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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

ESCOLA SUPERIOR DE AGRICULTURA “LUIZ DE QUEIROZ”

Disciplina: Microbiologia e Biotecnologia do Solo


Departamento de Ciência do Solo

Docentes: Elke Jurandy Bran Nogueira Cardoso


Fernando Dini Andreotte

RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS


AMONIFICADORES

Aluna: Patricia D. C. Schaker

PIRACICABA, MAIO 2011.

Introdução
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A presente prática foi realizada com a finalidade de quantificar os
microrganismos amonificadores em solo nativo e agrícola. O processo pelo qual o
nitrogênio circula através das plantas e do solo pela ação de organismos vivos é
conhecido como ciclo do nitrogênio. Este ciclo é um dos mais importantes nos
ecossistemas terrestres, isto porque o nitrogênio é usado pelos seres vivos para a
produção de moléculas complexas necessárias ao seu desenvolvimento tais como
aminoácidos, proteínas e ácidos nucléicos.
O principal repositório de nitrogênio é a atmosfera, que é composta por
aproximadamente 78% de nitrogênio, onde este elemento se encontra sob a forma de
gás (N2). Outros repositórios consistem em matéria orgânica nos solos e oceanos.
Apesar de extremamente abundante na atmosfera o nitrogênio é frequentemente o
nutriente limitante do crescimento das plantas. Isto acontece porque as plantas apenas
conseguem usar o nitrogênio sob as formas de íon amônio (NH4+), íon nitrito (NO2-) e
íon nitrato (NO3-), cuja existência não é tão abundante. Estes compostos são obtidos
através de vários processos tais como a fixação e amonificação e nitrificação.
Os microrganismos estão diretamente envolvidos no ciclo do nitrogênio e a
quantificação de grupos importantes dá a indicação de como os processos estão
ocorrendo. Assim, a amonificação ou degradação dos compostos nitrogenados
orgânicos é um dos passos da mineralização do nitrogênio e permite sua
disponibilização para as plantas. Muitos microrganismos quimiorganotróficos são
capazes de efetuar esta transformação, tanto em condições aeróbias quanto anaeróbias.
Neste ultimo caso, as taxas de transformação são mais lentas. A formação de amônio é
tipicamente o resultado de um processo de excreção de N celular durante a
decomposição de formas orgânicas de N (Cardoso et al. 1992). Assim, sua
quantificação nos solos fornece um indicativo do processo de mineralização do
nitrogênio e do ciclo deste elemento no solo.

Objetivo

Avaliar a variação do número de microrganismos amonificadores em solo nativo


e agrícola, e a resposta desta classe de microrganismos ao uso do solo.

Métodos

Foi utilizado o protocolo descrito por Sarathchandra (1978), com algumas


modificações. Inicialmente o solo proveniente de área nativa e de cultura anual foi
peneirado e as raízes foram removidas. Em seguida pesou-se 10 gramas de solo e
adicionados em frasco de Erlenmeyer contendo 90 mL de solução salina (NaCl 0,85%)
estéril, correspondendo à diluição 10-1. Em seguida foram preparadas as diluições
seriadas de 10-2 a 10-6 em solução salina. Para tanto foram tomados 1000 µL da diluição
10-1 após homogeneização, e passados para um tubo de ensaio contendo 9 mL de
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solução salina, correspondendo então à diluição 10-2. O mesmo procedimento foi
realizado para as diluições 10-3 a 10-6.
Em seguida, em tubos estéreis contendo 2 mL do meio de cultura para
amonificadores (Tabela 1), foram adicionados 100 µL das diluição 10 -2 a 10-6, com
quatro repetições. Estes tubos foram incubados durante sete dias a 28ºC. Após este
período foi realizada a avaliação de crescimento pela mudança da coloração do meio de
laranja para rosa de cada um dos tubos, e, a partir dos dados de positivo ou negativo
para o crescimento, obtemos o NMP (número mais provável) de microrganismos por
grama de solo (Woomer, 1994).
O método baseia-se no princípio de que o meio utilizado apresenta apenas
nitrogênio orgânico, que é indisponível para a grande maioria das plantas. Se houver
microrganismos amonificadores no solo estes irão utilizar as proteínas e os aminoácidos
como fonte para suas próprias proteínas e liberam o excesso de nitrogênio sob a forma
de amônio (NH4+) no meio, que ficará disponível. Com a produção do NH4+ haverá
também a produção o íon OH-, que promove o aumento do pH do meio, ocasionando a
mudança da coloração do mesmo de laranja para rosa.

Tabela 1. Composição do meio de cultura utilizado para indicação de atividade


amonificante.
Composto Função Quantidade
Caseína hidrolisada Fonte de nitrogênio 10 g
orgânico
Extrato de levedura Fonte de nitrogênio 0,1 g
orgânico
Fosfato de potássio Fonte de Micronutrientes 1,0 g
monoácido (especialmente K)
Sulfato de magnésio Fonte de Micronutrientes 0,1 g
(especialmente Mg)
Sulfato ferroso Fonte de Micronutrientes 0,01 g
(especialmente Fe)
Sulfato de Manganês Fonte de Micronutrientes 0,01 g
(especialmente Mn)
Vermelho Fenol Indicador de pH 0,01 g
Água destilada ou Solvente 1000 mL
deionizada

Resultados e discussão

A maior parte do nitrogênio encontrado no solo provém de materiais orgânicos


mortos, nos quais existe sob a forma de compostos orgânicos complexos, tais como
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proteínas, aminoácidos, ácidos nucléicos e nucleotídeos. Entretanto, estes compostos
nitrogenados são, em geral, rapidamente decompostos em substâncias mais simples por
organismos que vivem nos solos. As bactérias saprófitas e várias espécies de fungos
são os principais responsáveis pela decomposição de materiais orgânicos mortos. Estes
microrganismos utilizam as proteínas e os aminoácidos como fonte para suas próprias
proteínas e liberam o excesso de nitrogênio sob a forma de amônia (NH3), no processo
de amonificação. Em geral, a amônia produzida por amonificação é dissolvida na água
do solo, onde se combina a prótons para formar o NH4+ e OH-. Assim, a amonificação,
também chamada de mineralização, é o processo que retorna o nitrogênio incorporado
(orgânico) para a forma de amônia (inorgânico).
Na tabela 2 é apresentado o número de tubos que apresentaram crescimento para
cada uma das diluições utilizadas (10-2 a 10-6), o respectivo NMP e os valores utilizados
para o cálculo do Log das unidades formadoras de colônia por grama de solo fresco,
bem como o resultado final.

Tabela 2. Número Mais provável de microrganismos amonificadores por


grama de solo nativo e agrícola. Parâmetros utilizados para obtenção do valor.
Solo nativo Solo Agrícola
R1 R2 R1 R2
-2
10 4 4 4 4
10-3 4 4 4 4
-4
10 4 4 4 0
-5
10 4 4 2 0
-6
10 1 1 1 0
NMP correspondente 38,44 38,44 9,39 2,31
Valor inoculado (µL) 100 100 100 100
Fator de multiplicação 10000*10 10000*1 10000*1 1000*10
0 0
Valor real UFC/g solo 3844000 3844000 939800 23110
Log UFC/g solo 6,58 6,58 5,97 4,36
Média Log UFC/g solo 6,58 5,16

Foi possível observar que em solo nativo há aproximadamente 10 vezes mais


microrganismos amonificadores que em solo agrícola. Este comportamento pode ser
devido à maior diversidade microbiológica neste primeiro ambiente, possibilitando a
conversão de uma maior quantidade de nitrogênio orgânico em mineral, já que esta
função é realizada por uma grande gama de microrganismos. A amonificação no solo, e
especialmente neste tipo de ambiente onde há maior disponibilização de matéria morta é
de extrema importância para a ciclagem do nitrogênio entre a atmosfera e o solo, e
evitar seu acúmulo no solo.
A mineralização do nitrogênio é dependente de fatores ambientais como a
temperatura, umidade, aeração e, principalmente da composição química dos restos

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culturais, especialmente da relação C/N, teores de lignina, celulose, hemicelulose e
polifenóis. Assim, este processo é influenciado pelos fatores que controlam o
crescimento e atividade dos microrganismos, especialmente a qualidade e quantidade de
resíduos culturais no solo.
Além de ser utilizado pelas plantas, o NH4+ pode seguir por outras vias, até ser
oxidado a NO3- (nitrato) pelo processo de nitrificação, onde microrganismos
quimiolitotróficos utilizam o NH4+ como fonte de energia, pode também ficar preso à
CTC do solo, aderido a argila (disponível) ou volatilizar dependendo das condições
ambientais. O nitrato produzido pelo uso do amônio pode ser lixiviado, utilizado pelas
plantas, ou, em condições de anaerobiose, ser utilizado por microrganismos específicos
que o utilizam como receptor final de elétrons na cadeia respiratória anaeróbia, sendo
transformado em nitrogênio gasoso novamente ou óxido nitroso, um gás potencialmente
causador do efeito estufa.
Assim, o passo da amonificação é de extrema importância para que o ciclo do
nitrogênio ocorra, permitindo que este elemento volte à atmosfera e seja novamente
fixado por meio do processo de fixação biológica no nitrogênio, ou outros processos de
fixação menos frequentes. Áreas nativas, por apresentarem maior diversidade de
substratos passíveis de decomposição que contém nitrogênio orgânico, assim como uma
maior diversidade de microrganismos, possibilitam o desenvolvimento de um maior
número de amonificadores, em comparação com as condições de agricultura, onde há
uma menor quantidade de substrato para decomposição microbiana, o que pode ter
influenciado a presença de uma menor quantidade de microrganismos amonificadores
neste tipo de solo.

Conclusão

O maior número de microrganismos amonificadores em solo nativo pode ser


devido à maior disponibilidade de substratos passíveis de decomposição contendo
nitrogênio neste ambiente, o que induz o desenvolvimento desta classe de organismos.
Além disso, é conhecida a característica da maior diversidade de microrganismos em
solos nativos, e uma vez que muitas classes de microrganismos são capazes de realizar a
amonificação, espera-se que seja encontrado um número mais elevado de
amonificadores em solos nativos que agrícolas.

Referências

5
Cardoso, E. J. B. N.; Tsai, S. M.; Neves, M. C. P. 1992. Microbiologia do Solo.
Sociedade Brasileira de Ciência do Solo. Campinas. 360 p.

Moreira, F. M. de S.; Siqueira, J. O. 2006. Microbiologia e Bioquímica do Solo. 2ª ed.


Editora UFLA, Lavras. 729 p.

Woomer, P. L. Most probable number counts. In: WEAVER et al.. Methods of soil
analysis. Soil Science Society of America Journal, U.S.A – SSSA book series, n.5, p.59
– 79. 1994.

Sarathchandra, U. Nitrification activities and the changes in the populations of nitrifying


bacteria in soil perfused at two different H-ion concentrations. Plant and Soil, The
Hague, v.50, n.1, p.99-111, July 1978.