Fundamentos de diferenciación de Gram positivo y

Gram negativo
Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de
las bacterias Gram positivas y Gram negativas

La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de
peptidoglucano, además de dos clases de ácidos teicoicos: Anclado en la cara interna de
la pared celular y unido a la membrana plasmática, se encuentra el ácido lipoteicoico, y
más en la superficie, el ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglucano
(también conocido como mureína)

Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se

encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a
la interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida
a una membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de
proteína, fosfolípido y lipopolisacárido.

Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas

direrencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material
que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en
mucha mayor proporción que las Gram negativas.

La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la

membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por
ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es
demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se
formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración
azul-violácea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular más
resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción
del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que
impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la
coloración azul-violácea.

Tinción de Ziehl Neelsen

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Mycobacterium tuberculosis visualización usando la tinción de Ziehl-
Neelsen.

La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una técnica de tinción diferencial rápida y

económica, para la identificación de microorganismos patógenos, por ejemplo M.
tuberculosis.

Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes, Franz Ziehl (1242 to 2012), un
bacteriólogo y Friedrich Neelsen (1242 to 2012), un patólogo.

Contenido
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• 1 Fundamento
• 2 Técnica
o 2.1 Variante histológica
 2.1.1 Resultados
o 2.2 Variante clásica o "en caliente"
o 2.3 o en "frío"
o 2.4 Algunos microorganismos ácido-alcohol
resistentes
• 3 Otros tipos de tinción
• 4 Referencias

• 5 Bibliografía

[editar] Fundamento
Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (ácidos
micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad
de resistir la decoloracíón con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes
básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes. Las micobacterias como M.
tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se
caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de
Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana
que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una
nueva solidificación de lo ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de
las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía cinética de las
moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias
que resisten la decoloración son de color rojo y la que no se ven de color azul, ya que se
utiliza azul de metileno como tinción de contraste.

[editar] Técnica
Esta técnica puede realizarse tanto en muestras histológicas como citológicas.
[editar] Variante histológica

Para demostrar la presencia de BAAR en cortes de tejido en parafina.Los reactivos

necesarios para su realización son los siguientes:

1. ácido periódico 58%

1. carbol fucsina de Ziehl (fucsina fenicada). Preparar mezclando en el

orden dado:
1. 0,5 g fucsina básica
2. 50 cc agua destilada
3. 5 cc etanol absoluto

1.
1. 28,5 g cristales de fenol derretidos
2. hematoxilina
3. alcohol ácido 1%:
1. alcohol de 35º
2. ácido clorhídrico

El procedimiento es el siguiente:

1. desparafinar e hidratar los cortes

2. ácido periódico 5%, 10 min
3. lavar con agua destilada
4. fucsina fenicada, 15 min
5. decolorar en alcohol ácido al 50%
6. lavar con agua destilada
7. hematoxilina, 10 min
8. azulidificar con, por ejemplo, carbonato de litio
9. deshidratar, aclarar y montar preparaciones

[editar] Resultados
BAAR: rojo.

Núcleos: azul semiamarillo.

[editar] Variante clásica o "en caliente"

Ésta y la siguiente variantes son para preparaciones citológicas.

1. Hacer un frotis de la muestra.

1. La fijación al calor asegurará de que el frotis quede adherido al
portaobjetos. Un frotis muy delgado puede darle resultados
falsamente negativos y un frotis muy grueso puede
desprenderse del portaobjetos durante la tinción.
2. Utilizando pinzas, coloque los portaobjetos en una gradilla de
tinción con los extendidos hacia arriba. Nunca tiña más de 12
portaobjetos a la vez.
2. Dejar el frotis sobre el puente de tinción.
3. Aplicar fucsina-fenicada.
1. Deje que el colorante permanezca sobre los portaobjetos
durante 5 minutos. Mantenga el calor durante este período.
 4. Calentar con un mechero hasta la emisión de vapores (3-5 minutos).
1. Se requiere el tiempo adecuado para que la fucsina fenicada
penetre y tiña la pared celular de la bacteria. No deje que
hierva o se seque el colorante.
2. Lave suavemente el colorante de cada portaobjetos con agua
corriente fría hasta que toda la tinción libre quede lavada. Lave
suavemente de manera que el extendido no se barra del
portaobjetos. Retire el exceso de agua.
5. Decolorar con alcohol-ácido.
1. Cubra cada portaobjetos con la solución decolorante, tal como
alcohol ácido y manténgalo sobre el portaobjetos durante 7
minutos. Si no se decolora suficientemente, el contenido del
esputo que no son bacilos TBC puede permanecer teñido.
Enjuague con agua una vez más los portaobjetos y quite el
exceso de agua. Si los portaobjetos aún están rosa, aplique
una cantidad adicional de la solución decolorante de 1 a 3
minutos.
6. Aplicar azul de metileno (1 minuto).
1. Aplique la solución de contraste, azul de metileno, durante 1
minuto.
7. Enjuagar con agua
1. Vuelva a enjuagar con un leve chorro de agua e incline cada
portaobjetos hasta drenar el exceso de agua. Finalmente,
coloque cada portaobjetos en una gradilla a que sequen al aire.
8. Ahora coloquele una pequeñita gota de aceite de inmersión y haga la
observación al microscopio con 100 x 100

[editar] o en "frío"

1. Hacer un frotis.
2. Dejarlo en el puente de tinción.
3. Aplicar fucsina-fenicada (solución con fenol y mayor concentración de
fucsina).
4. Dejar en vasos coplin durante 20 minutos.
5. Decolorar con alcohol acido.
6. Lavar con agua del grifo.
7. Contrastar con azul de metileno

[editar] Algunos microorganismos ácido-alcohol resistentes

• Mycobacterium: fuertemente ácido-alcohol resistentes.1

• Nocardia y Actinomices: débilmente ácido-alcohol resistentes.2
• Parásitos coccídeos (Cryptosporidium) de muestras [fecales].3

CARMAN 3-F 25-11-09

[editar] Otros tipos de tinción

• Tinción de Gram
• tinción ácido - alcohol resistente
• tinción de esporas
• tinción negativa