1 INTRODUCCIÓN

Las enzimas son de naturaleza proteica, proteínas complejas, que producen un cambio químico
específico en otras sustancias, son biocatalizadores. Estas son afectadas principalmente por la
temperatura, el pH y la concentraciones de sales en el medio, se debe trabajar en condiciones
óptimas para poder lograr la mayor eficiencia de ellas, hay que tener presente que al ser
proteínas, son lábiles, por lo que si los parámetros nombrados no tienen un buen control, los
cambios pueden alterar el desempeño de la enzima, desactivarla o destruirla. La cuantificación
de la actividad enzimática, velocidad de reacción o cantidad de enzima que cataliza la
conversión de 1 µmol de sustrato en un minuto, se debe realizar bajo condiciones óptimas de
los parámetros nombrados anteriormente para la obtención de óptimos resultados.

Las enzimas a nivel industrial son ocupadas en biorreactores continuos, por lote o por lote
alimentado. El reactor enzimático más utilizado en el área industrial y específicamente en la
industria alimentaria es el biorreactor por lote, de manejo simple y de mucha utilidad por su
funcionalidad en los procesos de producción. Algunos lugares donde se utilizan estos reactores
son en la industria: cervezera, panificadoras, jugo, etc. Al igual que las enzimas, los reactores
enzimáticos tienen factores que entorpecen su funcionamiento óptimo, además de los
nombrados anteriormente para las enzimas, dentro de los cuales podemos nombrar:
concentración del sustrato, tipo de enzima, capacidad del flujo y parámetros cinéticos de la
reacción.

El almidón se encuentra ampliamente distribuido en los órganos de las plantas como

carbohidrato de reserva. Es también, componente de gran cantidad de alimentos, siendo la
fuente más importante de carbohidratos en la alimentación humana. Además los almidones y
sus derivados tienen gran importancia en diferentes ramas de la industria, tales como la
alimentaria, textil y del papel. Su obtención se lleva a cabo principalmente a partir de maíz,
mijo, papa, trigo y arroz. Se encuentra formado por dos componentes, amilosa y amilopectina,
ambas compuestas por cadenas largas de moléculas de glucosa, en la mayoría de los
almidones el porcentaje de amilosa es del 20% y de amilopectina del 80%, La amilasa es un
polímero lineal formado de unidades D-glucosa unidas por enlaces α(1-4), en cambio, la
amilopectina es una macromolécula ramificada en las que unidades D-glucosa están
unidas por enlaces α(1-4) cuando forman parte de cadenas lineales y por enlaces α(1-
6) cuando actúan como nexo de unión entre dos cadenas para formar ramificaciones. La alfa-
amilasa cataliza la hidrólisis del almidón cortando los enlaces interiores α(1-4) para formar una
mezcla de dextrina con poca producción de maltosa, al ser una endoenzima corta los enlaces
al azar.

La experiencia en el laboratorio constará en la determinación de actividad enzimática de la alfa-

amilasa comercial y en la puesta en marcha y operación de un reactor enzimático por lotes, en
el cual se espera alcanzar un 20% de conversión enzimática en un periodo de tiempo de 2
horas.
2 MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Materiales
2.1.1 Equipos
• Balanza analítica

• Baño termostático a 60ºC

• Agitador vertical

• Espectrofotómetro

• Pesa agitadora y calefactora

• Refrigerador

2.1.2 Enzimas y reactivos

• Enzima alfa-amilasa de B.licheniformis Termamyl 120L de NOVO Nordisk

• Solución almidón a 20 (g/L)

• Tampón acetato 0,02 M a pH 5

• Reactivo DNS

• 1,6 (g) de NaOH

• 30 (g) de tartrato de sodio y potasio

• Agua desionizada
2.1.3 Materiales
• Vaso precipitado 100 mL

• Espátula

• Pizeta

• Aluza de aluminio

• Agitador magnético

• Matraz de aforo de 100 mL

• Tubos de ensayo

• Gradilla

• Pipeta graduada de 1, 2,5, 5 y 10 mL

• Propipeta

• Matraz Erlenmeyer

• Mechero

2.2 Métodos

2.2.1 Métodos analíticos

2.2.1.1 Método DNS
El método consiste en que las azucares reductoras del producto, en este caso, puedan
reducir el ácido dinitrosalicílico (DNS), dando así una coloración anaranjada a la
mezcla, la que refleja una mayor concentración de azucares reductores mientras más
intenso se vaya tornando el color mencionado.
Preparación reactivo DNS:
• En un vaso precipitado con 50 mL de agua destilada disuelva 1.6 g de NaOH
• Disolver luego 30 g de tartrato de sodio y potasio
 • Calentar con agitación y agregar lentamente 1 g de ácido dinitrosalicílico
• Aforar a 100 mL
• Almacenar bajo refrigeración y protegido de la luz

2.2.1.2 Método turbidimétrico

Este método mide la reducción de la intensidad de la luz al pasar por una suspensión de
partículas, la cual arroja un valor de absorbancia que se interceptará en una curva de
calibrado para obtener ciertas concentraciones.

2.2.1.3 Curva de calibrado

La curva de calibrado es un método de química analítica empleado para medir
la concentración de una sustancia en una muestra por comparación con una serie de
elementos de concentración conocida. Se basa en la existencia de una relación en
principio lineal entre un carácter medible (por ejemplo la absorbancia en los enfoques
de espectrofotometría) y la variable a determinar (la concentración). Para ello, se
efectúan diluciones de unas muestras de contenido conocido y se produce su lectura y
el consiguiente establecimiento de una función matemática que relacione ambas;
después, se lee el mismo carácter en la muestra problema y, mediante la sustitución de
la variable independiente de esa función, se obtiene la concentración de esta (Harris,
Daniel Charles (2003). Quantitative chemical analysis).

2.2.2 Métodos experimentales

2.2.2.1 Confección curva patrón de glucosa

• Se deben realizar soluciones de glucosa de concentraciones 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5 y
3 (g/L)
• Se realiza el análisis de azúcares reductores a las soluciones antes señaladas,
por duplicado
• La curva patrón se construye graficando la absorbancia a 540 nm versus la
concentración en g/L
2.2.2.2 Determinación de actividad enzimática
• Adicionar en 6 tubos de ensayo 0.9 mL de una solución de almidón de
concentración 20 (g/L)
• Incubar 4 de los tubos señalados anteriormente en un baño a 60 º C por 4
minutos de manera que la solución de almidón alcance la temperatura del baño
• Adicionar 0.1 mL de solución enzimática
• Incubar 2 tubos por 2 minutos y los otros dos por 4 minutos, al cabo de los
cuales se adiciona 1 mL del reactivo DNS para detener la reacción
• A los otros dos tubos se les adiciona el reactivo DNS y luego 0.1 mL de solución
enzimática
• Con los seis tubos se procede según lo indicado en la metodología para la
determinación de azúcares reductores

2.2.2.2.1 Preparación tampón acetato

Componente Concentración
Acetato de sodio 0.36g/L
Ácido acético 0.3mL/L
2.2.2.2.2 Preparación solución almidón
Se prepara utilizando tampón acetato 0.02 M a pH 5. Se debe calentar parte del
tampón y cuando éste ebulla se adiciona lentamente el almidón suspendido en tampón.
Una vez que se ha adicionado todo el almidón se deja ebullir por 2 minutos.

2.2.2.2.3 Determinación de azucares reductores

• Agregar 1 mL de reactivo a 1 mL de muestra ( el blanco se hace con agua
destilada como muestra) en un tubo de ensayo y luego taparlo
• Incubar en baño de agua a ebullición por 15 minutos
• Enfriar el tubo en un baño de hielo
• Agregar al tubo 10 mL de agua destilada y dejar reposar por 15 minutos
• Determinar la absorbancia de la mezcla a 540 nm

2.2.2.3 Puesta en marcha del reactor enzimático

so V Gt
X − ln ( 1 − X ) = m t ec1 X = ec 2
Km Km A

• Cargar el reactor con el medio de reacción consistente en una solución de almidón de

una concentración de 20 (g/L) , preparada con tampón acetato 0.02 M a pH 5
• Introducir el reactor en un baño termostático a 60ºC.
• Poner en marcha el sistema de agitación
• Esperar que el medio de reacción alcance la temperatura de reacción, de 60ºC.
• Adicionar la enzima
• Antes de adicionar la enzima se debe sacar una muestra para determinar la
concentración de azúcares reductores a tiempo cero.
• Se comienza a registrar el tiempo de reacción y tomar muestras de un volumen de 2
mL a intervalos de 15 minutos, luego se determinará la concentración de azúcares
reductores.

2.2.2.3.1 Tratamiento de las muestras

Las muestras deben ser tratadas para inactivar la enzima y asegurarse de que se
detiene la reacción, esto se logra con un cambio brusco de pH.
• En tubos de ensayo , colocar 0.1 ml de hidróxido de sodio 5N
• Diluir las muestras cuando corresponda, para llegar a una concentración de azúcares
reductores dentro de un rango de linealidad del método DNS (0-1 g/L), esto se logra con
la ecuación del reactor que mezcla un balance al sustrato y la velocidad de reacción de
la enzima, y la ecuación del porcentaje de conversión; las cuales se muestran a
continuación:
3 RESULTADOS Y DISCUSIONES

3.1 Determinación de curva patrón de glucosa

Para la determinación de los azúcares reductores se realizó una curva patrón, ocupando el

y =0,519
−x
9 0,002
método DNS, obteniendo la siguiente ecuación , a continuación se
muestra la curva patrón.
 Figura 1: curva patrón de glucosa (ver anexo 1, tabla 3.1)

Esta curva nos servirá para la obtención de la actividad enzimática de la á-amilasa

comercial.

3.2 Determinación de Actividad Enzimática

A partir de la curva patrón mencionada anteriormente, se obtuvieron las concentraciones de

azúcares reductores en el tiempo, con la cual se obtendrá la velocidad máxima de reacción.
 Figura 2: Determinación de actividad enzimática (ver anexo 2, tabla 3.2)

En la gráfica se puede observar la velocidad de reacción de la enzima, correspondiendo al

valor de la pendiente, 0,0808 g/L*min (4,848 g/L*h). Con este valor e incluyendo las diluciones
previas de la enzima, se pudo calcular el valor experimental de la velocidad de reacción de la

VM (experim ental)= 96960

g L/ h*
enzima (ver Anexo 2, ec3).

3.3 Puesta en marcha: Determinación del grado de conversión de la reacción en

función del tiempo de operación

El grado de conversión de la reacción en función del tiempo de operación, tiene una estrecha
relación entre la concentración de glucosa producida y el almidón hidrolizado, por efecto de la
alfa amilasa. A continuación se muestran las figuras correspondientes a la determinación de la
concentración de glucosa, el grado de conversión teórico y experimental de la reacción en
función del tiempo en el reactor enzimático.

Figura 3: Concentración de glucosa en el tiempo (ver anexo 3, tabla 3.3.1)

Figura 4: Grado de conversión experimental de la reacción en función del tiempo de operación (ver
anexo 3, tabla 3.3.2)
 Figura 5: Grado de conversión teórico de la reacción en función del tiempo de operación (ver anexo 3,
tabla 3.3.3)

VM(experimental) VM ( Teorico )
Gracias a los valores de y (ver anexo 3, ec1) se pudo estimar el volumen

Volumen( Enzima ) = 10,8µ L

de la enzima al adicionar en el reactor ( ; ver anexo 3, ec4) para la
puesta en marcha, bajo las condiciones de pH 5, temperatura 60 ºC. Cabe mencionar que la

VM ( Teorico )
se recalculó, debido a que no se pudo adicionar el volumen de enzima antes
mencionado, por el poco volumen con el que se contaba en el laboratorio, debido a esto, se

VM ( Teorico ) = 1, 93( g / L* h)
adiciono un volumen de 10 µL de enzima, dándonos un (ver anexo 3,
ec5), con el cual se calcularon los grados de conversión a los distintos tiempos. A causa del
nuevo Vm teórico, la conversión de 20% ya no se cumpliría a las 2 horas que habíamos
estimado, sino que esta sufriría un desfase de 20 minutos.

Como se aprecia en la figura 5 el porcentaje de conversión experimental fue sobrepasado en

casi el doble (37,86%), al estimado en el cálculo teórico (20%). El parámetro que determinó
este cambio, lo atañamos a la temperatura, debido a que la curva teórica se confeccionó con
los datos obtenidos de la determinación de la actividad enzimática, los cuales estuvieron
ambientados a 60ºC, en cambio, la puesta en marcha en un comienzo tuvo una temperatura
mayor, debido a que la solución tampón con sustrato venía en su punto de ebullición y el
periodo de tiempo que transcurrió para su ambientación con el baño térmico (todo esto al
interior del reactor) no fue la suficiente para una perfecta estabilización a 60 ºC.
Cuantitativamente esto se refleja en la segunda muestra a los 15 minutos, se observa
claramente en la figura 5 que la pendiente entre el punto 0 y 15 es mucho más elevada que en
los puntos restantes, de hecho en estos puntos la pendiente resulta en su mayoría constante.
4 CONCLUSIÓN

Los objetivos planteados en un comienzo se cumplieron parcialmente, se determinó la actividad

enzimática y posteriormente se puso en marcha un reactor enzimático por lote a condiciones de
temperatura 60ºC (siendo el óptimo para la enzima de 80ºC) y pH 5, en la cual se esperaba un
grado de conversión del 20%, sin embargo, este porcentaje fue distinto al esperado, el
porcentaje obtenido a las 2 horas de operación fue casi el doble (37,86%), esto debido a las
condiciones en las que se operó en un comienzo. Lo cual de todas maneras nos sirvió para la
familiarización de una puesta en marcha y además para el desarrollo analítico en lo que
respecta a los parámetros que pueden influir en este proceso.

De acuerdo a los datos obtenidos y al análisis realizado se pudo observar que hay parámetros
que afectan la actividad de la enzima, siendo estos el volumen de enzima adicionado para
llevar a cabo la reacción, el pH y la temperatura. Este último fue uno de los más influyentes en
esta experiencia, ya que al no alcanzar la estabilidad térmica, en un comienzo, aceleró el poder
catalítico de la enzima al encontrarse cercano a su óptimo, 80ºC.
5 BIBLIOGRAFÍA

• Illanes, A. “Biotecnología de enzimas”, 1994. Ediciones universitarias de Valparaíso de

la Universidad Católica de Valparaíso. Valparaíso, Chile.

• Illanes, A. Acevedo, F. Gentina, J.C. 2002. “Fundamentos de Ingeniería Bioquímica”,

Ediciones Universitarias de Valparaíso, Chile.

• Harris, Daniel Charles 2003. Artículo “Quantitative chemical analysis”.

ANEXO

Anexo 1: Curva patrón de glucosa

Tabla 3.1: Determinación curva patrón de glucosa

Anexo 2: Actividad enzimática

Tabla 3.2: Determinación de actividad enzimática

Tiempo Absorvancia Concentración

(min) (540 nm) (g/L)

0 0,11665705 0,05832852

2 0,27822658 1,13911329

4 0,45999231 2,22999615

Determinación de la velocidad experimental de reacción:

La velocidad de reacción enzimática se calculo mediante la siguiente ecuación:

 M * d * D = VM (exp erimental ) ec3

Donde:

M = pendiente
d = dilucion.tubo.ensayo
D = dilucion.matraz

Obteniéndose así:

 gr.glu cos a 
VM = 0, 0808  *10*2000
 Lt *min 
 gr.glu cos a 
VM = 1616 
 Lt * min 
 gr.glu cos a 
VM = 96960 
 Lt * h 

Anexo 3: Puesta en marcha.

Tabla 3.3.1: Concentración de glucosa en el tiempo.

Tabla 3.3.2: Grado de conversión experimental de la reacción en función del tiempo de
operación.
Tiempo (h) X
0 0,004
0
Tiempo 0,155
Glucosa
1 0,233
(h) (g/L)
1 0,295
0,0000 0,073
1 0,320
0,2500 3,105
1 0,383
0,5000 4,663
2 0,423
0,7500 5,910
2 0,415
1,0000 6,403
2 0,379
1,2500 7,657
1,5000 8,450
1,7500 8,297
2,0000 7,574

Tabla 3.3.3: Grado de conversión teórico de la reacción en función del tiempo de operación.

Tiempo (h) X
0,0000 0
0,2500 0,012
 so V
X − ln ( 1 − X ) = m t ec1
Km Km

0,5000 0,024
0,7500 0,036
1,0000 0,048
1,2500 0,060
1,5000 0,071
1,7500 0,083
2,0000 0,095

Determinación de la Velocidad teórica de reacción y volumen de enzima.

Velocidad Teórica de reacción.

La velocidad Teórica de reacción se calcula mediante la ecuación de comportamiento del
reactor.

Donde:

 gr.almidon 
S0 : 20  
 Lt
K M = 1( teorico )
X = 20%( gradoconversion)
t = 2h.

20 VM ( teorico )
*0, 2 − ln(1 − 0, 2) = *2
1 1

Por lo tanto:

 gr.glu cos a 
VM (teorico ) = 2,1 
 lt * h 

Volumen de enzima.

Datos:
  gr.glu cos a 
VM (Teorico ) = 2,1 
 Lt * h 
 gr.glu cos a 
VM ( Experimental ) = 96960 
 Lt * h 
Volumen( reaccion ) = 500. ml

 gGlu cos a 
2,1  ⋅ 500ml
 L⋅h 
Volumen( enzima ) =
 gGlu cos a 
96960  
 L⋅h  ec. 4

Volumen( Enzima ) = 10,8µ L

Ya que realmente se adicionaron 10 µL de enzima, la velocidad teórica se recalcula

quedando:

 gr.glu cos a
VM (teorico ) = 1,93 
 lt * h  ec5.