Partie pratique 

: Matériels et méthodes
Matériels et méthodes 
I-Matériel biologique :

1-Matériel Végétal

Notre étude est réalisée sur les feuilles adultes d’Eucalyptus globulus.

1-1-Récolte de la plante

-Description de la zone de récolte :

La région de récolte est d’une altitude de 128 m au niveau de la mer, située au sud-est
d’Algérie (34°48’00 N 5°44’00 E), c’est la wilaya de Biskra. Cette région est d’un climat
saharien sec en été et très agréable en hiver, la température moyenne est 20,9 C°.

Photo 2 : Carte géographique de la wilaya de Biskra montrant la région de récolte.

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-Procédé de récolte

La plante (l’Eucalyptus globulus) a été récoltée durant la période du mois de mars. La

partie récoltée de la plante est la feuille adulte. La récolte a lieu à proximité de laboratoire
d’extraction au niveau de département de l’agronomie, université Mohammed kheidar à
Biskra, ou il y’a des plantes d’Eucalyptus globulus cultivées. Les feuilles récoltées sont lavées
et laissées séchées a l’ombre dans un endroit sec et aéré avant de les utilisées pour l’extraction
des huiles essentielles.

Photo 3 : Eucalyptus globulus

1-2-Procédé d’extraction

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L’extraction des huiles essentielles a été effectuée par hydrodistillation dans un appareil
de type Clevenger : 100g de feuilles d’Eucalyptus globulus séchées et coupées est introduites
dans un ballon qui est déposé sur une chauffe ballon et qui est imprégné d’un litre d’eau
distillée. L’ensemble est porté à ébullition 2 à 3 heures (Faire circuler l'eau froide dans le
réfrigérant à eau). Les vapeurs chargées d’huile : en traversant le réfrigérant se condensent et
chutent dans une ampoule à décanter, l’eau et l’huile se séparent par différence de densité.
L’éther diéthylique est ajoutée au mélange, et l’ampoule à décanter est agitée et laissée
reposer. Après décantation la phase organique supérieure contenant les huiles essentielles est
récupérée. Toute trace d'eau est enlevée de la phase organique par filtration sur Büchner
contenant Na2SO4. Le solvant (l'éther diéthylique) a été évaporé à l'évaporateur rotatif.

Matériel végétal
+ l’eau distillée

Figure : Montage d’une hydrodistillation

-Calcul de rendement

Le rendement en huile essentielle est le rapport entre le poids de l’huile extraite et le poids
de la plante à traiter (P. Carré, 1953).Le rendement exprimé en pourcentage est calculé par la
formule suivante :

R = PB / PA x 100
Ou

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R= ∑PB / ∑PA x 100

R : Rendement d’huile essentielle en %

PB : Poids de l’huile en g

PA : Poids de la plante en g

II- Les souches de test

Les souches de test provenant de personnes hospitalisées,

1-Méthodes de test antimicrobien

1-1-Méthode de diffusion sur gélose (aromatogramme)

Le test est effectué en cultivant les bactéries sur un milieu M.H., puis les disques stériles
imprégnés d’H.E. sont déposés à la surface du milieu. Ensuite ils ont été incubés et inversés à
l’obscurité dans une étuve à une température de 37C° durant 24h (M. A. Ferhat et al., 2010).

-Préparation des disques

On a utilisé le papier buvard coupé en disques de 6 mm, ces derniers doivent avoir un
contour régulier pour donner une zone d’inhibition facile à mesurer. Les disques une fois
préparés, sont introduits dans un flacon en verre et placés dans l’autoclave pendant 20 minutes
à 120 C°.

-Milieu de culture

La gélose M.H. est fondu dans un bain marie à 95C° et coulée en boite de pétrie sur une
épaisseur de 4mm (environ 10ml par boite), les géloses sont pré-séchées avant l’emploi.

- Préparation des solutions de l’huile

On a préparé trois solutions d’H.E. de concentrations déférentes : ½, 1/5, 1/10 (v/v), c’est-à-
dire (50%, 20%, 10%) (v/v) dans de l’éthanol.

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-Préparation de l’inoculum

On racle 5 colonies bien isolées et parfaitement identiques à partir d’une pré-culture de

18h sur le milieu d’isolement, a l’aide d’une anse de platine.

On décharge l’anse de platine dans 10 ml d’eau physiologique stérile, puis on

homogénéise la solution bactérienne.

Le nombre des bactéries est ajusté à 108 cfu/ml par la mesure de la D.O. de la suspension
bactérienne qui est entre 0,8 à 1 à 625nm.

-L’ensemencement

Cette opération doit se faire dans les 15 minutes qui suivent la préparation de l’inoculum.
On trempe un écouvillon stérile dans la suspension bactérienne. Puis en fait flotter
l’écouvillon sur la totalité de la surface gélosée sèche, de haut en bas, en stries serrées.
L’opération doit se faire deux fois en tournant la boite de pétri d’un ongle de 60° a chaque
fois.

-L’application des disques

A l’aide d’une micropipette on met sur chaque disque 10µl de chaque concentration
différente de solution de l’huile.

Après l’application immédiate des disques, les boites sont laissées pendant 20 minutes à
température ambiante pour la diffusion de l’huile dans la gélose, puis on incube à 37C°
pendant 24h.

- Lecture

Les diamètres des zones d’inhibitions sont mesurés à l’aide d’une règle, à l’extérieur de la
boite fermée.

- Remarques

- Chaque boite de pétri contenant trois disques, un disque contient 10µl de l’antibiotiques le
plus puissant sur la souche testée comme référence positif, un disque contient 10µl de diluant
(l’éthanol) comme référence négatif et un disque contient 10µl de notre échantillon.

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-Les essais sont répétés trois fois.

Figure : Schéma illustrant la méthode des aromatogrammes

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1-2- Méthode de dilution en milieu liquide

Le principe consiste à réaliser des dilutions croissantes d’une solution mère d’un agent
antimicrobien dans un milieu liquide que l’on ensemence avec un inoculum calibré de la
souche à étudier. Après 24h d’incubation à 37C°, la plus faible concentration de la gamme
produisant l’inhibition de la culture microbienne est qualifiée de CMI (M. Kechkar, 2008).

- Préparation des solutions de l'huile

Nous avons préparé une série de dilutions à partir d’une solution mère à 50%, nous avons
préparé 5 tubes à essai, chaque tube contenant 1ml de diluant (l’éthanol), et nous avons ajouté
1ml d’huile essentielle dans le premier tube, puis nous avons pris de premier tube 1ml du
mélange et l’ajouté dans le deuxième tube, et ainsi de suite jusqu'à compléter tout les tubes. Et
enfin nous avons obtenue une série de concentrations croissantes en huile essentielle ½, ¼, 1/8,
1
/16, 1/32 (v/v).

-Ensemencement et incubation

Nous avons introduit aseptiquement 100µl des différentes concentrations d’huile

essentielle dans des tubes à essai contenant 5ml de B.N., puis d’une manière stérile nous
avons ajouté 20µl de suspension bactérienne dans chaque tube, nous avons obtenu a la fin une
série de tube contenant différentes concentrations d’huile. Après une bonne agitation, les
tubes sont incubés à 37C° pendent 24h.

-Lecture

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La lecture a été faite en comparant la présence ou l’absence de turbidité dans les différents
tubes. En parallèle nous avons utilisée pour chaque souche un tube control ou témoin
contenant que le milieu de culture et la souche concernée pour s’assurer de la bonne
croissance de nos souches.

1-3-Les microatmosphères ou méthode en phase vapeur

Cette technique permet de mettre en évidence la diffusion des composants volatils des
huiles essentielles à l’intérieur d’une boîte de Pétri. La technique consiste à disposer le disque
imbibé d’une quantité déterminée d’huile essentielle au milieu du couvercle de la boîte de
Pétri et non plus en contact direct avec la gélose ensemencée (Pibiri, 2005).

-Ensemencement et incubation

Des milieux de cultures gélosés sont coulés dans des boites de pétri sur une épaisseur de
4mm. Ces géloses sont inoculées à partir d’une suspension bactérienne (utilisée dans la
méthode de diffusion sur gélose). L’ensemencement se fait par écouvillonnage. Un disque de
papier buvard de 9cm de diamètre stérilisé est placé au fond du couvercle de chaque boite de
pétri. Juste avant la fermeture de la boite l’huile est déposée à la surface de papier. Les dépôts
sont de 0 (témoin), 10, 20, 40 et 80µl. Les boites sont immédiatement fermés et placées
renversées dans une étuve à 37C° pendant 24h.

-Lecture

A la sortie de l’étuve, l’absence de la croissance microbienne se traduit par une zone

translucide sur la gélose de contour plus ou moins nette, à tendance circulaire lorsque le
disque est bien centré. Les résultats s’expriment par un diamètre moyen en cm, ou mm.
- remarque

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Le témoin réalisé pour chaque expérience est une boite ensemencée dont le disque déposé
sur le couvercle n’est pas imbibé d’huile essentielle.

Figure 10 : Illustration de la méthode des microatmosphères

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