Laboratorio de Bioquímica Industrial

Practica 4: Evaluación de los factores que

afectan la actividad enzimatica

IQI 8vo semestre

Integrantes:
Anabel Magaña Ake
Roger Canto Varguez
Gonzalo curiel gomez
Introducción
La vida depende de una serie de reacciones químicas cuyo curos y velocidad
están determinados por las presencia de diversos catalizadores orgánicos
denominados enzimas. Las enzimas se definen como un catalizador biológico y,
como todos los catalizadores, las enzimas aumentan la rapidez de una reacción
química sin sufrir un cambio químico permanente en sí mismas. Un catalizador
influye en la rapidez de una reacción química pero no afecta el equilibrio de ésta.
La mayoría de las enzimas, a diferencia de los catalizadores químicos, sol
altamente específicas en cuanto a la naturaleza del sustrato (S) que utilizan y al
tipo de reacción que cataliza.
La mayor parte de las enzimas desde el punto de vista bioquímico son
compuestos que pertenecen al grupo de las proteínas. Debido a su carácter
proteínico, las enzimas son muy sensibles a cualquier cambio físico, químico o
físicoquímico. Así, cualquier cambio en la temperatura, el pH, la fuerza iónica, la
adición de sales, la presencia de agentes oxidantes o reductores, la presencia de
metales pesados, etc. Producen modificaciones profundas en su actividad. En
general, cualquier factor que sea capaz de desnaturalizar a las proteínas será
capaz de alterar su actividad.

Hay varios factores que afectan la velocidad de una reacción catalizada por
enzimas. Algunos de ellos son: temperatura, pH, concentración de sustrato,
concentración de enzima e inhibidores.

Concentración de la enzima

Si en una reacción enzimática, se mantienen fijas las variables menos la

concentración de la enzima, la actividad enzimática aumenta proporcionalmente
con respecto a la concentración de la enzima.

Si la enzima está en exceso, capta todo el sustrato; este se convierte entonces en

un factor limitante de la reacción.1
Concentración del Sustrato

Cuando las variables se mantienen fijas incluyendo la concentración de la enzima,

en un principio la velocidad de la acción es directamente proporcional a la
concentración del sustrato, pero luego se estabiliza en un valor máximo. Este valor
representa el punto en el cual las moléculas de enzima se combinan con
moléculas de sustrato a la mayor velocidad posible, en este punto se dice que la
enzima está saturada de sustrato.1
pH
La concentración del ión hidrógeno, o pH, en la mezcla de reacción ejerce una
influencia definitiva sobre el ritmo de actividad enzimática. El pH donde la actividad
es mayor, es el pH óptimo; a partir de este punto, hacia uno y otro lado de la
actividad disminuye, cada enzima tiene un pH óptimo de actividad: de 1.5 a 2.5
para la pepsina; de 8 a 11 para tripsina, etc. Los cambios grandes de pH pueden
desnaturalizar a la proteína y la actividad enzimática se pierde. 1
Temperatura

La rapidez de la mayor parte de las reacciones químicas aumenta al doble o triple

por cada 10°C de temperatura. Esto también es cierto para reacciones en las
cuales el catalizador es una enzima, aunque los límites de temperatura son más
estrechos. Los límites de actividad para la mayor parte de enzimas tiene lugar
entre 10°C y 50°C; la temperatura óptima para enzimas en el cuerpo humano se
halla alrededor de 37°C. El aumento de intensidad de actividad observado a 50°C,
o por encima, dura poco, porque la temperatura elevada desnaturaliza y coagula la
proteína enzimática, con lo cual desaparece su actividad. Por lo tanto la
temperatura óptima de una enzima depende de un equilibrio entre la intensidad de
actividad al aumentar la temperatura y la desnaturalización o inactividad por el
calor.1
Objetivos
Evaluar el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática
Evaluar el efecto de la concentración del sustrato sobre la actividad enzimática.
Evaluar el efecto del pH sobre la actividad enzimática.
Evaluar el efecto de la concentración de la enzima sobre la actividad enzimática.

MATERIAL Y EQUIPO SOLUCIONES

Baños térmicos a 5, 25, 40, 50,60 y 92 Agua destilada
ºC Reactivo de DNS
Vortex Buffer de fosfatos 0.02 M pH 7.0
Pipetas volumétricas de 10, 5 y 1 ml Solución de almidon 8 mg/ml
Micropipeta de 100 a 1000 microlitros Soluciones reguladoras de pH
Puntas para micropipetas 3,5,6,7,8,9 y 10
Espectofotrometro UV NaOH 2N
Celdas para espectofotometro Solución de amilasa salival
Termómetro
30 tubos de ensayo
Gradillas
Pizeta
Vasos de precipitados de 100 y 500
Placa de calentamiento.
Experimento 1

Efecto de la temperatura en la actividad enzimática

La velocidad de cualquier reacción cambia al modificarse la temperatura,

debido a los cambios de la energía cinética, sin embargo, debido a la
constitución proteínica de las enzimas , las temperaturas altas producen a
desnaturalización y una marcada disminución de la actividad catalítica.

Para la gran mayoría de los animales homotermos, la temperatura óptima esta

al rededor de los 37°C; cerca de los 60°, la mayor parte de las enzimas se
desnaturalizan

Procedimiento

1. se prepararon los tubos de acuerdo a lo siguiente

Reactivos 1 2 3 4 5 6 7

Almidon 0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Sol. De fosfatos 0 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5

Agua destilada 5 3 3 3 3 3 3

Temperatura de 25 5 25 40 50 60 92
incubacion

Amilasa salival 0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

2. Los tubos se incubaron por 15 minutos a la temperatura correspondiente

3. se adiciono 1 ml de reactivo DNS a cada tubo

4. los tubos se llevaron a ebullición por 5 minutos en baño térmico

5. se leyó la absorbancia @ 540 nm

Resultados

Temperatura 5 25 40 50 60 92
Absorbancia 0.0010 0.0030 0.0010 -0.0020 -0.0020 -0.0030
Almidón 7.930 7.925 7.930 7.947 7.947 7.954
mg/ml7

En este experimento tuvimos varios problemas al momento de realizar las

lecturas ya que fuimos el ultimo equipo en hacerlas y nuestros tubos ya con el
reactivo DNS estuvieron expuestos a la luz por mas de 1 hora, sin embargo la
gráfica logra mostrarnos el rápido paso hacia la desnaturalización
aproximadamente a 50°C
Concentración final de almidon vs temperatura
7.96
Concentración de almidon

7.95

7.94

7.93

7.92

7.91
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Temperatura

Experimento 2

Efecto de la concentración del sustrato

Procedimiento

1. se prepararon los tubos de acuerdo a lo siguiente

Reactivos Tubos
1 2 3 4 5 6 7 8
Almidón 0.5 1 2 3 4 5 7.5 0
Sol. Reguladora 7 6.5 5.5 4.5 3.5 2.5 0 8

de fosfatos

Amilasa salival 0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0

 2. Se incubaron por espacio de 15 minutos a 40 °C

3. una vez transcurrido el tiempo se le adiciono 1 ml de reactivo DNS

4. se leyeron las absorbancias @ 540 nm

Resultados

[S] 0.53 1.06 2.13 3.2 4.2 5.3 8

Abs. 0.006 0.005 0.016 0.009 0.026 0.017 0.021

Almidón convertido vs concentración de almidon

0.25
f(x) = 0.04 ln(x) + 0.12
R² = 0.61
0.2
Almidon convertido

0.15

0.1

0.05

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Concentración inicial de almidón

Grafica Lineweaver-Burke para la amilasa

160
f(x) = 40.98x + 84.31
R² = 0.64 140

120

100

80
1/v

60

40

20

0
-3 -2 -1 0 1 2 3
1/[S]
Utilizando la gráfica obtenemos una Km =0.487 mg/ml

EXPERIMENTO 3.- Efecto del pH sobre la actividad enzimática

El pH es uno de los factores que mas afecta la actividad de las enzimas, ya que
afecta la estabilidad de la molécula por desnaturalización, o bien afecta su
carga eléctrica. Muchos de los grupos ionizables presentes en la molécula de la
enzima pueden ser necesarios para la catálisis y el grado de ionización de los
residuos de aminoácidos en la superficie de la enzima esta en función del pH
del medio. Cada enzima posee un pH óptimo donde su actividad enzimática es
óptima.

El factor que mas influye es la titulación de los grupos ionizables que

mantienen la carga en la superficie, actúan en el sitio activo o estabilizan la
enzima; cualquier modificación del o debida al pH altera estas condiciones.

El efecto del pH puede proporcionar una información valiosa respecto a la

naturaleza de la enzima y al sitio activo en particular, lo que constituye
información sobre el mecanismo de reacción.

Resultados

0 1 2 3 4 5 6 7
pH 7 3 5 6 7 8 9 10
Abs. BLANC 0.029 0.042 0.020 0.019 0.052 0.019 0.021
O

a) En base a los resultados, ¿Cuál es el pH óptimo de la amilasa salival?

R= de acuerdo con lo observado el pico de absorbancia mas elevado esta en el

experimento con pH=8 por lo que se puede concluir que para este caso este es
el pH con el mejor desempeño de la enzima, el pico en pH ácido se podría
explicar por la Presencia de gamma-amilasa, la cual es producida por la placa
bucal esto, debido a que la amilasa se recolecto aproximadamente una hora
después de la comida y sin lavarse la boca

b) ¿Cuál es el azúcar que se libera en la hidrólisis de este polisacárido?

R= glucosa :

pH vs Absorbancia
0.06

0.05

0.04
Absorbancia

0.03

0.02

0.01

0
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
pH

Como se puede observar en el comportamiento de la gráfica de absorbancia

con respecto al número de experimento, la amilasa salival tiene absorbancias
erráticas, esto puede deberse al hecho de que los cambios en el pH aun de un
grado pueden pegar de manera importante dentro de los parámetros de la
cinetica enzimática, con lo cual al ver los picos de la gráfica, se pueden tener
ciertos parámetros para determinar los rangos de acción de la amilasa salival
donde su actividad sea mayor con respecto a los demás pH´s.

EXPERIMENTO 4.- Efecto de la concentración de la enzima

Durante mucho tiempo se pensó que los catalizadores eran sustancias que
actuaban por presencia debido a que presentaban actividad a concentraciones
muy pequeñas y a que podían recuperarse inalterados al final de la reacción.
Sin embargo, se sabe que la velocidad de reacción de acuerdo a la Ley de
Accion de Masas, depende de su concentración de tal manera que su velocidad
es directamente proporcional a la concentración de enzima.
También resulta importante aclarar que el efecto de este parámetro es análogo
al de los inhibidores no competitivos, por lo que lo esperado en este tipo de
experimentos es una disminución en la velocidad de la actividad enzimática
mas no en las condiciones finales a las que deberían llegar la salida o final de
reacción.

RESULTADOS:

1 2 3 4 5 6
[E] Ml 0.1 0.2 0.4 0.8 1.6
Abs. 0.007 0.007 0.04 0.008 0.036

A) Trazar los resultados en una grafica e interpretar y discutir resultados.

absorbancia vs concentración de la enzima

0.09
0.08
0.07
0.06
Absorbancia

0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8
mL de amilasa

Como podemos observar, la tendencia general es una elevación de la

absorbancia conforme la concentración de amilasa salival aumenta, con una
excepción que es la concentración del tubo 5 donde baja la absorbancia, esto
puede ser causado por algunas causas diversas, las condiciones de reacción y
de preparación algunos de los puntos hayan tenido grados diversos de error,
dado que la teoría dice que el efecto de la concentración es una línea recta, lo
mas probable es que se haya dado la esta opción.

CUESTIONARIO

1. Explicar el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática

La rapidez de la mayor parte de las reacciones químicas aumenta al doble

o triple por cada 10°C de temperatura. Esto también es cierto para
reacciones en las cuales el catalizador es una enzima, aunque los límites
de temperatura son más estrechos. Los límites de actividad para la mayor
parte de enzimas tiene lugar entre 10°C y 50°C; la temperatura óptima para
enzimas en el cuerpo humano se halla alrededor de 37°C. El aumento de
intensidad de actividad observado a 50°C, o por encima, dura poco, porque
la temperatura elevada desnaturaliza y coagula la proteína enzimática, con
lo cual desaparece su actividad. Por lo tanto la temperatura óptima de una
enzima depende de un equilibrio entre la intensidad de actividad al
aumentar la temperatura y la desnaturalización o inactividad por el calor.

2. ¿Cuál es el intervalo de pH en el cual las enzimas actúan? Proporciona

algunos ejemplos.

Es muy variado y actuan en el mismo rango en el que existe la vida, Por

ejemplo α-amilasa pH 7, b-amilasa pH 12 y γ-amilasa pH 3

3. Investiga acerca de la Ley de Acción de Masas.

Ley de la Acción de las Masas. Uno de los principios básicos a partir de

los cuales se desarrollo el concepto de equilibrio químico es la llamada
ley de acción de las masas, enunciada por los químicos noruegos Cato
Maximiliam Guldberg y Peter Waage, en 1866.

La expresión matemática de la ley de acción de masas está dada por:

Donde las concentraciones molares de cada sustancia son representadas entre
corchetes y Kc es la llamada constante de equilibrio. Se puede interpretar esta
ley en términos de las velocidades de reacción (v) a través de las siguientes
expresiones:

Donde k1 y k2 son constantes de velocidad referentes a las reacciones de

formación y de descomposición del producto, respectivamente. En esos
términos, la constante de equilibrio Kc es equivalente al cociente de las
constantes de velocidad (Kc = k1/k2).

En la expresión matemática de la constante de equilibrio, las concentraciones

molares de los productos de la reacción están en el numerador, en cuanto a las
relativas a los reactivos se sitúan en el denominador.

Consecuentemente, cuando esa constante tuviese valor elevado habrá fuerte

tendencia a la formación de productos, motivo por el cual se dice que el
equilibrio está trasladado en el sentido de la derecha. Inversamente, cuando el
valor de Kc fuese bajo, la reacción ocurre, de preferencia, en el sentido de
izquierda, esto es, de la descomposición del producto, o formación de los
reactivos.

4. Explica el significado de Km

R= esta constante es conocida como la constante de Michaelis-Menten, y su

significado es la afinidad entre la enzima y el sustrado, es decir, que tan rápido
o con que velocidad, la enzima se une al sustrado, como se puede inferir, solo
toma en cuenta la primera parte de la reacción catalítica.
 5. Investiga acerca de las funciones de la amilasa salival

Cataliza la hidrólisis del almidón en dextrinas o maltosa. Sus funciones

principales son humedecer y lubricar el alimento para iniciar la digestión del
almidón.
6. De acuerdo con los experimentos realizados determina y discute cual es
el factor que mas modifica la actividad enzimática.

R= desde el punto de vista biologico, que es donde las enzimas tienen su

mayor campo de accion, la temperatura es casi constante, el pH igual, asi
como la concentracion de la enzima, por lo tanto la mayor variabilidad es
determinada por la concentracin del sustrato.

Desde el punto de vista fisicoquimico la temperatura, es la que puede

amuentar la velocidad de reaccion en varios ordenes de magnitud, sin embargo
las variaciones en el pH pueden aniquilar a una enzima muy rapidamente.

7. ¿Qué otros factores inhibidores afectan la actividad enzimática?

R= el tiempo, concentración de producto, concentración de nutrientes.

Competencia entre sustratos, etc

Bibliografia

1
BIOQUIMICA Y LAS BIOMOLECULAS. Bacelis Rosario, Macias Patricia.
Publicaciones UADY. Año 2003.
Yañez-Avila. Manual de Prácticas de Bioquímica. Instituto Politécnico Nacional.
1996. ISBN 968-7724-43-9. Primera Edición.
Scragg A. Biotecnología para ingenieros. Sistemas biológicos en procesos
tecnológicos. Ed. Limusa