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Análise

Microbiológica

Da

Água

Departamento de Engenharia Química - UFPE

Maria de Los Angeles Perez palha


Alice G. Andrade Lima
Sônia Albuquerque

2004
ANÁLISE BACTERIOLÓGICA DE ÁGUA POTÁVEL

1-Introdução

Embora possa parecer que a água constitui uma reserva natural inesgotável, isso não
representa a realidade, já que 95% da água do planeta é salgada, sendo imprópria para o
consumo humano e dos 5% restantes, 4,7% estão sob a forma de geleiras ou em regiões
subterrâneas de difícil acesso, o restante apto ao consumo humano, encontra-se em lagos,
rios e lençóis subterrâneos.
Particularmente para o Brasil, a aparente abundância é falsa, uma vez que 80%
encontra-se no Amazonas onde vivem apenas 5% da população. O nordeste com 1/3 da
população do país dispõe de apenas 3,3% das reservas hídricas do país. No mundo inteiro há
países ou regiões com graves problemas de abastecimento: ora devido a seca crônica, ora a
má distribuição dos recursos hídricos, ora a contaminação desses recursos. A água
contaminada é responsável por cerca de 70% das internações hospitalares, são pacientes
vítimas de doenças de origem hídrica (tabela1), como disenteria, hepatite, febre tifóide,
cólera e, indiretamente leptospirose e dengue (Macedo, 2001)
Além da contaminação microbiana, o desenvolvimento industrial, a ocupação
inadequada do solo e o uso de fertilizantes vêm comprometendo as águas disponíveis para o
consumo humano, recreação e agricultura, aumentando consideravelmente o risco de
transmissão de doenças de origem hídrica (figura 1). Segundo a Organização Mundial de
Saúde (OMS), 80% das moléstias que ocorrem nos países em desenvolvimento são
ocasionadas por contaminação da água: 15 milhões de crianças de 0 a 5 anos morrem devido
a enfermidades contraídas por conta da falta ou ineficiência dos sistemas de tratamento de
águas e esgotos. Apenas 30% da população utiliza água tratada, o restante faz uso de águas
de poços, rios, lagos, estando, portanto passíveis à contaminações (Macedo, 2001).
Desta forma se faz necessária a vigilância rotineira da qualidade química e
particularmente, microbiológica das águas por parte das autoridades sanitárias, órgãos de
saneamento, indústrias, clínicas de hemodiálise, hospitais, entre outros. A pesquisa de
patógenos nem sempre é fácil ou econômica para que seja feita rotineiramente. Assim, é
imprescindível o uso de microrganismos indicadores de contaminação fecal.

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Tabela 1 - Microrganismos patogênicos encontrados intermitentemente em fezes humanas e
transmissores comprovados de doenças através da água.

Microrganismo Patógeno Doença


Bactérias Vibrio cholerae Cólera

Shigella dysenteriae
Shigella flexneri Disenteria Bacilar
Shigella boydii
Shigella sonnei

Salmonella typhi
Salmonella paratyphi Febre tifóide ou entéricas
Salmonella enteridis
Salmonella choleraesuis

Vírus Vírus da hepatite tipo A Hepatite


Rotavírus Gastroenterites em crianças
Adenovírus Gastroenterites
poliovírus poliomielite

Protozoários Entamoeba histolytica Disenteria amebiana


Giardia lamblia

Helmintos Ascaris lumbricoides Verminoses


Trichuris trichiura

Fezes Humanas

Água de
drenagem Esgotos Fossas

Oceanos e Água Fertilização e


Rios e lagos
estuários subterrânea irrigação
Suprimento de
água potável

Águas Produtos
Moluscos recreacionais agrícolas Aerossóis

potável

Homem

Figura 1- Principais vias de Transmissão de patógenos (Sanchez, 1999)


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2. Microrganismos indicadores

Microrganismos indicadores são grupos ou espécies de organismos, que quando


presentes em um produto, fornecem informações sobre a ocorrência de contaminação de
origem fecal, presença de patógenos, manipulação e/ou tratamento inadequada, assim como
deterioração potencial de bens de consumo. Os indicadores microbianos servem para avaliar
as condições sanitárias a que o produto foi submetidas. O uso de Escherichia coli como
indicador de contaminação de origem entérica em águas e alimentos foi proposto em 1892,
uma vez que esse microrganismo é encontrado nos intestinos do homem e de animais de
sangue quente, sendo o mais utilizado por preencher alguns requisitos, tais como:

• Ser um microrganismo que prevalece em esgotos e é excretado pelo homem e


outros animais (50 milhões de células/g de dejetos humanos).
• Ocorrer em número muito alto e em relação direta ao grau de contaminação
fecal.
• Ser incapaz de se multiplicar em ambiente aquático.
• Apresentar alta resistência ao ambiente extra-enteral.
• Ser detectado por técnicas rápidas, simples, precisas e econômicas.

As bactérias do grupo coliforme fazem parte da flora normal do intestino, onde não
causam doenças, na realidade são fundamentais ao funcionamento normal desse órgão. No
entanto, esses microrganismos mostram-se patogênicos quando fora do trato intestinal,
colonizando outros tecidos, como trato urinário, peritônio, meninges, entre outros e,
dependendo das condições de defesa do indivíduo, podem causar doenças e morte.
No caso de águas minerais, além dos indicadores de contaminação fecal
(Coliformes totais e fecais), é recomendada a pesquisa Streptococcus faecalis, Pseudomonas
aeruginosa e Clostridium perfrigens.
Não existe um indicador ideal ou universal, que reúne todos os requisitos necessários,
de modo que a sua ausência ateste uma água de puríssima qualidade. Assim, vários autores
preconizam a pesquisa de bactérias do gênero Pseudomonas aliada à bactéria E. coli, uma
vez que essa bactéria, em determinadas concentrações, inibe o crescimento da Escherichia,
no entanto segundo portaria publicada no Diário Oficial em vigor (Nº518 - 25/03/2004), esse
cuidado não é necessário.

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2.1 Grupo Coliforme

As bactérias pertencentes ao grupo coliforme são encontradas normalmente nos


intestinos do homem e demais animais de sangue quente, sendo expelidas em grande
quantidade, através de seus dejetos, podendo também estar presentes em vários setores do
meio ambiente como esgotos, águas superficiais, solos, vegetação, insetos, entre outros.
Verifica-se, dessa maneira, que o risco de transmissão de moléstias infecciosas através da
água está estreitamente vinculado as doenças infecciosas intestinais. ( tabela 1.0).
Uma água destinada ao consumo público, deve estar isenta de bactérias ofensivas ao
organismo humano. É portanto a pureza bacteriológica que condiciona a potabilidade de
uma água, sendo inclusive, fator mais importante do que qualquer outro requisito de ordem
físico-química.
O grupo Coliforme é composto por bactérias da família Enterobacteriaceae, são
bastonetes Gram negativos, não formadores de esporos, anaeróbios facultativos ou aeróbios,
são capazes de fermentar um grande número de carbohidratos (Pelczar Jr. et al, 1997). Essa
família engloba vários gêneros destacando-se entre outros:

1. Escherichia: E. coli
2. Proteus: P. vulgaris
3. Klebsiella: K.pneumoniae
4. Citrobacter:
5. Serratia: S. marcescens
6. Enterobacter : E. aerogenes
7. Salmonella: S. typhi
8. Shigella: S. sonnei

Alguns microrganismos entéricos, por ex.: Escherichia coli, fazem parte da flora
normal do intestino e, acidentalmente causam doenças, enquanto outros, Salmonella e
Shigella, são sempre patógenos aos seres humanos. Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella,
além de serem encotrados nas fezes, também encontram-se em vegetais e solo, onde
persistem por tempo superior ao de bactérias patogênicas de origem intestinal. A E. coli é o
subgrupo mais importante, sendo escolhido como microrganismo indicador. Consegue
hidrolizar o dissacarídeo lactose e, conseqüentemente, fermentar este açúcar com produção
de gás, quando incubado a 35-37ºC, por 48h.. Espécies relacionadas, fermentadoras da
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lactose também são encontradas no solo e em desenvolvimento sobre plantas e material
vegetal. O E. aerogenes, principal representante desse subgrupo, também fermentador da
lactose, é encontrado tipicamente no solo e em plantas. Pode ocorrer igualmente no trato
intestinal do homem e de animais de sangue quente, não parecendo, contudo, ser ali seu
habitat regular, por isso se atribui pouca importância à sua presença na água. Não obstante, a
presença de qualquer tipo de organismo coliforme na água potável sugere, um tratamento
inadequado ou acesso de material indesejável à água, após o tratamento.
A velocidade de morte de uma população de Escherichia coli em água, em geral,
acompanha a taxa de mortalidade das bactérias patogênicas como S. typhi nesse mesmo
meio. Os outros membros do grupo coliforme, como o E. aerogenes, têm resistência um
pouco maior.

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3. Análise Microbiológica da água

As técnicas de análise tradicionalmente utilizadas para pesquisa de bactérias em água


são as de tubos múltiplos e a de membrana filtrante. Novos métodos têm sido adotadas nos
últimos anos, em particular o de presença / ausência, além de outros que fazem uso de
reativos cromogênicos de alta sensibilidade. A escolha da metodologia adequada, desde que
respeite as normas vigentes, será função do tipo de água, da finalidade da mesma, da infra-
estrutura do laboratório, da capacitação pessoal e dos recursos financeiros disponíveis.

3.1 COLETA DA AMOSTRA

♦ Frasco de Amostragem

Dá-se preferência a frascos com capacidade para recolher pelo menos 100 ml de água
deixando espaço para o ar, tornando possível a homogeneização da amostra. Os mais
indicados são frascos de vidro transparente, incolor, com capacidade nominal de 250 ml
dotados tampa de vidro esmerilhada.
Os frascos devem ser lavados e esterilizados. Para a coleta de água clorada, deve-se
adicionar ao frasco 0,1ml de solução de tiossulfato de sódio a 10%. Esta solução tem a
função de eliminar a ação do cloro residual na amostra. No entanto, este teor não tem
qualquer ação nociva aos germes porventura existentes.
Na preparação do frasco coloca-se entre a tampa e o gargalo uma tirinha de papel
alumínio, para permitir a saída livre do ar e circulação do vapor saturado durante a
esterilização no autoclave. Protege-se ainda a tampa do frasco com um papel ou folha
metálica e autoclava-se a 120ºC durante 20 minutos.

♦ Técnica de Coleta

Procedimento:
1. Não tocar o interior ou a tampa do frasco; o papel deve ser afrouxado, devendo o
operador segurar a tampa, para abri-lo, sem remover o papel deixando entretanto cair a
tirinha inserida no gargalo por não ser mais necessária.

2. Para a coleta de amostras na rede de distribuição de água, escolhe-se uma torneira e


lava-se a mesma e o encanamento próximo com detergente. Alguns autores indicam a
assepsia com etanol a 70%. Abre-se e deixa-se a água fluir em jato forte durante 3 a 5
minutos.

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3. Em seguida com a torneira aberta moderadamente, colhe-se a amostra até o volume de
2/3 do frasco, de modo a permitir a sua homogeneização.
4. Registro de dados:
Devem ser anotados:
Data e hora da coleta
Temperatura e pH da água
Localização da tomada de amostra

Sempre que possível medir o teor residual de cloro no momento da coleta. Deve-se
considerar as condições sanitárias do local onde foi feita a amostragem, anotando-se
detalhes como profundidade do poço, tempo de funcionamento, proximidade de fossas,
matadouros, curtumes.

Cuidados:
 Na tomada de amostras de rede do abastecimento público, não efetuar a coleta
em torneiras que não estejam ligadas diretamente ao sistema distribuidor.
 Na coleta de amostras de uma fonte superficial como rio, açude, etc, a
amostragem deverá ser feita em um ponto que esteja o mais próximo possível da
estação de tratamento.
 Poços com bombas manuais são operados de maneira semelhante,
bombeando-se por 5 minutos antes da tomada da amostra. Se o poço não tem bomba,
faz-se descer o frasco esterilizado, ligado a um peso e com um dispositivo que
permita abri-lo debaixo d’água. Existem frascos e dispositivos especiais para a coleta
de amostras de água abaixo da superfície, a profundidade desejada.

3.2 TRANSPORTE E TEMPO DE ESPERA

Tanto quanto possível manter a temperatura da amostra próxima à da ocasião da sua


retirada. Os métodos modernos de análise não mais recomendam o seu resfriamento pois
consideram desprezíveis as alterações em tipos e números de bactérias durante a
conservação, no entanto deve ser guardada a uma temperatura que oscile entre 0 e 10ºC. O
exame deve começar de preferência dentro de 1 hora após a coleta e no máximo decorrido
24 horas.

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3.3 TÉCNICA DO EXAME:

Os métodos de exame bacteriológico da água são padronizados e a metodologia deve


ser seguida regiamente. Os processos de rotina para água potável consiste em:
 Contagem padrão de bactérias heterotróficas em placa
 Testes que revelem a existência de bactérias do grupo coliforme

3.3.1Técnica dos tubos múltiplos

Princípio do método

Consiste no inóculo de volumes decrescentes da amostra, em meio de cultura


adequado ao crescimento dos microrganismos pesquisados, sendo cada volume inoculado
em uma série de tubos (série de 05 ou de 03). Para análises de águas, têm sido utilizado
preferencialmente o fator 10 para diluição, sendo inoculados múltiplos e submúltiplos de
1ml da amostra, usando-se, geralmente, as séries de 5 tubos para cada volume a ser
inoculado. Os resultados são avaliados através da tabela de Hoskins (anexo 1), que permite a
obtenção de uma estimativa da densidade original das bactérias pesquisadas, através da
aplicação de cálculos de probabilidade (N.M.P.: número mais provável) que é expressa
como NMP por 100 ml . O exame completo se processa através de três ensaios
consecutivos:
a) Ensaio presuntivo
b) Ensaio confirmativo
c) Ensaio completo ou diferencial
No entanto, são de realização obrigatória para todos os tipos de amostras de água o
ensaio presuntivo e confirmativo. A contagem padrão em placas e o ensaio presuntivo são
feitos paralelamente.

1º Etapa:

ENSAIO PRESUNTIVO

Geralmente são usadas três séries de 5 tubos grandes dotados dos respectivos tubos
de Durham ou ampolas de injeção ( para recolher os gases). A primeira série contém, cada
tubo, 10 ml de meio de caldo lactosado em concentração dupla(CLD). As duas outras,
compostas de 10 tubos menores, também com tubos de Durham, contêm em cada, 10 ml de
caldo lactosado em concentração simples (CLS) (figura - 2).

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Técnica:

 Com pipeta estéril de 10 ml, inocular cada um dos 5 tubos grandes ( C.L.D.) com 10
ml da amostra;
 Com uma outra pipeta de 1 ml estéril, inocular 1 ml da amostra em cada um dos 5
tubos menores com caldo lactosado simples
 Transferir 1 ml da amostra para um tubo de diluição com 9 ml de água destilada
estéril ou água tamponada estéril. Desta diluição (1/10), inocular 1 ml em cada um dos 5
tubos com caldo lactosado simples restantes.

Agitar os tubos cuidadosamente e incubá-los a 35ºC por 24/48h.


⇒Após 24 horas de incubação, se houver formação de gás em qualquer quantidade,
em qualquer tubo, o ensaio presuntivo é positivo. Se não houver gás esperar por mais 24
horas.
⇒Se após 48h não houver formação de gás em qualquer tubo, o ensaio é negativo e a
análise está encerrada quanto a coliformes. Havendo formação de gás, anota-se o número de
tubos positivos e negativos e prossegue-se o ensaio (ensaio confirmativo).

CONTAGEM DE BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS EM PLACAS

Este ensaio constitui um dos indicadores da qualidade da água e da eficácia do


tratamento. Visa determinar a densidade de bactérias que são capazes de crescer na presença
de compostos orgânicos contidos em meio de cultura apropriado sob condições pré-
determinadas. Com a finalidade de se conseguir uma maior confiabilidade nos resultados,
costuma-se além da inoculação da amostra original, efetuar diluições decimais que vão
desde 1/10 (para águas sabidamente boas) até 1/105 para contagem de mesófilos
heterotróficos (figura-2). Essas diluições são feitas em frascos ou tubos contendo águas
tamponadas (com KH2PO4) ou água estéril. A amostra deve ser agitada vigorosamente antes
de se iniciar as diluições.

Técnica:
 Faz-se a primeira diluição (1:10) colocando 1 ml da amostra em 9 ml de água estéril ;
agita-se bem e transfere-se 1 ml desse tubo para outro contendo 9 ml de água estéril
(1/100) e assim, sucessivamente até que se tenha todas as diluições desejadas.
 De cada diluição transfere-se então 1 ml para Placa de Petri estéril (deve-se fazer
duplicatas ou triplicatas) e adiciona-se de 10 a 15 ml de meio de Agar-glicosado (GA)
fundido e resfriado a 42-45ºC.
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 Agitam-se as placas com movimentos circulares nos sentidos horário e anti-horário,
evitando-se sujar a tampa da placa. Deixa-se solidificar e incuba-se em estufa a 35ºC
durante 24/48h horas.
Após incubação examina-se as placas escolhendo-se para contagem as que tenham
entre 30 a 500 colônias* (evidentemente se a placa inoculada com 1ml da amostra não
diluída tiver um número inferior a 30 colônias, esse número será registrado). Para auxiliar na
contagem é utilizado um aparelho especial munido de lupa, o Contador de Colônias tipo
Quebec.
Se as placas escolhidas forem originadas de qualquer das diluições não se deve
esquecer que o resultado final será a média do número de colônias nas placas (das
duplicatas ou triplicatas), multiplicado pela recíproca da diluição. O resultado obtido é
expresso em unidades formadoras de colônias de bactérias heterotróficas por mililitro
(UFC/ml). Contar somente as colônias que apresentarem as seguintes características:
a)colônias circulares lisa e rugosas
b)colônias ovaladas, lisas, rugosas e estreladas;
c)colônias brancas, amarelas, azuis, etc.

* O número máximo permitido de unidades formadoras de colônias por placa varia de


acordo com a finalidade da água.

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10 ml
Amostr
a
Amostra

Tubos contendo 10 ml de CLD

1 ml
1

1 ml

1 ml
1

Tubos contendo 10 ml de CLS

1 ml
10-1

1 ml

1 ml
10-1
9 ml de água
estéril
Tubos contendo 10 ml de CLS

1 ml

1 ml
10-2

1 ml
Figura 2 – Esquema de inoculação para
10-2
ensaio presuntivo e contagem em placas

9 ml de água estéril

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2º Etapa:

ENSAIO CONFIRMATIVO

Um ensaio presuntivo positivo, não indica necessariamente a presença de coliformes;


alguns germes da flora normal de água e de solo, principalmente bacilos Gram-positivos,
esporulantes, anaeróbios, do gênero Clostridium são capazes de fermentar a lactose com
produção de gases. Também a ação sinérgica de 2 espécies diferentes de bactérias pode
resultar no aparecimento de gases. Nesta hipótese, uma das espécies seria capaz de
hidrolizar a lactose liberando glicose e galactose; a glicose é um açúcar facilmente
fermentável, sendo atacada pela 2ª espécie. O ensaio confirmativo tem assim por finalidade
afastar essas duas possibilidades.

Meios de Cultura Utilizados:


Os meios de cultura empregados inibem as bactérias Gram-positivas, permitindo o
desenvolvimento das Gram-negativas. Podem ser usados os meios líquidos como o caldo
Lactosado adicionado de verde-brilhante ou de fucsina ou de cristal violeta, adicionado de
bile a 2% ou ainda meios sólidos igualmente adicionados de substâncias inibidoras. Esta
etapa reduz a possibilidade de ocorrência de falsos-positivos, decorrentes da atividade
metabólica de bactérias esporulantes Gram-positivas fermentadoras da lactose.

Ensaio Confirmativo para coliformes totais

 De cada um dos tubos positivos usados no ensaio presuntivo transferir com alça estéril,
após agitação, uma gota para um tubo com caldo verde brilhante lactose bile, igualmente
dotado de tubinhos de Durham. Assim serão usadas tantos tubos de caldo verde brilhante
bile quantos forem os tubos positivos no ensaio presuntivo.
 Incubar todos os tubos por 48± 3 horas a 35ºC .
 Proceder a leitura, considerando como teste confirmativo positivos para coliformes totais
todos os tubos que apresentarem formação de gás nos tubinhos de Durham
 Anotar os resultados obtidos e calcular, recorrendo-se à tabela de HOSKINS, o número
mais provável de coliformes existentes em 100 ml da amostra.

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ENSAIO CONFIRMATIVO EM MEIO SÓLIDO

Pode-se partir de um tubo ou mais fermentados do ensaio presuntivo ou de dos tubos


positivos usado no ensaio confirmativo em meio líquido. Neste ensaio pode ser utilizado os
meios de EMB (eosina azul de metileno), ENDO, Mac Conkey entre outros.

Técnica:
Com uma alça de platina espalhar uma gota do líquido (do tubo positivo) na
superfície do meio solidificado pela técnica de esgotamento na placa.(ver figura - 3).

2
1
Figura 3- Técnica de espalhamento de uma gota
de líquido na superfície de meio sólido
3

Incuba-se a placa em estufa a 35ºC durante 48 horas. Observa-se, para determinar se


houve ou não crescimento de colônias; o não crescimento indica que o ensaio confirmativo é
negativo, ou seja, não há presença de germes coliformes. Esta possibilidade refere-se ao uso
direto de um tubo de caldo lactosado do ensaio presuntivo para inocular a placa de meio
confirmativo.
Quando, no entanto, partindo-se de um tubo fermentado do ensaio confirmativo ou
de um tubo positivo do ensaio presuntivo aparecem colônias, estas devem ser escolhidas e
transferidas cada uma para dois tubos, um contendo meio de AN (agar-nutritivo) e outro
caldo lactosado. A escolha das colônias baseia-se no conhecimento prático do operador, que
determinará a colônia típica do grupo coliforme a ser transferida. Algumas características
dessas colônias podem ser observadas na tabela 2.

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Tabela. 2 - Diferenciação entre a E.coli e o E. aerogenes em placas de EMB

Colônias E. coli E. aerogenes


Tamanho Colônias bem isoladas, com 2 a 3 mm Colônias bem isoladas, porém
de diâmetro. maiores do que as da E. coli;
4 a 6 mm de diâmetro ou mais.
Aglutinação As colônias vizinhas mostram pouca As colônias vizinhas se aglomeram
tendência para a aglomeração facilmente

Altura As colônias apresentam pouca altura, As colônias são consideravelmente


têm a superfície plana ou levemente elevadas e acentuadamente
côncava; raramente são convexas convexas; ocasionalmente,
aparecem depressões no centro das
colônias.
Aspecto à luz transmitida Os centros são escuros, quase negros, e Os centros são de cor marrom, mas
se estendem por mais de ¾ do diâmetro não tão escuros como os da E. coli e
da colônia; é difícil distinguir a menores em relação ao resto da
estrutura interna da parte escura central. colônia. A estrutura interna, nas
colônias novas, é habitualmente,
estriada.
Aspecto à luz refletida Colônias escuras, em forma de botão. Mais claras do que as do E. coli.
Regra geral: semelhantes a anéis Não se observa brilho metálico,
concêntricos com brilho metálico exceto, ocasionalmente, nas
esverdeado. depressões do centro das colônias,
quando elas existem.

Os tubos de AN e caldo lactosado inoculados a partir de colônias típicas ou em falta


destas, de uma colônia rósea, clara, atípica, serão incubados a 35ºC durante 24 / 48 horas. Se
após 48 h não houver fermentação no tubo com caldo lactosado, este ensaio confirmativo
será negativo.
Caso haja formação de gás, faz-se uma coloração de Gram, partindo-se da cultura em
AN. Tratando-se de bastonetes Gram negativo, não esporulantes, o ensaio confirmativo é
positivo.

3º Etapa:

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ENSAIO DIFERENCIAL PARA COLIFORMES FECAIS

Geralmente os testes referidos são suficientes para determinar a espécie de coliforme


presente. Entretanto, muitas vezes deseja-se separar os componentes de origem fecal dos
provenientes de outras fontes. Estas determinações de coliformes fecais são aplicáveis às
estimativas do grau de poluição das águas brutas submetidas a processo de depuração, ou a
estudos de poluição dos cursos de água, ou ainda à interpretação de dados sobre coliformes
totais cuja significação seja duvidosa.

Técnica:
Este ensaio é realizado a partir dos tubos positivos do ensaio presuntivo.
 De cada tubo positivo, inocula-se um tubo com meio EC dotado de tubo Durham.
 Incubando-se em seguida em banho-maria a 44,5º ± 0,5ºC durante 24 ± 2 horas.
 A produção de gás dentro de 24 horas é considerada positiva para a presença de
coliformes fecais e sua densidade numérica é calculada pela tabela do NMP.

⇒ Quando o ensaio confirmativo for efetuado paralelamente ao teste diferencial para


coliformes fecais, considerar a dupla confirmação (caldo lactosado-verde brilhante-bile e
Meio EC) como teste completo positivo
⇒ Se a finalidade for o exame completo, prosseguir a partir dos tubos com caldo lactosado-
verde brilhante-bile com resultado positivo no ensaio confirmativo

4º Etapa:

ENSAIO COMPLETO OU DIFERENCIAL (opcional)


Partindo-se da cultura de coliforme em Agar-nutritivo (AN) obtida a partir do ensaio em
meio confirmativo sólido (EMB), inocula-se:
a) um tubo de caldo-peptona ou caldo-triptona, para o teste de Indol.
Caso se use peptona dá-se preferência a de caseína ou faz-se teste, usando-se uma
cultura conhecida de E. coli, para verificar a presença de triptofano na peptona utilizada (Se
a bactéria Escherichia coli típica não produzir Indol, a peptona não deve ser usada).

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b) Um tubo com caldo glicosado-fosfatado (meio de Clark Lubs), para os testes de
vermelho de metila e de Acetilmetilcarbinol ou de Voges-Proskauer.
c) Um tubo com meio citrato (o citrato de Koser) para a prova de utilização de citrato.
Pode-se também usar um meio de citrato sólido ( o meio de citrato de Simmons)

Esses testes são conhecidos pela sigla da língua inglesa I.M.Vi.C. (Indol, Methyl red,
Voges-Proskauer, Citrate). Após o semeio, os tubos serão incubados a 35ºC por tempos
variáveis.

 Teste de Indol: Após incubação durante 18 a 24 horas, juntar à cultura crescida 0,2
a 0,3 ml do reagente de Kovac’s.
 Aparecimento de anel sobrenadante vermelho intenso indica a presença de
Indol, teste positivo.
 Se a cor do reagente permanecer inalterada: teste negativo.

 Teste de Voges-Proskauer: Após incubação por 48 horas, retira-se com pipeta estéril
1ml da cultura crescida para um outro tubo de ensaio; junta-se 0,6 ml de solução de α -
naftol e 0,2 ml de KOH a 40%. Agita-se vigorosamente e deixa-se em repouso em estufa
a 35ºC. Observa-se a partir de 15 minutos até o máximo de 4 horas:
 Aparecimento de coloração cereja que se estende da superfície para o fundo
do tubo indica teste VP positivo.
 O aparecimento de coloração acobreada ou mesmo de coloração vermelha
após 4 horas de observação indica teste VP negativo.

 Teste de vermelho de metila: a cultura inoculada em meio de caldo glicosado-fosfatado


deve permanecer incubada por 4 a 5 dias a 35ºC. No fim desse período, junta-se
algumas gotas do indicador vermelho de metila:
Cor vermelha: teste positivo
Cor amarela: teste negativo.

 Teste de citrato: a amostra de coliforme é inoculada no meio de citrato de Koser, de


preferência com a alça em forma de agulha, levando-se o mínimo possível de material.
Incuba-se o tubo em estufa a 35ºC por 72 / 96 horas.
Teste positivo: crescimento visível (o meio fica turvo);
Teste negativo: ausência de crescimento (o meio permanece límpido)
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Quando realizado em meio de Simmons uma virada de indicador azul de
bromotimol, de verde para azul indica: citrato positivo. A tabela-3 apresenta o teste IMViC
para alguns microrganismos presentes na flora intestinal. Como exemplo, escolheu-se duas
colônias que após terem sido submetidas aos ensaios bioquímicos (IMViC) apresentou os
resultados a seguir:

Tubo 1: + + - -
Tubo 2: - - + +
Consultando-se a tabela 3, pode-se concluir que no tubo 1 foi encontrado a bactéria
Escherichia coli variedade 1 e no tubo 2, Enterobacter aerogenes.

Tabela 3.0 – Interpretação das reações IMViC

Vermelho
Microorganismos Indol Voges Citrato
de
Proskauer
Metila
Escherichia coli
Variedade I + + − −
Variedade II − + − −
Citrobacter freundii
(intermédiarios)
Variedade I − + − ±
Variedade II + + − +
Enterobacter aerogenes
Variedade I − − + ±
Variedade II ± − + +

Na figura 4 são apresentadas, de forma esquemática, todas as etapas necessárias a


pesquisa de coliforme em uma amostra de água. Dependendo da finalidade ou da suspeita
sobre a qualidade da água, outros microrganismos devem ser pesquisados, tais como:
Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus, clostridium, Vibrio cholerae, vírus,
cianobactérias, entre outros.

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AMOSTRA
Volumes Decimais Adequados

ENSAIO PRESUNTIVO
Caldo lactosado – 24/48 ± 2h / 35ºC

AUSÊNCIA DE GÁS
Prova negativa PRESENÇA DE GÁS
coliformes ausentes Prova positiva

PRESENÇA DE GÁS ENSAIO CONFIRMATIVO


MEIO DE EC Caldo verde brilhante lactose bile
Prova positiva
Coliformes fecais 44,5 ± 0,5ºC -24 ± 2h 35ºC - 24/48 ± 2h
presentes

AUSÊNCIA DE GÁS PRESENÇA DE GÁS


Prova negativa Coliformes presentes
Coliformes ausentes

MEIO CONFIRMATIVO SÓLIDO


Meio EMB, ENDO.
35º± 0,5ºC / 24 ± 2h

Ausência de Colônias. Colônias típicas


Colônias atípicas
Coliformes ausentes de coliformes

CALDO LACTOSADO
AGAR NUTRITIVO
24/48 ± 2h 35º ± 0,5ºC
24/48 ± 2h 35º ± 0,5ºC

AUSÊNCIA DE GÁS
Ensaio completo Teste de Gram Coliformes ausentes
ou diferencial

Figura 4 - Todas as etapas necessárias à pesquisa de coliforme em uma amostra de água


20
5. PESQUISA DA BACTÉRIA Pseudomonas aeruginosa

Como já foi comentado anteriormente, a legislação em vigor considera a bactéria


Escherichia coli , os coliformes fecais e a contagem de heterotróficas como indicadores de
contaminação fecal. No entanto, a ausência desses indicadores não determina a sanidade da
água analisada, uma vez que bactérias como Pseudomonas aeruginosa podem interferir na
detecção desses microrganismos. Embora não haja microrganismos com características de
indicador universal, vários autores advogam a necessidade da adição às análises rotineiras, a
pesquisa da bactéria Pseudomonas aeruginosa como indicador de contaminação hídrica.
O gênero Pseudomonas é amplamente distribuído na natureza, sendo comum em
ambientes hospitalares. Compõem-se de várias espécies, destacando-se a espécie
Pseudomonas aeruginosa, por ser saprófita em seres humanos, provocando doenças
naqueles cujas defesas estejam alteradas. São bacilos Gram-negativos, móveis, aeróbios
estritos, não apresentam grandes exigências nutricionais, crescem a 40º± 5ºC e toleram pH
altos. Algumas linhagens produzem pigmentos fluorescentes e toxinas como a exotoxina A,
que é responsável por necrose de tecidos e pode ser letal quando injetada na forma
purificada.

ENSAIOS PARA DETERMINAÇÃO DA BACTÉRIA Pseudomonas aeruginosa


Utiliza-se a técnica de tubos múltiplos (5tubos), onde as amostras são inicialmente
inoculadas em caldo-asparagina (3 alçadas consecutivas) e, confirmadas em caldo-
acetamida, incubadas a 35o C por 24-48h. Os resultados são expressos em NMP (número
mais provável de P. aeruginosa em 100mL da amostra). Para isolar culturas dessa bactéria
ou impedir a possibilidade de ocorrência de resultados falsos-positivos, inóculos oriundos
dos tubos positivos em caldo acetamida são inoculados em meio de agar- leite a 35ºC por
48h .

21
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

• ATLAS, R.. M., 1989, Microbiology - Fundamentals and Applications. 2 ed.


New York, Macmillan Publishing Company.

• BROCK,T.D. & MADIGAN, M.T., 1991, Biology of Microorganisms. 6th ed., London,
Prentice-Hall International.

• CETESB, São Paulo. Apostila Microbiologia Ambiental, 2000

• GUILHERME, E. F. M. & SILVA, J. A M., 2000, “Pseudomonas aeruginosa, como


indicador de contaminação hídrica”, Higiene Alimentar, 11(76).

• JAWETZ, E.; MELNICK, J.L.; ADELBERG, E. A.; BROOKS, G. F.; BUTEL, J. S.;
ORNSTON, L. N., 1991, Microbiologia Médica. 18a ed., Rio de Janeiro, Guanabara
Koogan.

• PELCZAR Jr., M; CHAN, E.C.S. & KRIEG, N.R., 1997, Microbiologia: Conceitos e
Aplicações. 2 ed., v. 1., Rio de Janeiro. Makron Books do Brasil.

• PELCZAR Jr., M; CHAN, E.C.S. & KRIEG, N.R., 1997, Microbiologia: Conceitos e
Aplicações. 2 ed., v. 2, Rio de Janeiro, Makron Books do Brasil.

• MACEDO, J. A B., 2001, Águas & Águas. 1ª ed., São Paulo, Varela.

• SANCHEZ, P.S.. Apostila Atualização em Técnicas para o Controle Microbiológico


de águas minerais. 1999. São Paulo. ABINAM / Universidade Presbiteriana Mackenzie

• BRASIL, Leis , decretos, etc.... Resolução CONAMA nº 274 de 29 de novembro de


2000.

• BRASIL, Leis , decretos, etc.... Portaria nº 1469 de 29 de dezembro de 2000, Normas de


qualidade da água para consumo humano. Diário Oficial (Republica Federativa do
Brasil, 19 de fevereiro de 2001).

22
ANEXO 1
ÍNDICE DE NMP E LIMITES DE CONFIANÇA DE 95%, QUANDO SÃO
UTILIZADOS INÓCULOS DE 10ml, 1ml E 0,1ml EM SÉRIES DE 5 TUBOS*

Número de tubos com reação positiva, Índice de


Limites de confiança de 95%
em séries de 5tubos, inóculos de: NNP por
100ml da
10ml 1 ml 0,1ml amostra Inferior superior
0 0
0 0 <2 − −
1
0 0 2 1 10
0
0 1 2 1 10
0
1 2 4 1 13
0
1 0 2 1 11
1
1 0 4 1 15
0
1 1 4 1 15
1
1 1 6 2 18
0
2 2 6 2 18
0
2 0 4 1 17
1
2 0 7 2 20
0
2 1 7 2 21
1
2 1 9 3 24
0
2 2 9 3 25
0
3 3 12 5 29
0
3 0 8 3 24
1
3 0 11 4 29
0
3 1 11 4 29
1
3 1 14 6 35
0
3 2 14 6 35
1
4 2 17 7 40
0
4 0 13 5 38
1
4 0 17 7 45
0
4 1 17 7 46
1
4 1 21 9 55
2
4 1 26 12 63
0
4 2 22 9 56
1
4 2 26 12 65
0
4 3 27 12 67
1
4 3 33 15 77
0
5 4 34 16 80
0
5 0 23 9 86
1
5 0 30 10 110
2
5 0 40 20 140
0
5 1 30 10 120
1
5 1 50 20 150
2
5 1 60 30 180
0
5 2 50 20 170
1
5 2 70 30 210
2
5 2 90 40 250
0
5 3 80 30 250
1
5 3 110 40 300
2
5 3 140 60 360
3
5 3 170 80 410
0
5 4 130 50 390
1
5 4 170 70 480
2
5 4 220 100 580
3
5 4 280 120 690
4
5 4 350 160 820
0
5 5 240 100 940
1
5 5 300 100 1300
2
5 5 500 200 2000
3
5 5 900 300 2900
4
5 5 1600 600 5300
5
5 ≥ 1600 − −

*Referência: Standard Methods 20ª Edição, 1998

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ANEXO 2
Meios de cultura utilizados na Análise Bacteriológica de Água
Estes meios podem ser encontrados sob forma desidratada de fabricantes como Difco,
Sigma, Merk, Oxoid, entre outros.

1- Caldo lactosado 2-Caldo de verde brilhante – lactose - bile


Extrato de carne - 3,0 g Peptona - 10,0 g
Peptona - 5,0 g Lactose - 10,0 g
Lactose - 5,0 g Bile de boi - 20,0 g
Água destilada -11 Verde brilhante - 0,0133 g
PH 6,8-7,0. Autoclava-se a 120ºC, 15 min. Caso Água destilada -1 1
se deseje o caldo lactosado de concentração dupla, PH 7,2.
usa-se a metade da água destilada. Autoclava-se a 115ºC, 15 min. Para adicionar o
verde brilhante pode-se preparar uma solução a
0,1% em água destilada e dela juntar 13,3 ml ao
meio de cultura

3-Glicose-agar GA 4- Endo - agar


Extrato de carne - 3,0 g Peptona - 10,0 g
Peptona - 5,0 g Lactose - 10,0 g
Glicose -10,0 g K2HPO4 - 3,5 g
Agar (em pó) -10,0 g Sulfito de Sódio - 2,5 g
Água destilada -1 1 Fucsina básica - 0,5 g
PH 6,8-7,0. Autoclava-se a 120ºC, 20 min Agar (em pó) -10,0 g
Água destilada -1 1
PH 7,4. Esterilizar 115ºC, 15 min.

7- Caldo glicose-fosfato 8 - Citrato de Kozer


Peptona - 5,0 g Citrato de sódio - 3,0 g
Glicose - 5,0 g K2HPO4 - 1,0 g
K2HPO4 - 5,0 g MgSO4.7H2O - 0,2 g
Água destilada -1 1 NaNH4HPO4.4H2O - 1,5 g
Colocar porções de 5 ml em tubos de ensaio e Água destilada -11
autoclavar a 120ºCpor 15 min. Colocar porções de 5 ml em tubos de ensaios e
autoclavar a 120ºC por 15 min.

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9- Eosina-azul de metileno-agar EMB 10- Citrato de Simmons
Peptona - 10,0 g Citrato de sódio - 2,0 g
Lactose - 5,0 g MgSO4.7H2O - 0,2 g
Sacarose - 5,0 g NH4H2PO4 - 1,0 g
HK2PO4 - 2,0g NaCl - 5,0 g
Agar -10,0 g Azul de bromotimol -0,08 g
Coloca-se em balões de 100 ml ou 200 ml exatos. Agar (em pó) - 10 g
Esterilizar a 120ºC, 30 min. Água destilada -1 1
Quando for distribuir em placas, para uso, fundir o Fundir, colocar em tubos de ensaio e autoclavar a
meio, esfriar a 45ºC e juntar para cada 100 ml, 1 120ºC por 15 min.
ml de solução aquosa estéril de Eosina a 4 g/100
ml e 1 ml de solução aquosa estéril de azul-de
metileno (0,65 g/100 ml.)

11- Meio EC 12- Preparação da água tamponada para diluições


Triptose ou tripticase – 20,0 g Prepara-se uma solução “stock” dissolvendo 34,0
Lactose - 5,0 g g de KH2PO4 em 500 ml de água destilada, ajusta-
Mistura de sais biliares ou se, com NaOH 1N, o pH a 7,2 e completa-se o
Sais biliares n.º 3 -1,5 g litro com água destilada.
K2HPO4 -4,0 g Para preparar a água tamponada de diluição, junta-
KH2PO4 -1,5 g se 1,25 ml da solução “stock” a 1 l de água
NaCl - 5,0 g destilada. Distribui-se em frascos ou tubos
Água destilada -11 convenientemente e autoclava-se a 120ºC por 15
pH 6,9 min.
Colocar em tubos de fermentação e autoclavar a
115ºC por 15 min.

25
Soluções corantes e reagentes

Cristal violeta ou violeta de genciana Lugol


Solução A : Cristal violeta (90% corante) - 2,0 g Iodo -1g
Álcool etílico (95%) - 20 ml Iodeto de potássio -2g
Água destilada - 300 ml
Solução B: Oxalato de amônio - 0,8 g
Água destilada - 80 ml Misturar num almofariz o iodo e o iodeto de potássio,
Juntar as soluções A e B depois juntar a água.

Reagente indicador de vermelho de metila Reagente de Kovac’s


Vermelho de metila - 0,1 g Para-dimetil amino benzaldeido - 5,0 g
Álcool absoluto - 300 ml Álcool amílico ou butílico - 75 ml
Água destilada - 200 ml HCl concentrado - 25 ml

Reagente para a prova de Voges-Proskauer Safranina


(Método de Barrit) Safranina - 0,25 g
Solução A: α naftol - 5,0 g Álcool etílico (95%) - 10 ml
Álcool absoluto - 100 ml Água destilada - 100 ml

Solução B: KOH - 40,0 g


Água destilada - para completar 100 ml

Portaria MS 518 , de 25 de março de 2004, que aprova a norma de qualidade da água


para consumo humano. Publicada no Diário Oficial de 26 de março de 2004 - Revoga a
Portaria 1469 GM/MS de 29/12/2000.

26
ANÀLISE BACTERIOLÒGICA

CERTIFICADO N.º - 3333/2002 AMOSTRA: 03


TIPO DE AMOSTRAGEM: Água de poço (não clorada)
OBSERVAÇÃO: Saída do poço
LOCAL DA AMOSTRAGEM: Escola de Química
TEMPO DE PERFURAÇÃO: 16 anos
PROFUNDIDADE DO POÇO: 17 metros
DATA DA COLETA: 28/01/2004 HORA DA COLETA: 15:00 h
SOLICITADA POR: Rachel Perez
ENDEREÇO: Rua da Esperança no 301, Solicitude
RESPOSÁVEL PELA COLETA: O solicitante

RESULTADOS:
1. PESQUISA DE BACTÉRIAS DO GRUPO COLIFORME
Coliformes totais em 100 ml da amostra:
Coliformes fecais em 100 ml da amostra:
CONTAGEM PADRÃO DE BACTÉRIAS EM PLACAS:
2. PESQUISA DE Pseudomonas aeruginosa:

CONCLUSÃO:

Recife, 06 de fevereiro de 2004.

______________________________
André Armando Perez y Palha
Engenheiro Químico
CRQ 17.379375 – 1ª Região

27
M

GABINE

PORTARIA Nº 5

Estabe
relativo
água
potabil

0 Ministro de Estado
considerando o disposto no Ar
1977, resolve:
28

Art. 1º Aprovar a
Humano, na forma do Anexo