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TÍTULO:
CONTENIDO
1. OBJETIVO ............................................................................................................................ 3
2. ALCANCE ............................................................................................................................ 3
5. RESPONSABILIDADES.....................................................................................................5
6. DESCRIPCIÓN .................................................................................................................... 5
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OAA Código: DC-LE-05
Organismo GUIA PARA VALIDACION DE
Argentino de Versión: 1
Acreditación METODOS DE ENSAYO
Fecha de entrada en
vigencia : 26-09-2003
1. OBJETIVO
Establecer una guía para las actividades para la validación de métodos de ensayo no
normalizados, desarrollados o diseñados por el Laboratorio, métodos normalizados
empleados fuera del alcance previsto, ampliaciones y modificaciones de los métodos
normalizados y para las verificaciones necesarias para confirmar que puede aplicar
correctamente los métodos normalizados antes de utilizarlos para los ensayos. Regular
o sistematizar los métodos para la validación de las instrucciones de ensayo y de
calibración.
El objetivo de la validación es probar la aptitud de los m étodos, así como la capacidad
del laboratorio. La validación se apoya en los parámetros estadísticos del
procedimiento.
Los procedimientos y el alcance de la validación no son siempre los mismos y deben
ser establecidos individualmente.
2. ALCANCE
Esta guía la deben aplicar los laboratorios de ensayo acreditados ante el OAA, los
laboratorios que solicitan su acreditación, y los evaluadores y expertos técnicos que
actúan en los procesos de acreditación, a todos los métodos de ensayo establecidos.
3. DOCUMENTACIÓN DE REFERENCIA
3.1. MC -OAA : Manual de la Calidad del OAA: 2003.
3.2. Norma IRAM 301:2000-Norma ISO/IEC 17025: 1999.
3.3. The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method
Validation and Related Topics. EURACHEM Guide. Editor: H. Holcombe, LGC,
Teddington: 1998.
3.4. NORMA IRAM 32: : “ Metrología. Vocabulario VIM”: 1997.
3.5.Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement. Guide EURACHEM- CITAC
Guide: 2000.
3.6. Norma ISO 9000: 2000.
3.7. IUPAC, Limit of Detection, Spectrochi m. Acta 33 B, 242, 1978.
4.2. DEFINICIONES
Validación: Confirmación mediante el suministro de evidencia objetiva de que se han
cumplido los requisitos para una utilización o aplicación específica prevista (3.4.)
Verificación: Confirmación mediante la aportación de evidencia objetiva de que se
han cumplido los requisitos especificados. (3.4.).
Valor verdadero convencional (de una magnitud): valor atribuido a una magnitud
particular, y aceptado a veces por convención, porque la representa, con una
incertidumbre apropiada, para un fin dado (3.4.).
Mesurando: magnitud particular sometida a medición (3.4.).
Incertidumbre de medida: Parámetro, asociado al resultado de una medición, que
caracteriza la dispersión de los valores que podrían ser razonablemente atribuidos al
mesurando (3.4.).
Exactitud de una medición: proximidad entre el resultado de una medición y el valor
verdadero del mesurando (3.4.).
Repetibilidad (de los resultados de las mediciones): proximidad entre los
resultados de mediciones sucesivas del mismo mesurando, realizadas bajo las
mismas condiciones de medición. (Aplicación de un mismo procedimiento, a un mismo
objeto, por el mismo operador, en intervalos cortos de tiempo, con el mismo
equipamiento instrumental, en el mismo lugar) (3.4.).
Reproducibilidad: Proximidad entre los resultados de mediciones de un mismo
mesurando, realizadas bajo distintas condiciones de medición. (3.4.).
Precisión intermedia : magnitud que relaciona la variación en los resultados
observados cuando uno o más factores, tales como tiempo, equipamiento, operador,
varían dentro de un mismo laboratorio (3.5.).
Límite de detección: es la menor cantidad que puede ser distinguida del fondo con
cierto nivel de confianza especificado.
Para un resultado analítico que es muy cercano al valor del blanco, se plantea la duda
de si el valor corresponde a valores aleatorios del blanco o a la presencia real del
analito. La señal del fondo es producida es producida por el blanco y exhibe ruido. El
límite de detección (LD) corresponde a una señal k veces la desviación estándar del
ruido del fondo. Típicamente el valor de k es igual a 3 (LD=3σF ). Los valores por
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encima del LD pueden ser atribuidos a la presencia del analito y los valores por debajo
del LD son indicativos de la ausencia de analito en cantidades detectables (3.7.).
Límite de cuantificación: es la menor cantidad que puede ser determinada
cuantitativamente con una incertidumbre asociada, para un dado nivel de confianza.
Para el análisis cuantitativo debe quedar absolutamente claro que sólo se emplean
valores atribuibles al analito. El límite de cuantificación es entre 3 y 10 veces el LD
(LD= 3 σ F), según cada caso (3.7.).
5. RESPONSABILIDADES
La aplicación de este documento es responsabilidad del personal del OAA involucrado
en el proceso de acreditación y del personal de los laboratorios acreditados y de
aquellos que solicitan su acreditación.
6. DESCRIPCIÓN
La realización de actividades de validación de los métodos de ensayo utilizados por el
propio laboratorio, contemplan la satisfacción de las necesidades del cliente y la
adecuación para realizar los ensayos previstos.
El laboratorio debe confirmar que puede aplicar correctamente los métodos
normalizados previo a su uso en ensayos o calibraciones. Cualquier variación en el
método normalizado implica la repetición de dicha confirmación.
Para el caso de metodologías de ensayo o de calibración desarrolladas por el
laboratorio los métodos deben ser adecuada y totalmente validados antes de su uso.
Los equipos también deben ser calibrados y/ o validados antes de su uso.
• Item a ensayar.
• Detalle
de insumos, reactivos, materiales de referencia y acondicionamiento de
las muestras.
• Lista de equipos , instrumentos y dispositivos.
ANEXO 1
Ejemplos de determinación de parámetros estadísticos y realización de las
medidas de validación para el caso de métodos químicos de análisis.
2. Repetibilidad
Puede determinarse de una manera interna. Para ello es necesario tener en cuenta
que:
♦ Deben determinarse suficientes resultados ( recomendación: n ≥10 ).
♦ Todos los pasos del método ( incluidas la toma y preparación de la muestra,
así como la calibración ) deben realizarse n-veces.
3. Reproducibilidad
Su determinación tiene sentido y es posible solamente cuando otros laboratorios
cercanos utilizan el método de ensayo y es posible una “comparación interlaboratorios”
o cuando se realiza una ensayo de intercomparación.
5. Participación en intercomparaciones
Ver documento CE-LE- 01.
Deben tomarse en cuenta los siguientes puntos:
♦ Las intercomparaciones dan información valiosa solamente cuando las
muestras se manejan de la misma manera que las muestras de un análisis
normal.
♦ Las intercomparaciones se realizan en intervalos de tiempo largos. De ahí
que no sean suficientes para el aseguramiento de calidad rutinario, sino que
funcionan como complemento de las cartas de control, por ejemplo
♦ Entre más distintas sean las matrices de las muestras de intercomparación y
las del análisis, menos información dan las intercomparaciones para el
análisis rutinario.
♦ La interpretación de los resultados de intercomparaciones debe realizarse
con el mayor cuidado, especialmente en el caso de resultados aberrantes o
desviaciones, para obtener el mayores posibilidades de mejora.
♦ Si no se organizan intercomparaciones oficiales o provenientes de
proveedores reconocidos, se pueden realizar en su lugar comparaciones con
otros laboratorios (n ≥7).
♦ Para la realización y el tratamiento estadístico de las intercomparaciones
debe acatarse la Norma ISO 5725-1.
6. Intervalo de trabajo
El ámbito de trabajo de un método analítico es el intervalo entre los niveles más bajo y
más alto de concentraciones que ha sido demostrado que puede ser determinados con
la precisión y la exactitud requeridas para una determinada matriz.
a) Se preparan un blanco y seis concentraciones diferentes del analito a determinar o
seis muestras fortificadas a varias concentraciones. Preferiblemente las soluciones
se deben preparar independientemente y no a partir de diluciones sucesivas del
material de referencia.
b) Se representa la señal obtenida en función de la concentración y se determina el
ámbito lineal y los extremos superior e inferior del intervalo de trabajo.
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7. Ámbito lineal
Es la parte de la función de calibración en la que la señal obtenida para el analito
responde “linealmente” a la concentración. Se verifica mediante la obtención de
coeficientes de correlación mayores o iguales a 0,995.
8. Recuperación
El porcentaje de recuperación es el cociente entre la cantidad de analito medida y el
contenido en la muestra. En el caso ideal, se obtiene un 100%. En mediciones
experimentales puede perderse analito especialmente en el caso de tratamientos
complejos de muestras con analito en cantidades traza, dando lugar a porcentajes de
recuperación menores ( importante especialmente en el caso de procedimientos
cromatográficos ).
Para calcular la recuperación se determina la función de recuperación. Para lo cual se
agregan a la muestra antes del tratamiento cantidades sucesivas del analito y se
determinan contra una calibración base. Las cantidades encontradas se grafican
contra las agregadas.
En el caso ideal los valores caen en la bisectriz de la incertidumbre de los resultados.
En este caso de recuperación es del 100% y es suficiente una calibración base, analito
en un disolvente.
Si los valores se salen de este marco, debe hacerse una calibración a partir de matriz
y analito en un disolvente para eliminar el efecto de la matriz.
Variando el tiempo de adición del analito ( por ejemplo, antes y después de un paso de
concentración ) puede determinarse la recuperación para pasos aislados de un
procedimiento.
En caso de que la matriz introduzca muchas variaciones debe utilizarse en lugar de una
calibración con la matriz de la muestra el método del agregado patrón (o de las
adiciones estándar), el cual consiste en agregar concentraciones sucesivas de analito
a la muestra. Al graficar el aumento de la señal contra la cantidad adicionada se
obtiene una función de calibración, a partir de la cual puede obtenerse la cantidad de
analito presente en la muestra original.
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9. Límite de detección
Es necesario solamente cuando deben tomarse decisiones cualitativas, es decir, si el
analito está presente o no. Los procedimientos de determinación posibles son:
• 3 veces la dispersión, expresada como desviación estándar, a partir de
mediciones repetidas del blanco ( válido solamente para procedimientos con
blanco ), o de soluciones del analito en agua pura.
• 2,5 a 5 veces la relación señal/ruido del instrumento de medida a utilizar.
a) Se prepara una solución del analito de interés que contenga una concentración
entre 2,5 y 5 veces el límite de detección instrumental (informado por el
fabricante) y se analiza como mínimo de 7 veces (diez veces consecutivas es
lo aconsejable) utilizando el método analítico completo. También puede
utilizarse el blanco de reactivos.
b) Para los propósitos operativos el LD ó LOD deberá ser determinado
multiplicando por el apropiado valor estadístico de t (generalmente para un
nivel de confianza de 99%) por la desviación standard obtenida de un mínimo
de 7 lecturas), donde el t estadístico es obtenido de referencias estándares o
de la tabla que sigue:
Nº de muestras estadístico t
3 6,96
4 4,54
5 3,75
6 3,36
7 3,14
8 3,00
9 2,90
10 2,82
c) Determinar la desviación estándar (s) para cada analito, como sigue:
2
(xi – x)
s = ---------------------
n–1
donde:
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xi = la medida i de la variable x
x = el valor promedio de x.
n = es el número de análisis replicados
n
x= xi
i=1
2
El cuadrado de la desviación estándar, s , en un valor estadístico denominado
varianza.
Determinar el LD ó LOD para cada analito como sigue:
LD = t(n-1 . á - .99) (s)
donde = t(n-1 . á - .99) es el t estadístico apropiado para el número de muestras
usadas para determinar (s), al nivel del 99%. (Ver Tabla).
11. Robustez
El objetivo de la prueba de robustez es optimizar el método analítico y describir que
bajo las condiciones establecidas ( incluidas sus tolerancias ) se pueden obtener
resultados suficientemente exactos con una alta seguridad, de manera que el
procedimiento funcione confiablemente si se utiliza en otros laboratorios o después de
intervalos largos de tiempo.
Un método es más robusto entre menos dependan los resultados del ensayo de una
modificación en las condiciones de éste. Al desarrollar un nuevo método analítico debe
determinarse la modificación de los resultados por el cambio en las condiciones del
ensayo. Las condiciones que afectan el método de medición son por ejemplo, para el
caso de cromatografía:
• Laboratorio, lugar de la medición.
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• Personal.
• Aparatos.
• Reactivos, disolventes, estándares, etc.
• Caudal de las fase móvil.
• pH de la fase móvil ( p. ej. en HPLC ).
• Gradiente de temperatura ( p. ej. en GC ).
Modificaciones pequeñas a estas condiciones deben afectar muy poco o nada al
resultado del análisis.
Para determinar la robustez de un procedimiento analítico pueden modificarse algunas
condiciones del análisis y seguir las afectaciones a los resultados o a los parámetros
estadísticos. A menudo se utiliza también la evaluación de espectros o
cromatogramas.
Un aspecto importa nte de la robustez es la estabilidad de todas las muestras,
estándares y reactivos, tanto en el almacenamiento como durante las condiciones de
ensayo. En este caso pueden ser parámetros a probar:
• Sensibilidad a la temperatura.
• Sensibilidad a la luz.
• Hidrólisis p. ej. por la humedad del aire.
• Facilidad de oxidación.
• Descomposición química.
• Efectos catalíticos, p. ej. por las paredes del contenedor.
• Adsorción, p. ej. durante la filtración de disoluciones con trazas.
• Precipitación, p. ej. al dejar mucho tiempo una disolución.
12. Especificidad
La especificidad sugiere que ningún compuesto excepto el analito contribuye al
resultado de un ensayo. Esto se logra casi únicamente con las técnicas acopladas (por
ejemplo, generación de hidruros- absorción atómica). Para probar esto hay varias
posibilidades.
• Se agrega el componente que interfiere en cantidades sucesivas y se
evalúa su influencia.
• Se prueba un estándar certificado de la matriz con cantidades conocidas del
analito. Si se encuentra el valor correcto, el procedimiento es específico.
• En el caso de separaciones cromatográficas puede probarse la pureza del
pico por métodos espectroscópicos ( espectrometría de masas, infrarroja o
ultravioleta- visible.
• Puede también modificarse el sistema de separación (fase móvil y/o fase
estacionaria) en el caso de la cromatografía. Es muy baja la probabilidad de que
la misma interferencia produzca en ambos casos el mismo error en los
resultados.
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13. Selectividad
La selectividad da una indicación de cuan fuertemente un re sultado es afectado por
otros componentes de la muestra.
14. Exactitud
Para la evaluación de este parámetro se realiza el análisis de un material de referencia
certificado, preferentemente con una matriz semejante a la de la muestra. Sólo en el
caso de no existir un material adecuado se puede realizar un ensayo de recuperación.
Cuando sea posible, se realizan un mínimo de 10 repeticiones del ensayo tres días
consecutivos.
Se compara el promedio de los valores obtenidos (X) con el valor de referencia
certificado (µ ), teniendo en cuenta la incertidumbre asociada a ese material.
El módulo de la diferencia da como resultado el sesgo del método: s = X - µ