1

Новая редакция данной общей фармакопейной статьи

разработана с учетом требований общей статьи Европейской
фармакопеи 2.6.21. Nucleic Acid Amplification Techniques
(07/2014:20621).
Внесены изменения в валидацию системы для количественного
определения методом ПЦР.
Добавлена возможность использования закрытых систем
амплификации.
Частично исключены требования к квалификации оператора.

ХХ/ХХХХ:20621
2.6.21. МЕТОДЫ АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ
КИСЛОТ

1. ВВЕДЕНИЕ
Методы амплификации нуклеиновых кислот (далее – МАНК)
основаны на двух различных подходах:
1) амплификация целевой последовательности нуклеиновой
кислоты с использованием, например, полимеразной цепной реакции
(polymerase chain reaction – PCR) (далее – ПЦР), лигазной цепной
реакции (ligase chain reaction – LCR) или изотермической
амплификации рибонуклеиновой кислоты (ribonucleic acid – RNA)
(далее – РНК);
2) амплификация сигнала гибридизации с использованием,
например, для дезоксирибонуклеиновой кислоты (deoxyribonucleic acid
– DNA) (далее – ДНК) метода разветвленной ДНК; в этом случае
амплификация сигнала достигается без повторяющихся циклов
амплификации нуклеиновой кислоты.
В данной общей фармакопейной статье в качестве стандартного
метода описывается метод ПЦР. Могут применяться и альтернативные
методы, если они выдерживают требования к качеству, перечисленные
ниже.

2. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
В данной общей фармакопейной статье устанавливаются
требования к подготовке образца, к амплификации in vitro
последовательностей ДНК и к детектированию специфического
продукта ПЦР. С помощью ПЦР могут быть детектированы
определенные последовательности ДНК. Последовательности РНК
могут также быть детектированы путем обратной транскрипции РНК на
комплементарную ДНК с последующей амплификацией.

2.6.21.Методы амплификации нуклеиновых кислот (ХХ/ХХХХ:20621)

 2
3. ПРИНЦИП МЕТОДА
ПЦР представляет собой процедуру циклического синтеза in vitro
(амплификацию) выбранных фрагментов ДНК или РНК (после обратной
транскрипции на комплементарную ДНК).
После температурной денатурации двунитевой ДНК образуются
две однонитевые молекулы, к которым присоединяются синтетические
олигонуклеотиды – праймеры противоположной полярности (прямой и
обратный). Праймеры присоединяются только к комплементарной
последовательности ДНК на обеих нитях ДНК и ограничивают
амплифицируемый фрагмент с двух сторон. К 3ʹ-концу праймера
прикрепляется термостабильная ДНК-полимераза, которая синтезирует
копию целевого фрагмента ДНК in vitro.
Процесс амплификация ДНК состоит из циклов, включающих:
– тепловую денатурацию нуклеиновой кислоты (целевой
последовательности) на две отдельные нити;
– специфический отжиг целевой последовательности с
праймерами в подходящих реакционных условиях;
– наращивание праймеров, присоединенных к обеим отдельным
нитям, под воздействием ДНК-полимеразы при подходящей
температуре (синтез фрагментов ДНК).
Повторяющиеся циклы тепловой денатурации, отжига с
праймерами и синтеза ДНК приводят к экспоненциальной
амплификации фрагмента ДНК, ограниченного праймерами.
Специфический продукт ПЦР, называемый ампликоном, может
быть определен различными методами соответствующей
специфичности и чувствительности.
Мультиплексная ПЦР проводится с использованием нескольких
пар праймеров сконструированных для одновременной амплификации
различных мишеней в одной реакции.

4. ИСПЫТУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ
В связи с высокой чувствительностью ПЦР образцы должны быть
оптимальным образом защищены от контаминации нуклеиновыми
кислотами ампликонами исследуемых проб. Отбор проб, хранение и
транспортировку испытуемого материала производят в условиях,
минимизирующих разрушение целевой последовательности. В случае
проведения испытания на РНК-последовательности необходимо
принять особые меры предосторожности ввиду высокой
чувствительности РНК к деструктивному воздействию рибонуклеаз.
Следует учитывать, что некоторые добавляемые реагенты, например,
антикоагулянты или консерванты, могут оказывать влияние на ход
определения.
2.6.21.Методы амплификации нуклеиновых кислот (ХХ/ХХХХ:20621)
 3

5. МЕТОДИКА ИСПЫТАНИЯ
5.1. Предотвращение загрязнения
В связи с риском контаминации следует строго разграничивать
рабочие зоны в зависимости от используемых материалов и
применяемой технологии. Учитываемые факторы включают
передвижение персонала, использование спецодежды, перемещение
материалов, подачу воздуха и процедуры деконтаминации.
Систему следует разделить на такие отсеки, как:
– зона основной смеси (зона, в которой работы осуществляются
только с материалами, не содержащими шаблонных
последовательностей, например, с праймерами, буферными растворами
и т. д.);
– пре-ПЦР (зона, в которой ведется работа с реагентами,
образцами и контролями);
– ПЦР-амплификация (амплифицируемый материал содержится в
закрытой системе);
– пост-ПЦР детектирование (единственная зона, в которой
операции с амплифицируемым материалом производятся в открытой
системе).
В случае использования закрытой системы строгое разделение зон
не обязательно.
5.2. Подготовка образцов
При подготовке образцов подлежащая амплификации целевая
последовательность должна быть эффективным и воспроизводимым
образом экстрагирована или высвобождена из испытуемого материала
так, чтобы амплификация в избранных реакционных условиях была
осуществима. Могут быть использованы различные физико-химические
процедуры экстракции и/или обогащения.
Добавки, присутствующие в испытуемом материале, могут
оказывать влияние на ход ПЦР. Для контроля присутствия ингибиторов
в испытуемом материале следует провести процедуры, описанные в
пункте 7.3.2.
В случае РНК-матриц следует уделять внимание предотвращению
проявления рибонуклеазной активности.
5.3. Амплификация
Амплификация целевой последовательности методом ПЦР
проводится в оптимизированных циклически изменяющихся условиях
(температурный профиль для денатурации двунитевой ДНК, отжига и
наращивания праймеров; периоды инкубации при выбранных
температурах; скорость наращивания). Эти условия зависят от
различных параметров, например:
2.6.21.Методы амплификации нуклеиновых кислот (ХХ/ХХХХ:20621)
 4
– длины и состава праймера и целевой последовательности;
– типа ДНК-полимеразы, буферной смеси и реакционного объема,
используемых при амплификации;
– типа используемого устройства для термоциклирования и
скорости передачи тепла между аппаратом, реакционным сосудом и
реакционной жидкостью.
5.4. Детектирование
Ампликон, образовавшийся в результате ПЦР, может быть
идентифицирован по размеру, последовательности химической
модификации или комбинации этих параметров. Характеризация по
размеру может быть проведена методами гель-электрофореза (с
использованием агарозного или полиакриламидного гелей или
капиллярного электрофореза) или колоночной хроматографии
(например, ВЭЖХ). Характеризация по составу последовательности
может быть проведена путем специфической гибридизации зондов,
содержащих последовательность, комплементарную мишени, или
расщеплением амплифицированного материала, отражающим наличие
мишень-специфических сайтов ферментативной рестрикции.
Характеризация по химической модификации может быть проведена,
например, введением в ампликоны флуорофора с дальнейшей детекцией
флуоресценции, возникающей в результате возбуждения.
Детектирование ампликонов может быть достигнуто с помощью
проб, помеченных для последующего хемилюминесцентного,
радиоизотопного или иммуноферментного детектирования.

6. ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результат испытания является достоверным лишь при условии
получения однозначно положительных результатов для положительного
контроля (контролей) и однозначно отрицательных результатов для
отрицательного контроля (контролей). В связи с исключительно
высокой чувствительностью метода ПЦР и с риском попадания
загрязняющих примесей, положительные результаты должны
подтверждаться двукратным полным повторением процедуры
испытания по возможности с новой аликвотой образца. Считают, что
образец дает положительную реакцию, если не менее одного из
повторных испытаний дает положительный результат. Как только
определен измеряемый предел мишени, необходима система
количественного определения.

7. ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА
7.1. Валидация системы для количественного определения
методом ПЦР
2.6.21.Методы амплификации нуклеиновых кислот (ХХ/ХХХХ:20621)
 5
Программа валидации должна включать валидацию оборудования
и используемого метода ПЦР. Следует учитывать положения,
изложенные в общей фармакопейной статье #5.3.2. Валидация
аналитических методик.
Для валидации ПЦР-испытания применяются подходящие
стандартные образцы предприятия, калиброванные относительно
Международных стандартных образцов целевой последовательности,
где применимо.
7.1.1. Определение граничного положительного значения
При валидации испытания должно быть определено граничное
положительное значение. Граничное положительное значение
определяется как минимальное количество целевой последовательности
в объеме образца, которые могут быть определены в 95 % испытаний.
Граничное положительное значение зависит от таких взаимосвязанных
факторов, как объем экстрагированного образца и эффективность
методологии экстракции, транскрипция РНК-мишени в
комплементарную ДНК, процесс амплификации и детектирования.
При определении предела обнаружения системы следует
учитывать граничные положительные значения для каждой целевой
последовательности и результаты проведения испытания выше и ниже
этих значений.
7.1.2. Система количественного определения
При валидации количественного определения проверяются
следующие параметры: правильность, прецизионность, специфичность,
предел количественного определения, линейность, диапазон и
робастность.
7.2. Контроль качества реагентов
Все реагенты, имеющие критическое значение для используемой
методологии, должны проходить контроль перед использованием в
рутинных испытаниях. Их пригодность или непригодность
основывается на заранее определенных критериях качества.
Праймеры являются важнейшими компонентами ПЦР-анализа, и
поэтому следует уделять особое внимание их строению, чистоте и
валидации для ПЦР-анализов. Праймеры могут быть подвергнуты
модификации (например, связыванием с флуорофором или антигеном)
для проведения детектирования ампликона специфическими методами
при условии, что такие модификации не приведут к ингибированию
правильного и эффективного протекания процесса амплификации
целевой последовательности.
7.3. Контроль хода испытания
7.3.1. Внешние контроли
Для минимизации риска контаминации и обеспечения адекватной
2.6.21.Методы амплификации нуклеиновых кислот (ХХ/ХХХХ:20621)
 6
чувствительности в состав каждого ПЦР-испытания вводят следующие
внешние контроли:
– положительный контроль: в нем содержится определенное
количество копий целевой последовательности; количество копий
близко к граничному положительному значению, определяется
индивидуально для каждой системы и кратно граничному
положительному значению данной системы;
– отрицательный контроль: образец аналогичного основного
состава, для которого доказано отсутствие целевой последовательности.
7.3.2. Внутренний контроль
Внутренние контроли представляют собой определенные
последовательности нуклеиновых кислот, содержащие сайты
связывания с праймерами, если нет других указаний в частной статье.
Внутренние контроли должны амплифицироваться так же эффективно,
как и испытуемая целевая последовательность, но ампликоны должны
иметь четкие отличия. Тип нуклеиновой кислоты (ДНК/РНК),
используемой в качестве внутреннего контроля, должен быть тем же,
что и в испытуемом материале. Внутренний контроль предпочтительно
добавлять к испытуемому материалу до выделения нуклеиновой
кислоты; при этом он может использоваться для общего контроля
процесса (экстракция, обратная транскрипция, амплификация,
детектирование).
7.3.3. Контроль пороговых значений
Контроль пороговых значений для количественного определения
— это испытуемый образец с таким содержанием аналита, которое не
должно превышаться. Он содержит аналит, калиброванный желательно
в Международных единицах, и анализируется параллельно при каждом
количественном определении.
7.4. Внешняя оценка качества
Участие во внешних программах оценки качества представляет
собой важную процедуру обеспечения качества ПЦР-анализов для
каждой лаборатории и каждого оператора.

Следующий раздел приводится для информации.

Валидация метода амплификации нуклеиновых кислот в

определении РНК вируса гепатита С в пулах плазмы: руководство

1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
Большинство аналитических методик, основанных на
амплификации нуклеиновых кислот, представляют собой качественные
испытания на наличие нуклеиновых кислот. Существует также
2.6.21.Методы амплификации нуклеиновых кислот (ХХ/ХХХХ:20621)
 7
некоторое количество методик количественного определения (либо
внутренних, либо коммерчески доступных). Для определения
контаминации пулов плазмы РНК вирусом гепатита C (hepatitis C virus)
(далее – HCV) адекватными являются качественные испытания, которые
могут быть рекомендованы как предельные испытания при контроле
содержания примесей. В этом руководстве описаны лишь методы
валидации качественных аналитических методик оценки загрязнения
пулов плазмы РНК HCV на основе амплификации нуклеиновых кислот.
Поэтому двумя наиболее важными характеристиками для валидации
аналитического метода являются его специфичность и предел
определения. Кроме того, должна быть оценена робастность
аналитического метода.
Однако этот документ также может быть использован в качестве
основы для валидации амплификации нуклеиновых кислот в общем.
В соответствии с данным документом за аналитическую
процедуру принимают всю процедуру от экстракции нуклеиновой
кислоты до детектирования амплифицированного продукта.
При использовании в аналитическом методе или его части
коммерческого набора, валидацию пользователя может заменить
документированное подтверждение валидации вышеуказанных
положений, произведенной изготовителем набора. Тем не менее,
пользователем должна быть продемонстрирована производительность
набора в отношении его предполагаемого использования (т.е. предел
определения, робастность, перекрестная контаминация).

2. СПЕЦИФИЧНОСТЬ
Специфичность представляет собой способность к однозначной
оценке присутствия нуклеиновой кислоты в смеси с компонентами,
присутствие которых можно ожидать.
Специфичность аналитических методов, основанных на
амплификации нуклеиновых кислот, зависит от выбора праймеров,
выбора зонда (для анализа конечного продукта) и обоснованности
условий проведения испытания (как для стадии амплификации, так и
для стадии детектирования).
При разработке праймеров и зондов должна быть исследована их
специфичность в отношении детектирования только РНК HCV путем
сравнения выбранной последовательности с последовательностями,
опубликованными в банках данных. В случае HCV праймеры (и зонды)
обычно выбирают из областей 5ʹ-некодируемого участка генома HCV,
которые хорошо сохраняются для всех генотипов.
Амплифицированный продукт должен однозначно
идентифицироваться одним из методов, например, проведением
2.6.21.Методы амплификации нуклеиновых кислот (ХХ/ХХХХ:20621)
 8
амплификации с вложенными праймерами, анализом с использованием
ферментов рестрикции, секвенированием или гибридизацией со
специфическим зондом.
Для валидации специфичности аналитического метода испытание
должно быть проведено в отношении не менее 100 РНК HCV-
отрицательных пулов плазмы, для которых должно быть показано
отсутствие реакции. Подходящие образцы пулов, не дающих реакции,
могут быть получены в Европейском управлении по качеству
лекарственных средств и здравоохранению при Совете Европы
(European Directorate for the Quality of Medicines & Healthcare (Council
of Europe)).
Способность аналитического метода к обнаружению всех
генотипов HCV также зависит от выбора праймеров, зондов и
параметров метода. Эта способность должна быть продемонстрирована
с использованием характеризованных панелей сравнения. Однако,
ввиду сложности получения некоторых генотипов (например, генотипа
6), должны быть на подходящем уровне детектированы генотипы
преобладающих типов (например, в Европе — генотипы 1 и 3).

3. ПРЕДЕЛ ОБНАРУЖЕНИЯ
За предел обнаружения данной аналитической процедуры
принимают наименьшее количество нуклеиновой кислоты в образце,
которое может быть детектировано, но не обязательно определено как
точное значение.
Аналитический метод с использованием амплификации
нуклеиновых кислот, используемый для детекции РНК HCV в пулах
плазмы, обычно дает качественные результаты. Количество возможных
результатов ограничено двумя: либо положительным, либо
отрицательным. Хотя рекомендуется определение предела
обнаружения, в практических целях для аналитического метода на
основе амплификации нуклеиновых кислот должно быть определено
граничное положительное значение. Граничное положительное
значение (в соответствии с определением в общей фармакопейной
статье 2.6.21. Методы амплификации нуклеиновых кислот)
представляет собой минимальное количество целевой
последовательности в объеме образца, которое может быть определено
в 95 % испытаний. На это граничное положительное значение
оказывают влияние распределение вирусных геномов в
индивидуальных испытуемых образцах и такие факторы, как
эффективность фермента. Это может привести к получению различных
95 % граничных значений для отдельных испытаний.
Для определения граничного положительного значения ряд
2.6.21.Методы амплификации нуклеиновых кислот (ХХ/ХХХХ:20621)
 9
разведений рабочего реагента или БСП вируса гепатита С,
калиброванного в сравнении с Международным стандартным образцом
HCV Всемирной организации здравоохранения (далее – ВОЗ), должен
быть подвергнут испытанию в разные дни для проверки изменчивости
результатов анализа. Для проведения статистического анализа
результатов должно быть испытано не менее трех независимых рядов
разведений в достаточном количестве повторностей для получения 24
результатов испытания для каждого разведения.
Например, в лаборатории в разные дни могут быть проведены
испытания трех рядов разведений в восьми повторностях для каждого
из них, четырех рядов разведений в шести повторностях для каждого из
них или шести рядов разведений в четырех повторностях для каждого
из них. Для того чтобы число разведений не было слишком большим,
следует провести предварительное испытание (например, с
использованием логарифмических (log10) разведений образца пула
плазмы) с получением предварительного граничного положительного
значения (т.е. наибольшего разведения, дающего положительный
результат). После этого диапазон разведений может быть выбран в
области полученного предварительного значения (с использованием,
например, логарифмического (log10) фактора разведения 0,5 или менее и
отрицательного пула плазмы для матрицы разведения). Концентрация
РНК HCV, которая может быть детектирована в 95 % испытаний, может
быть вычислена с использованием соответствующих методов
статистической оценки.
Эти результаты также могут служить для оценки изменчивости
результатов, получаемых данным аналитическим методом в ходе
испытания и в разные дни.

4. РОБАСТНОСТЬ
Робастность аналитического метода — мера его способности
выдерживать воздействие малых, но определенных изменений
параметров метода, являющаяся показателем его надежности при
обычном использовании.
Оценка надежности должна проводиться в фазе разработки. Она
должна показать надежность аналитической процедуры с учетом
определенных вариаций параметров метода. Для случая МАНК
небольшие изменения параметров метода могут иметь решающее
значение. Однако в ходе разработки метода его устойчивость может
быть продемонстрирована небольшим изменением концентраций
реагентов (например, MgCl2, праймеров или нуклеотидов). Для
демонстрации устойчивости не менее 20 РНК HCV-отрицательных
пулов плазмы, отобранных случайным образом и инфицированных РНК
2.6.21.Методы амплификации нуклеиновых кислот (ХХ/ХХХХ:20621)
 10
HCV с получением конечной концентрации, в три раза превышающей
заранее определенное 95 % граничное значение, должны быть испытаны
и признаны положительными.
Проблемы с робастностью могут возникнуть также в связи с
методами, в которых стадия ультрацентрифугирования предшествует
экстракции вирусной РНК. Поэтому для испытания робастности таких
методов не менее 20 пулов плазмы, содержащих различные уровни РНК
HCV, но не содержащих специфических антител к HCV, должны быть
испытаны и признаны положительными.
Предотвращение перекрестной контаминации должно быть
продемонстрировано путем точного детектирования панели из не менее
чем 20 образцов, попеременно заполненной образцами отрицательных
пулов плазмы и отрицательных пулов плазмы, инфицированных
высокими концентрациями HCV (не менее 100-кратного 95 %
граничного значения или не менее 104 МЕ/мл).

5. ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА
Для таких биологических испытаний, как МАНК, имеется
вероятность возникновения специфических проблем, которые могут
повлиять как на валидацию, так и на интерпретацию результатов.
Методики испытаний должны быть четко описаны в форме стандартных
операционных процедур. В них должно указываться:
– способ отбора проб (тип контейнеров и т.д.);
– приготовление мини-пулов (где применимо);
– условия хранения до анализа;
– четкое описание условий испытания, включая меры
предосторожности против перекрестной контаминации и деструкции
вирусной РНК, используемых реагентов и стандартных препаратов;
– четкое описание используемых приборов;
– детальные формулы для вычисления результатов, включая
статистическую обработку.
В качестве удовлетворительной проверки соответствия системы и
надежности аналитической процедуры, когда бы она ни использовалась,
может быть рекомендован подходящий контроль процесса (например,
подходящее разведение БСП вируса гепатита С или образец плазмы,
инфицированной HCV, калиброванный в сравнении с Международным
стандартным образцом HCV ВОЗ).
Техническая квалификация. Каждой критической части
используемого оборудования должна соответствовать программа
квалификации по установке и эксплуатации. После замены критически
важного оборудования (например, терморегуляторов) должна быть
документально подтверждена функциональность аналитической
2.6.21.Методы амплификации нуклеиновых кислот (ХХ/ХХХХ:20621)
 11
процедуры путем проведения параллельного испытания в отношении 8
повторных образцов пула плазмы, инфицированного РНК HCV с
получением конечной концентрации, соответствующей ранее
определенному трехкратному 95 % граничному значению. Все
результаты должны быть положительными.
Квалификация оператора. В отношении каждого оператора,
принимающего участие в испытании, должна действовать
соответствующая квалификационная программа.

Валидация метода амплификации нуклеиновых кислот для

количественного определения ДНК вируса B19 в пулах плазмы:
руководство

1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
Фармакопея требует, чтобы пулы плазмы, использующиеся при
производстве некоторых продуктов, были проверены на содержание
ДНК вируса B19 (далее – B19V), допустимая концентрация которой
ограничена. Для выполнения этого требования выделены
количественные МАНК. Наиболее важными характеристиками для
валидации количественного МАНК являются: правильность,
прецизионность, специфичность, предел количественного определения,
линейность и диапазон. Кроме того, должна быть оценена робастность
аналитического метода.
В этом руководстве описаны способы валидации МАНК для
определения контаминации пулов плазмы ДНК B19V. Однако этот
документ также может быть использован в качестве основы для
валидации амплификации нуклеиновых кислот в общем.
В соответствии с данным документом за аналитическую
процедуру принимают всю процедуру от экстракции нуклеиновой
кислоты до детектирования амплифицированного продукта.
При использовании в аналитическом методе или его части
коммерческого набора, валидацию пользователя может заменить
документированное подтверждение валидации вышеуказанных
положений, произведенной изготовителем набора. Тем не менее,
пользователем должна быть продемонстрирована производительность
набора в отношении его предполагаемого использования (т.е. точность,
правильность, диапазон, робастность).

2. ПРАВИЛЬНОСТЬ
Правильность представляет собой близость совпадения между
найденным значением и либо значением, которое определено как
условно правильное, либо принятым значением сравнения.
2.6.21.Методы амплификации нуклеиновых кислот (ХХ/ХХХХ:20621)
 12
Правильность количественного определения зависит от
градуировочного графика и от отклонений на различных стадиях
количественного определения. Хотя рекомендовано определять
точность во всем специфицированном диапазоне, наиболее важно
подтвердить точность в диапазоне около предельного значения
концентрации. В случае количественного определения ДНК B19V в
пулах плазмы рекомендуется оценивать правильность метода путем
количественного определения не менее 5 концентраций (с
логарифмическим (log10) коэффициентом разведения 0,5) БСП вирусной
ДНК B19 для метода амплификации нуклеиновых кислот или иного
стандартного образца, калиброванного в Международных единицах в
сравнении с Международным стандартным образцом ВОЗ ДНК B19V, в
диапазоне рекомендованного на данный момент порогового значения
10,0 МЕ/мкл ДНК B19V (т.е. 105 МЕ/мл, 104,5 МЕ/мл, 104 МЕ/мл,
103,5 МЕ/мл и 103 МЕ/мл) не менее чем в трех повторностях для каждого
разведения. Правильность должна быть документирована для
различных концентраций в процентных единицах, определенных в
сравнении с известным количеством ДНК B19V. Необходимо отражать
уровень технологии соответствующего метода количественного
определения, который следует также определять, например, с помощью
совместных испытаний.

3. ПРЕЦИЗИОННОСТЬ
Прецизионность представляет собой близость совпадения между
сериями измерений, полученных в многочисленных испытаниях
различных проб одного и того же гомогенного образца. Прецизионность
определяется на трех уровнях:
– повторяемость выражает точность при одних и тех же условиях
испытания в течение короткого промежутка времени; она оценивается с
использованием одного метода количественного определения, с
помощью которого трижды анализируют подходящие разведения
положительных образцов с ДНК B19V, калиброванных в
Международных единицах и охватывающих весь диапазон этого метода
количественного определения; коэффициент вариации рассчитывают
для индивидуальных образцов;
– внутрилабораторная прецизионность выражает
внутрилабораторную вариабельность; она устанавливается оценкой
повторов (как рутинный количественный анализ) подходящих
разведений положительных образцов с ДНК B19V, калиброванных в
Международных единицах и охватывающих весь диапазон этого метода
количественного определения, в различной обстановке (т.е. различные
дни, различные аналитики, различное оборудование, различные
2.6.21.Методы амплификации нуклеиновых кислот (ХХ/ХХХХ:20621)
 13
реактивы); коэффициент вариации рассчитывают для индивидуальных
образцов;
– воспроизводимость выражает точность между различными
лабораториями (межлабораторная прецизионность); она оценивается
путем участия в совместных количественных изучениях содержания
ДНК B19V.

4. СПЕЦИФИЧНОСТЬ
Специфичность представляет собой способность к однозначной
оценке присутствия нуклеиновой кислоты в смеси с компонентами,
присутствие которых можно ожидать. Специфичность аналитических
методов, основанных на амплификации нуклеиновых кислот, зависит от
выбора праймеров, выбора зонда (для анализа конечного продукта) и
обоснованности условий проведения испытания (как для стадии
амплификации, так и для стадии детектирования).
При разработке праймеров и зондов должна быть исследована их
специфичность в отношении детектирования только ДНК B19V путем
сравнения избранной последовательности с последовательностями,
опубликованными в банках данных. Не должно обнаруживаться
значительное сходство с последовательностями, не относящимися к
B19V.
Амплифицированный продукт должен однозначно
идентифицироваться одним из многих методов, например, проведением
амплификации с вложенными праймерами, анализом с использованием
ферментов рестрикции, секвенированием или гибридизацией со
специфическим зондом.
Для проверки специфичности аналитического метода испытание
должно быть проведено в отношении не менее 20 ДНК B19V-
отрицательных пулов плазмы, для которых должно быть показано
отсутствие реакции.
Генотипы парвовируса B19. Международная комитет по
таксономии вирусов классифицирует представителей 3 генотипов как
штаммы человеческого парвовируса B19. Генотип 1 представляет
прототип B19V, генотип 2 представляет вирусные последовательности
типа А6, и генотип 3 представляет V9-подобные последовательности.
При проведении удлинения последовательности с использованием
соответствующей последовательности генотипа B19V, доступной из баз
данных последовательностей нуклеиновых кислот, праймеры и зонды
должны быть выполнены с таким расчетом, чтобы была возможность
обнаружения и количественного определения в равной степени
различных генотипов парвовируса B19. Для проверки выбранного
подхода следует использовать стандартные образцы. Так как получение
2.6.21.Методы амплификации нуклеиновых кислот (ХХ/ХХХХ:20621)
 14
биологических препаратов сравнения может быть затруднено,
соответствующие препараты плазмид или синтетических нуклеиновых
кислот также могут служить в качестве источника характеризованных
последовательностей-целей. Однако они не могут быть использованы
для валидации процедуры экстракции.

5. ПРЕДЕЛ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Предел количественного определения представляет собой
минимальное количество нуклеиновой кислоты в образце, которое
может быть количественно определено с требуемой правильностью и
прецизионностью. Предел количественного определения метода
амплификации нуклеиновых кислот B19V оценивают при изучении
правильности и межлабораторной прецизионности путем ограничения
разведений. Определяют наименьшую концентрацию целевой
последовательности, которая может быть определена количественно с
достаточной правильностью и прецизионностью.

6. ЛИНЕЙНОСТЬ
Линейность метода количественного определения — это
возможность получения результатов, прямо пропорциональных
концентрации нуклеиновой кислоты. Линейность метода амплификации
нуклеиновых кислот B19V оценивают при изучении повторяемости и
межлабораторной прецизионности путем испытания повторностей
разведенных образцов с концентрациями, охватывающими весь
диапазон количественного определения. Определяют интервал,
расположенный между верхней и нижней концентрациями целевой
последовательности, при которых получаемые результаты прямо
пропорциональны ее содержанию.

7. ДИАПАЗОН
Диапазон количественного определения — это интервал,
расположенный между верхней и нижней концентрациями нуклеиновой
кислоты в образце, для которого было показано, что процесс имеет
приемлемый уровень правильности, точности и линейности. Диапазон
метода амплификации нуклеиновых кислот B19V оценивают при
изучении сходимости и межлабораторных сличениях путем испытаний
повторностей разведенных образцов. Определяют интервал,
расположенный между верхней и нижней концентрациями целевой
последовательности, который может быть выражен с приемлемой
степенью правильности и прецизионности.

8. РОБАСТНОСТЬ
2.6.21.Методы амплификации нуклеиновых кислот (ХХ/ХХХХ:20621)
 15
Робастность аналитического метода — мера его способности
выдерживать воздействие малых, но определенных изменений
параметров метода, являющаяся показателем его надежности при
обычном использовании. Оценка надежности должна проводиться в
фазе разработки. Она должна показать надежность аналитической
процедуры с учетом определенных вариаций параметров метода. Для
случая МАНК небольшие изменения параметров метода могут иметь
решающее значение. Однако в ходе разработки метода его устойчивость
может быть продемонстрирована небольшим изменением концентраций
реагентов, например, MgCl2, праймеров или нуклеотидов. Для
демонстрации устойчивости не менее 20 ДНК B19V-отрицательных
пулов плазмы, инфицированных ДНК B19V с получением конечной
концентрации около граничного значения, должны быть испытаны с
получением приемлемых количественных значений.
Предотвращение перекрестной контаминации должно быть
продемонстрировано путем точного детектирования панели из не менее
чем 20 образцов, попеременно заполненной образцами пулов плазмы
без ДНК B19V или с концентрацией ниже порогового значения (10
образцов) и пулов плазмы, инфицированных высокими концентрациями
ДНК B19V (не менее 100-кратного граничного значения, 10 образцов).

9. ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА
Для таких биологических испытаний, как МАНК, имеется
вероятность возникновения специфических проблем, которые могут
повлиять как на валидацию, так и на интерпретацию результатов.
Методики испытаний должны быть четко описаны в форме стандартных
операционных процедур. В них должно указываться:
– способ отбора проб (тип контейнеров и т.д.);
– приготовление мини-пулов производителем (где применимо);
– условия хранения до анализа;
– четкое описание условий испытания, включая меры
предосторожности против перекрестной контаминации и деструкции
вирусных нуклеиновых кислот, используемых реагентов и стандартных
препаратов;
– четкое описание используемой аппаратуры;
– детальные формулы для вычисления результатов, включая
статистическую обработку.
В качестве удовлетворительной проверки соответствия системы и
надежности аналитической процедуры, когда бы она ни использовалась,
может быть рекомендован подходящий контроль процесса (например,
плазма, инфицированная образцом ДНК вируса B19V, калиброванным в
Международных единицах в сравнении с БСП вирусной ДНК B19 для
2.6.21.Методы амплификации нуклеиновых кислот (ХХ/ХХХХ:20621)
 16
метода амплификации нуклеиновых кислот).
Техническая квалификация. Каждой критической части
используемого оборудования должна соответствовать программа
квалификации по установке и эксплуатации. После замены критически
важного оборудования (например, терморегуляторов) должна быть
документально подтверждена функциональность путем проведения
параллельного испытания в отношении 8 повторных образцов пула
плазмы, инфицированного ДНК B19V с получением конечной
концентрации около граничного значения. Все результаты должны быть
приемлемыми и должны отражать возможности метода
количественного определения, как было определено при валидации.
Квалификация оператора. В отношении каждого оператора,
принимающего участие в испытании, должна действовать
соответствующая квалификационная программа.

2.6.21.Методы амплификации нуклеиновых кислот (ХХ/ХХХХ:20621)