49 3-4,49 9-10,49 1,5-2,99 7,5-8,99 15-16,49 18-19,49 12-13,49 27-28,49 24-25,49 21-22,49 16,5-17,99 10,5-11,99
19,5-20,99
S 6
6-7,49
3-4,49
9-10,49
1,5-2,99
7,5-8,99
15-16,49
18-19,49
12-13,49
27-28,49
24-25,49
21-22,49
16,5-17,99
10,5-11,99
160
13,5-14,99
28,5-29,99
25,5-26,99
22,5-23,99
4,5-5,99
Número de mues
0
20
40
60
80
100
120
140

Figura N°13: Histograma del colectivo de calibración para velocidad de coagulación

(S 6 ).

18,5-19,99 S 8 8-9,49 5-6,49 2-3,49 6,5-7,99 3,5-4,99 11-12,49 17-18,49 14-15,49 29-30,49 26-27,49 23-24,49 20-21,49 9,5-10,99
18,5-19,99