EL MICROSCOPIO

Ya los antiguos sabían que los espejos curvos y las esferas de cristal llenas de agua
aumentaban el tamaño de las imágenes. En las primeras décadas del siglo XVII se iniciaron
experiencias con lentes (así llamadas por tener forma de lentejas) a fin de lograr el mayor aumento
posible. Para ello se basaron en otro instrumento con lentes que obtuvo gran éxito, el telescopio,
usado por primera vez con fines astronómicos por Galileo, en 1609. Antes de esta fecha, los seres
vivientes más pequeños conocidos eran insectos diminutos. Naturalmente, se daba por sentado que
no existía organismo alguno más pequeño.

Los instrumentos para aumentar la visión de los objetos, o microscopios (la

palabra griega significa “para ver lo pequeño”) comenzaron a usarse
progresivamente. Por primera vez la biología se ampliaba y extendía gracias a un
mecanismo que llevaba el sentido de la vista humana más allá de sus límites
naturales. Así, los naturalistas podían describir en detalle los pequeños organismos,
cosa de otro modo imposible, y los anatomistas podían descubrir estructuras hasta
entonces invisibles. Existían dos tipos de microscopios:
el sencillo y el compuesto; el sencillo no era más que
una lente montada, el compuesto estaba formado por
una combinación de lentes y fue inventado por Zacharias
Jansen en Holanda. La imagen muestra el microscopio
hallado en Middleburg, Holanda correspondiente a
Jansen que contenía dos lentes.
Luego de la invención de Jansen, en pocos años hubo un gran número de
diseñadores de microscopios en Europa. El primer avance técnico del microscopio
luego de Jansen fue el paso de un sistema de 2 lentes a uno de 3, este sistema es la
configuración estándar que se mantiene en los microscopios de hoy. Lo siguiente
intenta resumir los acontecimientos más sobresalientes en la historia de la
microscopía:

• El naturalista holandés J. Swammerdam observó insectos con el

microscopio haciendo hincapié en su conformación, descubrió también
que la sangre no es un líquido uniforme rojo sino que existen
corpúsculos que le dan ese color.
• El botánico inglés Grew estudió los órganos de reproducción de las
plantas y descubrió los granos de polen.
• El anatomista holandés Graaf realizó estudios similares en animales
describiendo ciertos elementos del ovario que desde entonces se
conocen con el nombre de folículos de Graaf.
• Malpighi fue uno de los microscopistas más grandes de la historia de
acuerdo a su espectacular descubrimiento. Sus primeros estudios los
realizó con pulmones de rana, pudiendo observar en ellos una
compleja red de vasos sanguíneos, demasiado pequeños para ser
vistos por separado y muy anastomosados. Cuando siguió el recorrido
de los vasos hasta que se unían con otros mayores, comprobó que estos últimos eran venas en
una dirección y arterias en dirección opuesta. Por consiguiente, las arterias y las venas se
hallaban unidos mediante una red de vasos llamados capilares.
• Otro descubrimiento importante en la época fue el del científico inglés Robert Hooke. El
microscopio lo fascinaba y realizó uno de los mejores trabajos en esta rama, nueva para ese
entonces. En 1665 publicó un libro llamado Micrographia en el cual pueden encontrarse algunos
de los mejores dibujos que se hallan hecho de observaciones microscópicas.
1
La observación simple más importante fue
la de un delgado trozo de corcho sobre el
cual no se sabía porque flotaba en agua y
era tan liviano y firme. Hooke observó que
estaba constituido por una fina trama de
pequeñas celdillas rectangulares en las
cuales se encontraba aire, que él llamó
“células”, un término habitual para designar
pequeñas habitaciones en los monasterios.
El microscopio utilizado por Hooke se
ilustra en la siguiente figura y no había sido
construido por él.

Los primeros en usar el microscopio, incluso Malpighi, usaron sistemas de lentes

que producían aumentos mucho mayores que los obtenidos con una sola lente. Sin
embargo, empleaban lentes imperfectos, de superficies irregulares y con fallas
internas. Si se intentaba lograr un aumento apreciable, la visión de los detalles se
hacía confusa.

• Un comerciante holandés, Anton van

Leeuwenhoek usaba lentes simples, que por
su reducido tamaño podían obtenerse de
pequeños trozos de cristal perfecto. Puliendo
cuidadosamente dichos fragmentos, logró
aumentar un objeto hasta 270 veces sin
perjuicio de la nitidez. Tenía 419 lentes alguna de las cuales eran de cristal de
roca y hasta de diamante, en algunos casos no eran
mayores que el tamaño de un alfiler, por lo que sus
microscopios tenían un tamaño diminuto comparados
con otros de la misma época.
Con esas lentes observaba todo lo que podía y logró
describir los glóbulos rojos de la sangre y los capilares con
mayor detalle que los verdaderos descubridores:
Swammerdam y Malpighi. Pero lo más sensacional de todo
ello fue su descubrimiento de pequeños organismos
invisibles a simple vista, al estudiar aguas estancadas con
su microscopio, con todos los atributos de la vida. Las
descripciones de van Leeuwenhoek eran, desde luego,
imprecisas, pero no cabe duda que fue el primero en ver lo
que más tarde se llamarían bacterias y “animalículos”, como
los denominó entonces, conocidos hoy como protozoarios
que en griego significa pequeños animales.

El microscopio fue perfeccionándose con gran lentitud, uno de los defectos de los
microscopios primitivos era que sus lentes descomponían la luz blanca en los

2
colores que la constituyen. Los objetos pequeños se veían rodeados de anillos de
color (aberración cromática) que impedían observar con claridad los detalles. Pero
alrededor de 1820 se perfeccionaron cuando J. J. Lister, un óptico inglés, diseñó un
microscopio acromático capaz de eliminar los anillos de color que limitaban la
claridad de la imagen. Lister descubrió que los glóbulos rojos eran en realidad,
discos bicóncavos. El microscopio acromático constituyó un gran avance, iniciando
una serie de perfeccionamientos que dieron como resultado el moderno microscópio
óptico.
Desde 1660 hasta la actualidad el microscopio óptico ha sido el pilar
fundamental en el conocimiento de lo invisible. Aunque su poder de resolución
aumentó a través del tiempo (con la mejora en la calidad de las lentes) al igual que el
poder de magnificación, su factor limitante fue la longitud de onda de la luz.

PARTES DEL MICROSCOPIO OPTICO

En el microscopio distinguimos un sistema óptico destinado a la iluminación y
obtención de una imagen muy aumentada del objeto examinado, y un sistema
mecánico (o montura), cuya finalidad es la de
sustentar convenientemente los elementos ópticos y
los preparados que se examinan.

¾ La parte óptica fundamental del microscopio

está formada por dos sistemas centrados de
lentes de aumento o convergentes: el objetivo y
el ocular, y por el aparato de iluminación, que
facilita y mejora la observación microscópica.

♦ El objetivo está compuesto por un sistema

centrado de lentes convergentes. Existen
distintos tipos de objetivos, que se diferencian
por las características de su composición, o por
la manera de utilizarse:
• Objetivos a seco:
En éstos, el aire se interpone entre su lente y el preparado. Los objetivos más
comúnmente utilizados son de 4, 10, 40 y 45 X.
• Objetivos a inmersión:
Se distinguen de los anteriores porque entre la lente y el preparado se debe
interponer un medio transparente con un índice de refracción (n) superior al del aire
(n=1), y semejante al del vidrio (n=1.5), que permite aprovechar un mayor número de
rayos refractados por el preparado para la formación de la imagen. El medio utilizado
es un aceite de inmersión, como por ejemplo el aceite de cedro. La distancia al
preparado utilizando estos objetivos es muy pequeña y suelen tener un muelle
protector para evitar roturas.

♦ El ocular recibe la imagen dada por el objetivo. Está compuesta por dos
lentes: la inferior o colectora, y la superior, o lente ocular.

3
 ♦ El aparato de iluminación, situado debajo de la platina, está formado por:
• Espejo: cuando existe, posee una cara plana y otra cóncava
destinadas a proyectar el haz de rayos que iluminará el objeto, dirigiéndolos
hacia arriba del eje óptico. Los microscopios con luz incorporada generalmente
no poseen espejo.
• Condensador: está constituido por un sistema de lentes convergentes
que proyecta sobre el preparado en forma de un amplio cono el haz de luz que lo
atraviesa. Concentra los rayos luminosos procedentes de la fuente de luz sobre
la preparación.

• Diafragma: dispuesto debajo del

condensador, sirve para graduar la cantidad de
rayos luminosos que llegan al objeto.
• Filtros de luz: son placas de vidrio
coloreadas que dejan pasar las radiaciones de
longitud de onda más convenientes para la
más adecuada observación (κ=400-500 nm),
absorbiendo las restantes.

FUNCIONAMIENTO DEL MICROSCOPIO

El objetivo del microscopio actúa como

una cámara fotográfica. Cuando un objeto se sitúa más allá del foco de su lente, se
produce una imagen ampliada, real e invertida.
El ocular actúa como una lupa que observa la imagen que ha formado el
objetivo, construyendo una nueva imagen mucho más ampliada, virtual y derecha
con relación a aquella, pero invertida con relación al objeto examinado.
Así, la imagen del microscopio compuesto resulta de la combinación de las
provocadas por una lente (objetivo) que actúa como una cámara fotográfica, y otra
(ocular) que actúa como una lupa que observa la imagen formada por la primera.

En la figura anteriores podemos observar, de manera muy simplificada, que la

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imagen aumentada, producida por el objetivo, es tomada por el ocular (como si fuera
un objeto) y es magnificada nuevamente. Por lo tanto, la imagen definitiva (que es
invertida respecto de la original) resulta el producto entre el aumento del objetivo por
el aumento del ocular. En consecuencia, los mayores aumentos que pueden
conseguirse con el microscopio óptico son de 1000-1500 x. Esto significa que una
estructura que mide un micrometro puede observarse como si tuvieran 1 o 1,5
milímetros. Sin embargo, ¿por qué existe una limitación en la amplificación que
puede brindar un sistema de lentes? El principal problema radica en que la
capacidad de aumentar una imagen no es la única propiedad a tener en cuenta para
una buena observación.

Aumento:
Es la proporción entre el tamaño de la imagen observada al microscopio y el
tamaño real del objeto.
La forma de calcular el aumento en el cual se está trabajando consiste en
multiplicar el aumento correspondiente al ocular por el aumento correspondiente al
objetivo que se está utilizando para visualizar el preparado.
Ejemplo:
Ocular: 10x Aumento: 400 x
Objetivo: 40x

Distancia frontal:
Es la distancia ente el objeto observado y la lente del objetivo cuando el
preparado se encuentra enfocado correctamente. Es inversamente proporcional al
aumento, es decir, que a medida que se utilizan objetivos de mayor aumento
disminuye la distancia frontal y por lo tanto aumenta el riesgo de romper el
preparado.

Profundidad de campo o de foco o poder de penetración:

Es el espesor del preparado que se observa con nitidez, es decir, profundidad
de planos que están en foco en un momento dado. Con aumentos medianos o
grandes, al mover el tornillo micrométrico, podemos observar sólo pequeños
espesores con nitidez, mientras que por encima y por debajo de esta zona la imagen
se desvanece.
La profundidad de foco guarda relación inversa con el aumento: es tanto menor
cuanto mayor es el aumento de la lente. Con inmersión en aceite, la profundidad de
campo es muy escasa (menor que 1 µm).

Campo observado:
Es la porción del preparado incluida en la imagen. Se representa por el
diámetro de la parte de la preparación que se está observando (área del campo). El
tamaño del campo observado es inversamente proporcional al aumento total del
microscopio, y por esta razón las lentes de pequeño aumento son útiles para rastrear
la preparación. Si cambiamos de un objetivo a otro de mayor aumento,
observaremos una imagen más aumentada pero que incluirá sólo una parte de lo
que observábamos con el objetivo menor.
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Poder de resolución:
Es la capacidad de las lentes de distinguir o resolver (mostrar separados) con
nitidez dos puntos situados muy próximos entre sí. Se expresa como la distancia
mínima que permite dar una imagen bien definida de dos puntos, en vez de verlos
como uno solo.
Cuanto mayor es el poder de resolución (PR), menor es la distancia que
separa dos puntos entre sí sin que estos se confundan. En consecuencia, cuanto
mayor sea el poder resolutivo del objetivo, más finos serán los detalles de la
preparación que puedan distinguirse.

Límite de resolución:
Es la distancia mínima que debe existir ente dos puntos del objeto para que
puedan visualizarse separados. En los microscopios ópticos, el límite de resolución
no es, en general, inferior a 0.2 µm.

Apertura numérica:
Es una medida es una medida de la capacidad del microscopio de agrupar las
refracciones de la luz producidas por los finos detalles del objeto, debido a que
determina el tamaño del haz de luz que es captado por el objetivo luego de haber
pasado a través del objeto. Es una característica propia de cada objetivo, es por esto
que forma parte de las inscripciones grabadas en los objetivos.

El límite de resolución del microscopio óptico es de 0,2 mm mientras que la del

ojo humano es de 0,1 mm. La profundidad y el diámetro del campo, como así
también la distancia focal son inversamente proporcionales a la apertura numérica.
Por ejemplo, el objetivo de 4x tiene una pequeña apertura numérica y por ello se lo
utiliza como objetivo panorámico.
Para conseguir el poder máxima de resolución hay que utilizar el objetivo de
inmersión (100x) en el cual debemos aumentar el valor de la apertura numérica. Esto
se logra aumentando el índice de refracción del medio interpuesto entre el objeto y la
lente frontal del objetivo (2 x n x seno de α, donde n es el índice de refracción del
medio y α es el ángulo de abertura del objetivo). Para ello, se utilizan medios como
el aceite de inmersión, que poseen un índice de refracción superior al aire y similar al
del vidrio del portaobjetos y al de las lentes. Ello permite que los rayos lumínicos no
se desvíen y de ese modo se consigue mayor información del
objeto en la formación de la imagen resultante

VARIANTES DE MICROSCOPIO OPTICO

ESTEREOMICROSCOPIO O LUPA BINOCULAR

El estereomicroscopio consta realmente de dos
microscopios completos, cada uno con su objetivo y ocular en
los que, al no coincidir sus ejes ópticos, las imágenes
formadas en los oculares son distintas (lo mismo que ocurre
con la visión ocular), por lo que vemos una imagen de tres
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dimensiones.
No debe confundirse este aparato óptico con los microscopios binoculares, ya
que en éstos la imagen formada en un único objetivo es desdoblada en dos
imágenes idénticas por un prisma situado entre el objetivo y los dos oculares.
Puede apreciarse que la lupa posee un par de oculares, cada uno de los
cuales se enfoca independientemente del otro, con el fin de proveer una imagen
nítida para ambos ojos. Nótese que éste es un instrumento de baja magnificación.

EL MICROSCOPIO INVERTIDO
En el laboratorio de virología se utiliza muchísimo el microscopio invertido que
no es más que una variante del microscopio convencional que, tal y como indica su
nombre, tiene invertida la posición normal de los objetivos, que están, en el revólver,
por debajo de la platina, mientras que la luz de la fuente de iluminación, a través del
condensador y del diafragma, llega desde encima de la platina, lo que facilita cierto
tipo de trabajos como el control del estado de las monocapas celulares cuando se
trabaja con botellas o tubos de cultivo

EL MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO

Se le llama también ultramicroscopio y es un microscopio óptico cuyo sistema
condensador ha sido modificado para dirigir la luz a la preparación desde los lados,
de tal modo que sólo la luz difractada por la preparación pasa al ocular y se hace
visible. A causa de esta disposición, la muestra en el preparado aparece iluminada
sobre un fondo oscuro.
La microscopía de campo oscuro hace posible la observación en estado vivo
de partículas y células que de otra manera estarían por debajo de los límites de
resolución del microscopio óptico, aunque resulten visibles pocos detalles
estructurales. La microscopía de campo oscuro ha sido ampliamente usada en el
estudio de pequeñas células móviles tales como Treponema pallidum, la espiroqueta
causante de la sífilis, que es invisible con microscopía óptica.

MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES

El estudio de estructuras in vivo es normalmente muy difícil, ya que sus
componentes, con raras excepciones, son incoloros y transparentes. El microscopio
de contraste de fase permite el estudio de muchas estructuras celulares in vivo.
Generalmente se utiliza en combinación con las técnicas de cultivo de células y
tejidos, y también para el examen de células recientemente removidas de animales
vivos, o también material fijado, pero sin colorear.
Esta técnica se basa en el hecho de que las diferentes estructuras celulares
introducen pequeñas variaciones de fase en las radiaciones, retrasándolas
ligeramente, siendo estos retrasos diferentes según el tipo de estructura. Con este
microscopio, el bajo contraste existente se refuerza por medio de un sistema óptico
especial que transforma las diferencias de fase, que no son captadas por el ojo
humano, en diferencias de amplitud (intensidad luminosa), que sí son detectables.
En el microscopio de contraste de fase existen dispositivos especiales
que transforman estas diferencias de fase en diferencias de amplitud, produciendo
en consecuencia diferencias de intensidad luminosa, para las cuales la retina es
7
sensible.

MICROSCOPIO DE POLARIZACIÓN
Cuando la luz atraviesa ciertas sustancias o estructuras, sufre una división de
tal orden que de un solo rayo luminoso a la entrada, resultan dos rayos llamados
polarizados.
Tal capacidad se debe a que esas sustancias poseen una ordenación interna
y periódica de sus átomos. Sea o no aparente esta ordenación, se dice que tales
cuerpos tienen estado cristalino. Por el contrario, las sustancias que no pertenecen
a este grupo se llaman amorfas.
La velocidad a la que se propaga la luz en estos cuerpos amorfos, también llamados isótropos o
monorrefringentes, es siempre igual, independientemente de la dirección que siga dentro de ellos.
Así, el cuerpo tienen un único índice de refracción.
En los cuerpos cristalinos, o anisótropos o birrefringentes, la velocidad de la
luz varía según la dirección de propagación, lo que da lugar al fenómeno conocido
con el nombre de doble refracción. De un único rayo luminoso resultan dos rayos
refractados, que son polarizados rectilíneamente; esto es, la dirección de la vibración
de la luz pasa a seguir una dirección determinada.
El microscopio de polarización emplea un prisma que deja pasar solamente la
luz polarizada rectilíneamente, eliminando otros rayos por reflexión total. Este
instrumento óptico está compuesto de una platina rotatoria, a la que se le añaden
dos polarizadores: uno ubicado debajo de la platina (polarizador) y el otro, encima de
ella, junto al ocular analizador).
Polarizador y analizador están colocados de tal manera que sus secciones principales están
cruzadas, o sea, se cortan perpendicularmente. En estas condiciones el observador no ve ninguna
luz en el ocular.
Cuando se coloca en la platina un cuerpo amorfo, esta situación no se altera
porque la luz no sufre modificación. Lo contrario ocurre cuando observamos un
cuerpo cristalino o birrefringente. Entonces, y según la orientación de ese cuerpo en
la platina, la luz brilla con mayor o menor intensidad. El microscopio de polarización
sirve, entonces, para distinguir las sustancias monorrefringentes de las
birrefringentes. Además, permite conocer la ordenación interna de las sustancias
birrefringentes, su orientación a escala submicroscópica.

EL MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA
Algunos colorantes denominados fluorocromos tienen la propiedad de ser
excitados (pasar a un nivel superior de energía) cuando absorben luz ultravioleta (luz
de longitud de onda corta). A medida que las moléculas excitadas regresan a su
estado normal liberan el exceso de energía en forma de luz visible de mayor longitud
de onda que la radiación excitante. Esta propiedad se denomina fluorescencia. Se
han desarrollado métodos microscópicos modernos que aprovechan la mayor
detección que posibilita este sistema.
Este tipo de microscopios lleva una fuente luminosa que emite radiaciones
ultravioleta, en el límite del espectro visible, que atraviesan el material de la
preparación de la misma forma en que lo hace un microscopio óptico. Las lentes
suelen ser de cuarzo ya que el vidrio absorbe la radiación ultravioleta. A
continuación del objetivo lleva unos filtros que retienen la radiación ultravioleta, que
8
es peligrosa para el ojo humano, dejando pasar solamente la radiación visible, que
no es peligrosa.
Hoy día se utiliza mucho un microscopio de fluorescencia en el cual la luz es
emitida desde arriba del preparado (epifluorescencia). Un filtro deja pasar luz de la
longitud de onda deseada para excitar al fluorocromo y un filtro barrera en el objetivo
protege al ojo del observador de la radiación fluorescente. Los objetos fluorescentes
aparecen brillantemente iluminados contra un fondo oscuro, según el color del
colorante usado.

EL MICROSCOPIO CONFOCAL
El microscopio confocal es un microscopio óptico que incorpora dos
diafragmas: un diafragma de iluminación, generalmente de tamaño invariable y
localizado tras la fuente luminosa, y un diafragma de detección, de tamaño variable
situado delante del fotodetector.
La utilidad de este diafragma de
detección es eliminar la luz proveniente de
planos superiores e inferiores al plano focal,
aumentando con ello la claridad y resolución
de la imagen. Esta capacidad de obtener
SECCIONES ÓPTICAS es la característica
principal y exclusiva del microscopio
confocal.
La obtención de secciones ópticas
más o menos gruesas viene determinada por
una combinación entre el diámetro del
diafragma de detección, la apertura numérica
del objetivo y de la longitud de onda de la luz
utilizada.
El haz de láser es dirigido a un punto concreto del plano focal. La luz reflejada
por la muestra o la fluorescencia emitida es dirigida y captada por un fotodetector,
una vez atraviesa el diafragma. La imagen focal se optiene tras rastrear la muestra
(scanning) con el láser. Las imágenes obtenidas son siempre imágenes digitales:
Los fotodetectores (PMTs) transforman la señal lumínica en una señal eléctrica que
mediante el sistema informático acoplado se traduce en un píxel. Cada píxel/voxel,
proporciona información referente a la localización tridimensional del punto excitado,
así como la intensidad lumínica de dicho punto.
Las principales aplicaciones de la microscopía confocal son, entre otras
-expresión y localización de moléculas en 2 o 3 dimensiones permitiendo reconstrucción
tridimensional, tanto en cultivos celulares, como tejidos histológicos,
- estudios de proteínas u otro tipo de moléculas
- transporte intracelular, endocitosis,
- medidas de concentraciones de iones intracelulares,
- desarrollo y expresión génica,
- hibridación in situ con sondas fluorescentes.

CON EL MICROSCOPIO ÓPTICO SE PUEDEN OBSERVAR:

La forma general de la mayoría de las células procariontes
9
 La forma general de las células eucariontes
Algunas organelas eucariontes: núcleo, nucleólos, cromosomas, mitocondrias,
cloroplastos, flagelos, cilias, centriolos, vacuolas, pared celular. Estas
estructuras se identifican con claridad utilizando alguna técnica accesoria con
preparación de la muestra.
NO PUEDEN OBSERVARSE CON EL MICROSCOPIO ÓPTICO:
Las bacterias más pequeñas
La estructura interna de las células procariontes
La estructura de las organelas eucariontes
La membrana plasmática
Los conjuntos membranosos como los retículos endoplásmicos y el aparato
de Golgi, aunque su ubicación en la célula puede ser revelada mediante
ciertas técnicas
Los ribosomas

MICROSCOPIO ELECTRONICO
En 1930 el mundo submicroscópico se amplió con la aparición del
microscopio electrónico cuya ventaja principal con respecto al microscopio óptico es
un aumento de 1000 veces en la magnificación del material observado acompañado
de una mayor capacidad de resolución generando una mejor definición y una
ampliación del mundo microscópico. ADN, virus y pequeñas organelas fueron
observadas por primera vez con este microscopio. Vamos a referirnos a las
características del ME que lo diferencian de la microscopía de luz y que permite
mejorar el límite de resolución de este último. Se logran haces de electrones con una
longitud de onda de 0,05 nm, cuyo poder de resolución es de 0,2 nm mientras que
la longitud de onda de la luz visible oscila alrededor de 500 nm y su poder de
resolución es de 0,2 µm. La resolución en un ME depende de la condición del
potencial acelerador

Por lo tanto la gran diferencia radica en reemplazar el haz de luz fotónica

por un haz de electrones que se genera en el cañón electrónico, donde un filamento
de tungsteno en forma de V y con propiedades de termoemisión, al calentárselo con
un voltaje de calentamiento del cátodo produce el haz de electrones. El filamento
constituye el cátodo y está rodeado por un cilindro abierto (cilindro de Wehnelt) que
contribuye a producir un haz más pequeño pero de igual intensidad. El ánodo es un
disco abierto en la base del cilindro de Wehnelt conectado a tierra (con potencial
10
cero). Los electrones generados son acelerados por un voltaje de aceleración
negativo entre el cátodo y el ánodo de 1000 KV (fuente de alta tensión); el ánodo
atrae los electrones, los saca fuera evitando la acumulación en el filamento, genera
una fuente puntual de electrones y además es enfocante.
El haz de electrones se genera en una columna con un alto vacío a fin de
evitar la dispersión de los electrones al chocar con las partículas de la atmósfera. El
alto vacío se logra en general mediante una bomba difusora apoyada por una bomba
mecánica. La columna tiene un lugar donde introducir el espécimen en una
precámara; la misma se pre-vacía antes de ser comunicada con la columna para
introducir el espécimen que consiste en una grilla de unos 4 mm de diámetro de
cobre o níquel de 200 o 300 mesh, donde se recogen los cortes del material
biológico, los cuales deben ser lo suficientemente finos (60 nm). Una cámara
fotográfica se ubica debajo de la pantalla, por lo general en alto vacío y que se
comunica con la columna al levantarse la pantalla y abrirse un shunt.
El sistema óptico del ME consiste en bobinas electromagnéticas; las lentes condensadoras
concentran el haz sobre el especimen y permiten también regular la intensidad de luz. La lente
objetivo forma la primera imagen aumentada de la porción iluminada del especimen en un plano
que luego se puede volver a aumentar por las lentes proyectoras. Las lentes objetivas y
proyectoras juntas magnifican la imagen sobre una pantalla fluorescente o cuando ésta se levanta
sobre una placa fotográfica. La lente objetivo es la más crítica porque de ella depende el poder de
resolución. Las lentes intermedias y proyectoras se usan en condiciones tales que los errores de la
lente no interfieren seriamente con la imagen, usando aperturas angulares tan pequeñas que la
aberraciones son escasas.
En la microscopía electrónica de transmisión (MET), los electrones que
atraviesan la muestra son los que van a impactar en la pantalla para dar la imagen, a
diferencia de la microscopía de scanning (o barrido) (MES o MEB), en la que no
son los electrones transmitidos los que dan la imagen sino los electrones
secundarios que son refractados en la superficie del material biológico. Pero la
diferencia con la MO es que en ésta la imagen se forma porque el material absorbe
la luz, proceso intensificado por las tinciones del especimen, lo que resulta en
diferencias visibles en diversas partes de la imagen. En el ME en cambio, la porción
de electrones absorbido por el material biológico es infinitésima. La formación de la
imagen no se basa en la absorción de electrones sino que se basa en la pérdida de
electrones del haz por el scattering (o dispersión) en distintos puntos del preparado.
La imagen se forma en blanco y negro correspondiendo el negro a las zonas con
alta densidad de material capaz de dispersar electrones; el blanco corresponde a los
electrones que no fueron desviados y atraviesan el espécimen y constituyen el
background. Existen escalas de grises.

Podemos resumir las diferencias entre el MO y el ME :

1) Las lentes magnéticas no tienen distancias focales fijas como las lentes ópticas.
La distancia focal es dependiente de la intensidad de campo, cambiando la
corriente que pasa a través de la bobina.
2) En el ME no es necesario cambiar la lente de Objetivo o las proyectoras cuando
se desean distintas magnificaciones. Esto se logra variando la distancia focal de
la proyectora, en tanto que la magnificación del objetivo es siempre fija.

11
3) El modo de formar la imagen es diferente en los 2 microscopios. En el MO se
forma por absorción diferente de la luz, en tanto que en el ME la pérdida de
electrones por dispersión en puntos individuales del espécimen resulta en
variaciones de la intensidad de la imagen (contraste).
Resulta claro por qué es necesario cortes muy finos. A tal fin el material
biológico debe estar incluido en resinas especiales para vacío y con una rigidez
suficiente para poder seccionarlo tan finamente en un ultramicrótomo con cuchillas
de vidrio o de diamante. Dichas resinas son hidrofóbicas y requieren una
deshidratación previa con solventes como acetona. Tratamientos tan drásticos hacen
indispensables una adecuada fijación del material biológico que asegure la correcta
preservación de la ultraestructura.
Para ello el material debe ser procesado de manera específica y rigurosa.
Este procesamiento incluye fijaciones, deshidrataciones, inclusiones, cortes
ultradelgados, tinciones o contrastados.
Un hecho destacable con el desarrollo del ME fue que mientras el
microscopio de luz u óptico (MO) alcanzó su perfección de más de 2 siglos de
desarrollo, el ME alcanzó un nivel comparable en el espacio corto de 2 décadas.
Una enorme expansión de nuestro conocimiento de la ultraestructura de
la materia ha tenido lugar gracias al ME. Ambos, instrumento y técnicas se han
vuelto casi de rutina, lo que ha permitido la respuesta a muchos problemas
fundamentales de significado biológico y médico.

12
 MO (a)
El microscopio óptico tiene
un limite resolución de cerca
de 200 nm (0.2 µm). Este
límite se debe a la longitud de
onda de la luz (0.4-0.7 µm).
Las células observadas bajo el
microscopio óptico pueden
estar vivas o fijadas y teñidas
Características principales del (a) Microscopio óptico, (b) Microscopio electrónico de transmisión y (c)
Microscopio electrónico de barrido.
MET (b)
El microscopio electrónico
de transmisión (MET) tiene
un límite de resolución de
cerca de 2 nm. Esto es debido
a limitaciones del lente usado
para enfocar electrones hacia
la muestra. Un MET mira a
replicas de células muertas,
después de haber sido fijadas
y teñidas con iones de
metales pesados. Los
electrones son dispersados
cuando pasan a través de una
fina sección del espécimen, y
luego detectados y
proyectados hacia una imagen
sobre una pantalla
fluorescente.
MEB (c)
El microscopio electrónico
de barrido (MEB) también
tiene un límite de 2nm. Al igual
que el MET, el MEB permite
mirar a células muertas,
después de haber sido fijadas
y teñidas con iones de
metales pesados. Con esta
técnica los electrones son
reflectados sobre la superficie
del espécimen.
13