Вы находитесь на странице: 1из 129

ПРАВИТЕЛЬСТВО РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение


высшего профессионального образования
Национальный исследовательский университет
«Высшая школа экономики»
Московский институт электроники и математики

Факультет Прикладной математики и кибернетики


Кафедра Прикладной математики

Дипломная работа
по специальности 230401.65 «Прикладная математика»

Исследование проблемы моделирования феномена


самосборки и разработка требований к
инструментальным средствам моделирования

Студент группы М 94 Подобин А.А.

Руководитель доцент, к.т.н.


Махиборода А.В.

Консультант доцент, к.т.н.


Махиборода А.В.

Зав. кафедрой профессор, д.т.н.


Карасев М.В.

Москва 2014
СОДЕРЖАНИЕ

1 ВВЕДЕНИЕ 4
2 ОСНОВНЫЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ПОНЯТИЯ 5
2.1 ТРЕБОВАНИЯ К МОДЕЛИ 5
2.2 АРХИТЕКТУРА САМООПРЕДЕЛЯЕМЫХ ДАННЫХ 6

3 ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О ВИРУСАХ 9

4 ВИРУС ТАБАЧНОЙ МОЗАИКИ 11


4.1 МЕХАНИЗМЫ СБОРКИ 13

5 ВИРУС БАКТКРИОФАГ Т4 20
5.1 МЕХАНИЗМЫ СБОРКИ 20
5.2 БАЗАЛЬНАЯ ПЛАСТИНКА (БП) 23
5.2 МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ БАКТЕРИОФАГОВ 28
6 СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ОБРАЗЦОВ ВИРУСА 30
6.1 ФУРЬЕ-ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ 30

6.2 ДВУМЕРНАЯ РЕКОНСТРУКЦИЯ: ЦИФРОВАЯ 31


КОМПЬЮ-ТЕРНАЯ ОБРАБОТКА

6.3 ТРЕХМЕРНАЯ РЕКОНСТРУКЦИЯ ИЗОБРАЖЕНИЯ 32

6.4 ФАЗОВОКОНТРАСТНАЯ МИКРОСКОПИЯ 32

7 СФЕРИЧЕСКИЕ ВИРУСЫ 33

7.1 МОДЕЛЬ САМОСБОРКИ ПРОСТЕЙШИХ 35


СФЕРИЧЕСКИХ ВИРУСОВ
7.2 КЛАССИФИКАЦИЯ МОДЕЛЕЙ 39
7.3 ПРЕДПОЛАГАЕМЫЙ СЦЕНАРИЙ САМОСБОРКИ 39
СФЕЕРИ-ЧЕСКИХ ВИРУСОВ.
7.4 ТЕОРИЯ СБОРКИ, ОСНОВАННАЯ НА ЛОКАЛЬНЫХ 41
ПРАВИЛАХ
7.5 ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОСТРАНСТВА ПАРАМЕТРОВ 45
ПРИ СА-МОСБОРКЕ
7.6 СИМУЛЯТОР 51
7.7 МОДЕЛЬ ДИСКРЕТНЫХ СОБЫТИЙ 52
7.8 МОДЕЛЬ БЕЛКА 53
7.10 ТЕХНИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ 54
7.11 ДИНАМИЧЕСКИЕ ТРАЕКТОРИИ СБОРКИ 56
ВИРУСНОГО КАПСИДА
7.12 МОДЕЛЬ 57
7.13 ПАРНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ 62
7.14 СВЯЗЬ МОДЕЛИРУЕМЫХ КАПСИДОВ С 63
РЕАЛЬНЫМИ
7.15 ДИНАМИЧЕСКИЕ СИМУЛЯЦИИ 64
7.16 ТЕРМОДИНАМИКА СБОРКИ КАПСИДА 66
7.17 КИНЕТИКА СБОРКИ КАПСИДА 69
7.18 КИНЕТИЧЕСКИЕ ЛОВУШКИ 73
7.19 ПРИЛОЖЕНИЕ 81
7.20 АНАЛИЗ КИНЕТИКИ СБОРКИ ВИРУСНЫХ 83
КАПСИДОВ, ОС-НОВАННЫЙ НА
МОДЕЛИРОВАНИИ
7.21 МЕТОДЫ 85
7.22 МОДЕЛИРОВАНИЕ КИНЕТИКИ СБОРКИ 88
7.23 ОБЗОР КИНЕТИКИ СБОРКИ 90
7.24 НУКЛЕАЦИЯ И ЛИНИЯ СБОРКИ В УСТОЙЧИВОМ 92
СОСТОЯНИИ
7.25 ЯВНАЯ K D И ПСЕВДОКРИТИЧЕСКАЯ 95
КОНЦЕНТРАЦИЯ
7.26 РАЗМЕР ЯДРА МОЖЕТ БЫТЬ ОПРЕДЕЛЕН ИЗ 99
ЗАВИСИМО-СТИ КОНЦЕНТРАЦИИ ОТ ВЕЛИЧИНЫ
СБОРКИ
7.27 МАТЕМАТИЧЕСКИЕ ПОДРОБНОСТИ 103
7.28 МАСШТАБИРОВАНИЕ КИНЕТИКИ СБОРКИ 105
7.29 ИЗОЛЯЦИЯ СКОРОСТИ НУКЛЕАЦИИ 106
7.30 ОЦЕНКА РАЗМЕРА ЯДРА 108
7.31 МОДЕЛИРОВАНИЕ КИНЕТИКИ СБОРКИ, 110
ОСНОВАННОЕ НА ЛОКАЛЬНЫХ ПРАВИЛАХ
8 ЦИТОСКЕЛЕТ 118

9 ВЫВОД 120

10 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 121


ВВЕДЕНИЕ
Одна из важнейших задач нанотехнологии - задача освоения самосборки
и саморазборки молекулярных структур. Без понимания механизма
самосборки невозможно получение уникальных материалов и построения
сверхминиатюрных платформ, например, в микромеханике.
Логика самосборки относится к числу малоисследованных явлений
природы. Средством управления процессом самосборки могут выступать
потоковые формальные системы. К моделям самосборки предъявляются
требования отсутствия центрального управляющего звена и распределения
механизма детерминации процесса между всеми его участниками.
Само явление самосборки и самоорганизации является
распространенным, и имеются его многочисленные экспериментальные
подтверждения. Одними из самых впечатляющих и сложных являются
примеры самосборки биологических вирусов и цитоскелета.
Вирусная частица состоит из ДНК или РНК и белковой оболочки,
называемой капсидом. Зрелая вирусная частица может формироваться из
тысяч белков с участием белков-катализаторов и белков, участвующих
только в промежуточных стадиях сборки. При этом белки могут вначале
собираться в субъединицы, затем из субъединиц формируются отдельные
крупные компоненты вирусной частицы, из которых собирается итоговая
структура.
Освоение механизма самосборки вирусов может быть использовано на
практике. Например, известны вирусы, имеющие форму трубки. Существует
способ полностью или частично покрыть их поверхность металлом
(платиной). Металлизированные нанотрубки могут быть использованы в
электронике, а металлизированный вирус табачной мозаики, несущий в себе
искусственно созданную лечебную РНК, может быть доставлен непременно в
очаг заболевания, тем самым избегая интоксикации всего организма. Знание

4
механизма самосборки позволило бы варьировать длину трубок и другие
параметры.
Вместе с тем, большинство существующих моделей описывают физико-
химическую природу отдельных взаимодействий, и являются очень
специализированными. Из более общих моделей следует отметить
логические модели на основе теории клеточных автоматов и фрактальные
модели.
Алгоритмика самосборки — набор инструкций, описывающих
порядок действий исполнителя для достижения результата решения задачи за
конечное число действий, однако под исполнителем стоит понимать не
демона-сборщика, а сам объект сборки, в практически неизменном виде это
компоненты (элементы) исходной структуры, аддитивно составляющие или
«собирающие», как части целого, результирующую сложную структуру.
Самосборка относится к типичным методам получения наноструктур
(наноматериалов) «снизу-вверх». Основная задача, которая стоит при ее
реализации — это необходимость таким образом повлиять на параметры
системы и так задать свойства отдельных частиц, чтобы они
организовывались с образованием желаемой структуры. Самосборка
находится в основе многих процессов супрамолекулярной химии, где
«инструкции», как собирать большие объекты, «закодированы» в
структурных особенностях отдельных молекул.

ОСНОВНЫЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ПОНЯТИЯ


ТРЕБОВАНИЯ К МОДЕЛИ
Одним из требований, предъявляемых к данной модели, является
отсутствие «демона-сборщика», способного производить сборку на
молекулярном уровне, по некоторому заранее записанному сценарию. Так в
основном функционируют существующие программно-управляемые модели.
В нашем случае итоговые структуры должны формироваться в результате
выполнения локальных актов взаимодействия простейших элементов,

4
составляющих основу выращиваемой структуры. Управляющее центральное
звено должно отсутствовать, а механизмы детерминации процесса должны
быть распределены по всем участникам процесса.
Фон Нейман в работе «Теория самовоспроизводящихся автоматов»
предложил при исследовании феномена самосборки разделить два аспекта –
логический и кинематический. Это позволяет на начальном этапе
исследования абстрагироваться от сложностей физико-химической природы
исследуемых объектов и сосредоточиться только на логике взаимодействия
неких условных компонентов процесса. И только после достижения
понимания логических взаимосвязей можно продвигаться к их физической
интерпретации. Мы принимаем этот метод и ограничиваемся на данном
этапе исследованием логики самосборки.

АРХИТЕКТУРА САМООПРЕДЕЛЯЕМЫХ ДАННЫХ


Концепция самоопределяемых данных выступает в качестве ключевого
принципа построения архитектуры вычислительных средств с
рекуррентными внутренними языками. Суть концепции заключается в том,
что существует только один поток – поток данных, сопровождаемых
некоторыми функциональными полями. Элементарной лексической
единицей вычислительной системы выступает операнд, состоящий из
нескольких полей. Непосредственная запись операнда сопровождается полем
управления селекцией пар операндов, полем кода операции и полем
управления транспортом.
Операнд является самодвижущейся, активной компонентой
вычислительного процесса. Кодовые состояния полей операнда
обусловливают его поведение. Направления перемещения операндов
определяются кодами управления транспортом. Выбор пар операндов для
выполнения бинарных операций над ними управляется кодами селекции.
Арифметические и логические операции закодированы в поле кода операции.

4
Рассмотрим функциональную схему операционного устройства. Схема
состоит из набора однотипных арифметико-логических устройств АЛУ,
набора запоминающих элементов и ортогонального поля селекции,
объединяющего все компоненты схемы. Операнды могут быть записаны в
запоминающие устройства двух типов - горизонтальный ряд магазинных
запоминающих устройств (МЗУ) и вертикальный ряд ассоциативных
запоминающих устройств (АЗУ). Операнды, расположенные в голове
магазинных ЗУ по вертикальным шинам непосредственно подаются на
первые входы АЛУ и одновременно через логические узлы поля селекции
подбирают партнёров для выполнения бинарных операций. Для этого коды
полей селекции с вертикальных шин через логические узлы подаются в АЗУ
по горизонтальным шинам и исполняют роль опросных ключей. Выбор пар
операндов осуществляется при совпадении кодов полей селекции. Отклик
найденного в АЗУ операнда означает его выборку на горизонтальную шину.
Затем логический узел селектора коммутирует горизонтальную и
вертикальную шины, и найденный операнд подаётся на второй вход АЛУ.
Все АЛУ состоят из двух секций – в одной секции выполняются
бинарные операции над операндами, вторая секция служит для
преобразования функциональных полей. Текущий шаг обработки
определяется наличием операндов и значениями кодов их функциональных
полей. По кодам селекции отбираются пары операндов на входах АЛУ, по
кодам операции настраиваются секции АЛУ, предназначенные для
выполнения бинарных операций. В результате выполнения шага обработки
на выходах АЛУ возникает новое поколение операндов с новыми
состояниями функциональных полей, которые предопределяют следующий
шаг обработки. На выходах АЛУ стоят коммутаторы, которые обрабатывают
коды полей управления транспортом. Коммутатор может направить операнд
на выход из операционного устройства, на вход ассоциативного ЗУ или на
вход магазинного ЗУ.

4
На входах МЗУ вновь декодируется поле управления транспортом, на
основе чего принимается решение о записи операнда в хвост или в голову.
При программировании процессов необходимо следить за тем, что бы
операнды с совпадающими кодами полей селекции не попадали в один тип
ЗУ. Операнды с совпадающими кодами селекции отберутся в пары только
при условии, что они расположены в разных типах ЗУ. Работа магазинных
ЗУ организуется таким образом, что операнд, находящийся в голове и не
нашедший партнёра перемещается в хвост. Ротация операндов в МЗУ
предотвращает зависание процесса, а возможность записи в хвост или в
голову может способствовать ускорению вычислений.
Рассмотрим предварительно, в самых общих чертах поведение
рекуррентной кодовой последовательности. Например, возьмем только один
тег - поле управления селекцией. Все теговые поля преобразуются
независимо своими функциональными преобразователями, и поведение
каждого преобразователя может быть рассмотрено независимо от других.
Значение тега заносится во входной регистр, над которым задан
функциональный дискретный преобразователь F2. Результат преобразования
фиксируется в выходном регистре. В целом такая конструкция
характеризуется конечным множеством кодовых состояний N и
отображением N  N, заданным целочисленной, всюду определенной
функцией F2. При этом размерность N равна 2k, где k разрядность тега. Если
мы рассматриваем теги малой разрядности, отображение N  N удобно
изобразить в виде ориентированного графа кодовых переходов G. Граф G
строится таким образом, что его вершинами являются кодовые состояния
тега Tj, а дуги определены как пары T1  T2, где T2 = F(T1). При многократной
подаче результатов преобразования на вход преобразователя, динамика
развития рекуррентных кодовых последовательностей представляет собой
пути на ориентированном графе G.
В описанной ситуации существует определённое разнообразие структур
графов кодовых переходов, ограниченное свойствами отображения N  N.

4
Коды тегов Tj могут иметь только однократное вхождение в граф, а также
каждая вершина графа всегда имеет одну и только одну исходящую дугу.
Бинарное дерево полностью соответствует перечисленным ограничениям и
может быть графом кодовых переходов для функционального дискретного
преобразователя на базе некой функции F.
Самоопределяемые данные функционируют как динамическая система,
в которой текущее состояние данных и их функциональных полей оп-
ределяет шаг обработки. В результате выполнения шага обработки появ-
ляется новое поколение данных с новыми значениями функциональных
полей, которые предопределяют следующий шаг обработки. В системе
развиваются два взаимодействующих процесса преобразования данных и
преобразования их функциональных полей. Текущее состояние
функциональных полей определяется не заранее зафиксированной после-
довательностью инструкций, а порождается на каждом шаге обработки как
функция от предыдущего состояния.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О ВИРУСАХ


Вирус - микроскопическая частица, способная инфицировать клетки
живых организмов. Вирусы являются облигатными паразитами — они не
способны размножаться вне клетки. В настоящее время известны вирусы,
размножающиеся в клетках растений, животных, грибов и бактерий
(последних обычно называют бактериофагами). Вирусы представляют собой
молекулы нуклеиновых кислот (ДНК или РНК), заключённые в защитную
белковую оболочку (капсид). Вирусы содержат только один тип нуклеиновой
кислоты: либо ДНК, либо РНК.
Вирусные частицы (вирионы) представляют собой белковую капсулу -
капсид, содержащую геном вируса, представленный одной или несколькими
молекулами ДНК или РНК. Капсид построен из капсомеров - белковых
комплексов. Нуклеиновая кислота в комплексе с белками обозначается
термином нуклеокапсид. Некоторые вирусы имеют также внешнюю

4
липидную оболочку. Размеры различных вирусов колеблются от 20
(пикорнавирусы) до 500 (мимивирусы) и более нанометров. Вирионы часто
имеют правильную геометрическую форму (икосаэдр, цилиндр). Такая
структура капсида предусматривает идентичность связей между
составляющими её белками, и, следовательно, может быть построена из
стандартных белков одного или нескольких видов, что позволяет вирусу
экономить место в геноме.
Условно процесс вирусного инфицирования в масштабах одной клетки
можно разбить на несколько взаимоперекрывающихся этапов:
Присоединение к клеточной мембране - так называемая адсорбция.
Обычно для того, чтобы вирион адсорбировался на поверхности клетки, она
должна иметь в составе своей плазматической мембраны белок - рецептор,
специфичный для данного вируса. Наличие рецептора нередко определяет
круг хозяев данного вируса, а также его тканеспецифичность.
Проникновение в клетку. На следующем этапе вирусу необходимо
доставить внутрь клетки свою генетическую информацию. Некоторые
вирусы привносят также собственные белки, необходимые для её
реализации. Различные вирусы для проникновения в клетку используют
разные стратегии. Вирусы также различаются по локализации их
репликации, часть вирусов (например, те же пикорнавирусы) размножается в
цитоплазме клетки, а часть - в её ядре.
Перепрограммирование клетки. При заражении вирусом в клетке
активируются специальные механизмы противовирусной защиты.
Заражённые клетки начинают синтезировать сигнальные молекулы -
интерфероны, переводящие окружающие здоровые клетки в
противовирусное состояние и активирующие системы иммунитета.
Повреждения, вызываемые размножением вируса в клетке, могут быть
обнаружены системами внутреннего клеточного контроля, и такая клетка
должна будет «покончить жизнь самоубийством» в ходе процесса,
называемого апоптозом или программируемой клеточной смерти. От

4
способности вируса преодолевать системы противовирусной защиты
напрямую зависит его выживание. Кроме подавления противовирусной
защиты, вирусы стремятся создать в клетке максимально благоприятные
условия для развития своего потомства.
Персистенция. Некоторые вирусы могут переходить в латентное
состояние, слабо вмешиваясь в процессы, происходящие в клетке, и
активироваться лишь при определённых условиях. Так построена, например,
стратегия размножения некоторых бактериофагов - до тех пор, пока
заражённая клетка находится в благоприятной среде, фаг не убивает её,
наследуется дочерними клетками и нередко интегрируется в клеточный
геном. Однако при попадании заражённой лизогенным фагом бактерии в
неблагоприятную среду, возбудитель захватывает контроль над клеточными
процессами так, что клетка начинает производить материалы, из которых
строятся новые фаги. Клетка превращается в фабрику, способную
производить многие тысячи фагов. Зрелые частицы, выходя из клетки,
разрывают клеточную мембрану, тем самым убивая клетку.
Создание новых вирусных компонентов. Размножение вирусов в самом
общем случае предусматривает три процесса.
1) транскрипция вирусного генома - то есть синтез вирусной мРНК,
2) её трансляция, то есть синтез вирусных белков,
3) репликация вирусного генома.
У многих вирусов существуют системы контроля, обеспечивающие
оптимальное расходование биоматериалов клетки-хозяина. Например, когда
вирусной мРНК накоплено достаточно, транскрипция вирусного генома
подавляется, а репликация напротив - активируется.
Созревание вирионов и выход из клетки. В конце концов,
синтезированные геномные РНК или ДНК одеваются соответствующими
белками и выходят из клетки. Следует сказать, что активно размножающийся
вирус не всегда убивает клетку-хозяина. В некоторых случаях дочерние
вирусы отпочковываются от плазматической мембраны, не вызывая её

4
разрыва. Таким образом, клетка может продолжать жить и продуцировать
вирус.
В данной работе предлагаются логические модели самосборки капсидов
некоторых вирусных частиц на основе потоковых формальных систем.

ВИРУС ТАБАЧНОЙ МОЗАИКИ


Вирус табачной мозаики (ВТМ) – РНК вирус, инфицирующий растения,
особенно табак и других представителей семейства пасленовых. Заражение
определяется характерными рисунками (пятнами и выцветанием) на листьях.
По этой причине вирус и получил свое название. ВТМ является первым
обнаруженным вирусом.
Вирус табачной мозаики имеют спиральную палочковидную форму. Его
капсид состоит из 2130 молекул белка-оболочки и одной молекулы генома –
РНК с 6390 основаниями. Капсид состоит только из одного типа белковых
субъединиц. Белок оболочки самособирается в палочковидную спиральную
структуру (один оборот спирали содержит 16,3 молекулы белка), вокруг
РНК, которая формирует «шпильку» в центре белковой спирали. Мономер
белка состоит из 158 аминокислот. Вирионы имеют длину около 300 нм и
диаметр около 18 нм. Электронные микрофотографии показывают
различимый внутренний канал диаметром около 4 нм. РНК закручена с
радиусом около 6 нм и защищена от воздействия клеточных ферментов
белком оболочки. На три нуклеотида РНК приходится один белковый
мономер. Размер нуклеиновой кислоты определяет размер капсида.
У растений вирус табачной мозаики вызывает серьезные потери урожая.
Известно, что вирус поражает девять семейств растений и, по меньшей мере,
125 отдельных видов, включая табак, томаты, перцы, огурцы и многие
декоративные растения. Существует большое количество штаммов ВТМ.

4
Рис. 1. Вирус табачной мозаики. Микрофотография.

300 нм

18 нм 4 нм РНК
Капсид

Белок капсида

Рис. 2. Вирус табачной мозаики. Строение.

Значительное количество специальной литературы по ВТМ, его выбор


для многих новаторских исследований в молекулярной биологии, дифракции
рентгеновских лучей, вирусной сборки и разборки, и т. д., по существу

4
обязаны возможности получения большого количества вирусных частиц, и
тому факту, что вирус не поражает животных. Вырастив несколько
зараженных растений табака в оранжерее и проделав лабораторные
процедуры, исследователь может легко получить несколько граммов вируса.
В результате, ВТМ часто рассматривается практически как органический
химический продукт, а не инфекционный агент.

МЕХАНИЗМЫ СБОРКИ
Первые предположения о сборке ВТМ изображены в рис.3
Наглядно показано, что белки насаживаются на РНК. Считалось, что
самосборка вируса обеспечивается, информацией, содержащейся в
первичной структуре молекулы РНК.
И поэтому задним числом не кажется слишком
удивительным результат классических экспериментов
Френкеля-Конрата и Вильямса, которые в 1955 г. [1]
продемонстрировали, что ВТМ может быть повторно
собран из его выделенных белковых и нуклеиновых
компонентов.
Они показали, что после простого их смешивания
образовались инфекционные вирусные частицы,
которые структурно неотличимы от первоначальных
вирусов. Следовательно, вся информация,
необходимая для сборки частицы, должна
содержаться в ее компонентах, т. е. вирусу присуща
«самосборка».
Рис. 3. Предположение о сборке ВТМ.

Более поздние эксперименты [2] показали, что повторная сборка весьма


специфична для вириальной РНК; при этом она проходит наиболее легко,
когда РНК гомологична оболочечному белку.

4
Все это было весьма неплохо, но существовало несколько фактов,
которые давали повод для сомнений. Во-первых, в других экспериментах [3]
было показано, что чужеродная РНК "может включаться в вирусно-подобные
палочки, и это сильно ослабляло уверенность в том, что in vivo
специфичность на самом деле достигалась во время сборки вируса. Другим
фактом, относящимся к повторной сборке, который указывал на то, что в
построенной схеме остались невыявленные элементы, была чересчур низкая
скорость сборки. Необходимо было ждать от 8 до 24 часов, чтобы получить
максимальный выход собранных частиц. Это представлялось довольно
медленным для сборки вируса in vivo, так как только после ее завершения
нуклеиновая кислота была полностью защищена.

Допустим белки собираются в пары и происходит рост капсида в одну


сторону.

Рассмотрим данную схему без


присутствии РНК. (Рис. 4.)

Рис. 4. Рост ВТМ без РНК


4
Стоит отметить, что и в опытах порой попадались не только «шайбы» -
капсиды, но и 2-х этажные белки. (Рис. 4.)
Но данная схема никак не объясняет, что заставляет капсиды сдвигаться
в «спираль» - столько компактную форму. Определенно это заслуга РНК.
При низких или кислотных рН, белок сам по себе образует спирали
произвольной длины, которые по своей структуре весьма напоминают вирус
за тем исключением, что в них отсутствует РНК. При рН выше нейтральной
белок в основном существует в виде смеси малых агрегатов, начиная с
тримеров и крупнее, которые находятся в быстром равновесии друг с другом;
его обычно называют А-белком. Около рН = 7 и примерно при комнатной
температуре доминирующей формой является диск, который находится в
относительно медленном равновесии с А-формой в отношении 4:1. Таким
образом, основным фактором, контролирующим состояние агрегации
оболоченного белка, является рН. Регуляция опосредована группами
(вероятно, как показал Каспар [4], карбоксильными кислотными остатками),
которые аномально связывают протоны в спиральном состоянии, но не в А-
форме. Следовательно, спиральная структура может быть стабилизирована
либо, в случае вируса, взаимодействием РНК с белком, либо, в случае
свободного белка, протонированием кислотных групп. Таким образом, эти
группы вы ступают в роли «отрицательного ключа», гарантирующего, что
при физиологических условиях спираль не образуется, и поэтому есть
достаточно белка в виде дисков, или А-белка, для взаимодействия с РНК во
время сборки вирусной частицы.

4
Рис. 5. Диаграмма, на которой указаны области, в которых
определенные формы белка ВТМ играют существенную роль в установлении
равновесия [5].

Следовательно, дисковый агрегат белка имеет ряд важных свойств. Он


не только имеет непосредственное отношение к спиральной структуре
вируса, но также является доминирующей формой белка при
«физиологических» условиях; более того, дисковые формы были найдены и
для других спиральных вирусов.

Рис. 6. Первоначальное представление о роли диска: специфическое


узнавание особой (терминальной) последовательности ВТМ — РНК
вызывает переход диска в два витка спирали.

4
Субъединицы верхнего кольца диска лежат в плоскости,
перпендикулярной к его оси, в то время как те, что расположены в нижнем
кольце, повернуты вниз к центру, так что два кольца касаются только по
внешней поверхности диска. Поблизости от центрального отверстия они,
следовательно, широко расходятся, как пара открытых челюстей, которые
могли бы «прикусить» отрезок РНК, проходящий через центральное
отверстие. Более того, прохождение через центр было бы облегчено тем, что
внутренний участок белка, начиная от места связывания с РНК, как
оказалось, не упорядочен и не упакован в регулярную структуру.
Таким образом, имеет место быть мнению, что диск был устроен так,
чтобы РНК могла проходить через центральное отверстие, эффективно
увеличенное благодаря подвижности внутренней петли белка, и
расположиться между двумя слоями диска. Понятно, что участком РНК,
который окажется внутри диска, будет с необходимостью
последовательность зарождения, расположенная довольно далеко от обоих
концов молекулы РНК. Однако это может быть только в том случае, если
РНК сложится вдвое в точке, находящейся в окрестности места зарождения
сборки, и войдет в диск в виде петли шпильки. И на самом деле,
последовательность оснований минимального фрагмента, защищенного при
зарождении, такова, что он может складываться, образуя слабо спаренную
двойную спираль с петлей наверху, т. е. шпильку. Это предположение
выдвинул Зиммерн [6].
Она образует слабо связанную двойную спираль с петлей на верху,
вероятно являющейся подлинным началом сборки. Последовательность в
петле и в ее окрестности содержит мотив из трех оснований, у которых G
находится в среднем положении, а А или U в двух других.

Рис. 7. Предполагаемая вторичная структура


РНК в области зарождения [6].

4
Итак, гипотеза зарождение заключается в следующем: специальная
шпилька РНК проникает через центральное отверстие диска в пространстве
между челюстями, образованными двумя слоями белковых субъединиц. Все
размеры хорошо для этого подходят. В результате открытая петля РНК
может связаться с соответствующими местами на белке. По мере связывания
РНК между челюстями белкового диска все большая часть довольно
нестабильной двойной спирали будет плавиться и открываться. Некоторый,
пока неизвестный, фактор этого взаимодействия, видимо, вызывает переход
диска в короткий спиральный сегмент, включающий РНК, который после
быстрого добавления к нему еще нескольких дисков [7] образует первую
устойчивую нуклеопротеидную частицу.
Последующие после зарождения события можно назвать ростом. Рост
может происходить, по существу, по тому же механизму, что и зарождение,
только теперь нет необходимости в петле РНК со специфической
последовательностью, а все происходит благодаря «путешествующей петле»,
которая может проникать в очередной подошедший диск. В этом механизме
легко преодолевается основная проблема, связанная с тем, что трудно
представить, как может взаимодействовать целый диск из белковых
субъединиц с РНК в растущей спирали.

4
Рис. 8. Зарождение сборки вируса происходит благодаря
проникновению шпильки РНК (см. рис. 7) в центральное отверстие
белкового диска между двумя слоями субъединиц.

Петля на верху шпильки связывается с диском, образуя часть витка, при


этом двойная спираль разделяется, что обусловливает переход диска в
короткую спираль. Затем, вероятно, «челюсти смыкаются», заключая РНК
между витками из белковых субъединиц, и начинается рост
нуклеопротеидной спирали (которая может тогда быстро удлиняться до
некоторого минимального стабильного размера).
При заражении растений табака вирусом табачной мозаики внутрь
клеток проникает только РНК вируса, освобожденная от белковой оболочки.
Вслед за этим в ядре клетки начинается синтез новой вирусной РНК. Под
контролем этой вновь синтезированной РНК происходит синтез вирусного
белка в цитоплазме. В результате соединения вновь синтезированной РНК с
белком образуется новая полная вирусная частица. В нормальных условиях

4
из 106 вирусных частиц только одна способна вызывать инфекцию, но из
этой одной частицы за сутки образуется примерно 105 новых [16].

ВИРУС БАКТКРИОФАГ Т4
Рассмотрим хорошо изученный сценарий сборки вируса бактериофага
Т4, описанный во всех учебниках и являющийся классическим объектом
изучения самосборки. Имеет геномную ДНК порядка 169—170 тысяч пар
нуклеотидов, упакованную в икосаэдрическую головку. Вирион также имеет
ствол, основание ствола и стволовые отростки — шесть длинных и шесть
коротких. Бактериофаг T4 использует ДНК-полимеразу кольцевого типа; его
скользящая манжетка является тримером, сходным с PCNA, но она не имеет
гомологии ни с PCNA, ни с полимеразой β.T4 является относительно
крупным фагом, имеет диаметр около 90 нм и длину около 200 нм. Фаг T4
использует только литический цикл развития, но не лизогенный. В сборке
участвуют 54 типа белков, которые строго в определённой
последовательности агрегируются в субагрегаты различных уровней и далее
субагрегаты собираются в завершённую вирусную частицу, включающую
более тысячи белковых молекул.

МЕХАНИЗМЫ СБОРКИ
Работы Вильяма Вуда и Роберта Эдгара (William Wood, Robert Edgar),
посвященные мутантам фага Т4, дефектным по способности к сборке,
позволили установить следующее:

1. Существует три основных пути превращений, которые приводят к


образованию вируса. В результате этих превращений независимо
формируются головка, отросток и нити отростка. Если блокировать
образование одного из перечисленных компонентов, это не повлияет на
синтез двух других.

4
2. Каждая из этих последовательностей превращений идет в строго
определенном порядке. Все белки капсида синтезируются одновременно во
второй половине цикла заражения. Таким образом, строгой
последовательности сборки головки, отростка и нитей отростка
способствуют структурные особенности самих промежуточных продуктов.
Ни один из этих процессов ассоциации не может идти с заметной скоростью,
пока не закончится предыдущий. Возможно, часть энергии связывания на
каждом этапе используется для снижения энергии активации следующего
процесса ассоциации и таким образом увеличивает его скорость.
3. Головка и отросток должны быть полностью собраны, прежде чем они
соединяются друг с другом. Затем готовые нити отростка присоединяются к
базальной пластинке. И в этом случае строгая последовательность событий
обеспечивает выход только готовых вирусных частиц.
Образование вирионов фага Т4 идет не только путем самосборки.
Важную роль на некоторых этапах этого процесса играют вспомогательные
(морфопоэтические) белки и протеазы. Например, для образования
центральной «втулки» базальной пластинки отростка нужны три белка,
которые не входят в состав собранного отростка. Эти вспомогательные белки
служат временными шаблонами для ассоциации компонентов «втулки».
Протеазы играют важную роль в сборке головки. Основной белок головки с
массой 45 кДа, который называется gp23* (gp - от англ. gene product -
продукт гена), образуется из предшественника gp23 с массой 55 кДа.
Расщепление происходит в тот момент, когда головка частично собрана; это
свидетельствует о том, что оно запускает механизм втягивания ДНК в
головку. Известны еще три белка головки, которые расщепляются в процессе
сборки. Таким образом, фаг Т4 образуется путем самосборки и сборки с
участием вспомогательных (морфопоэтических) белков и ферментов [17].

4
Рис. 9. Предполагаемый сценарий сборки бактериофага Т4.

1. Базальная пластинка (БП) строится из 15 белков, а также из нескольких


молекул ферментов и фолиевой кислоты.
2. БП служит затравкой к сборке стрежня хвоста вируса, вокруг которого
строится спиральный чехол (продукт гена 18).
3. Головке бактериофага предшествует проголовка (прокапсид, ДНК-
несодержащий предшественник). Она «вырастает» на инициирующем
белковом комплексе (портальный белок, коннектор) — додекамере из 12
субъединиц, кодируемых геном 20. Этот комплекс прикреплен к внутренней

4
поверхности цитоплазматической мембраны клетки-хозяина посредством
мембранного каркасного белка, и на нем вырастает белковое ядро, служащее
«строительными лесами» для прокапсида II. Далее вокруг этой белковой
сердцевины группируются пентоны и гексоны из белков gp24 и gp23 (от
англ. gene product — продукт гена), сердцевина разрушается, белки gp24 и
gp23 модифицируются до gp24* и gp23*, капсид увеличивается и прокапсид
II отрывается от мембраны вместе с коннектором.
4. Через портальное отверстие белки gp16 и gp17 при участии коннектора
и энергетических молекул АТФ упаковывают ДНК в прокапсид. ДНК
обрезается в нужном месте, и этот «ящик Пандоры» для бактерий
закупоривается пробкой из продуктов генов 13 и 14.
5. Головка бактериофага (точнее gp23*) «инкрустируется» сеткой белков
HOC и SOC.
6. Каждая хвостовая нить соединяется из двух половинок — дистальной
(удалена от вириона и длиннее) и проксимальной (ближе к вириону и
покороче).
7. Голова и хвост вируса самопроизвольно соединяются.
8. Хвостовые и воротничковые фибриллы крепятся на свои места (причем
хвостовые удерживаются воротничковыми как и положено).

БАЗАЛЬНАЯ ПЛАСТИНКА (БП)


Молекулы ДНК находятся in vivo в плотно упакованном,
конденсированном состоянии. В таком виде генетическая информация
хранится вируса. В то же время, для взаимодействия с регуляторными
белками, ДНК должна перейти в менее конденсированное состояние.
Конденсация и деконденсация ДНК регулируют активность гена и
клетки в целом. Молекула ДНК характеризуется высокой линейной
плотностью отрицательного заряда, поскольку каждая пара оснований несет
на себе две полностью депротонированные фосфатные группы. Среднее
расстояние между проекциями фосфатных групп на ось двойной спирали
4
составляет 1.7 нм. Возникающее электростатическое отталкивание
обуславливает большую жесткость ДНК в растворе, которая при при
физиологической ионной силе образует рыхлый клубок большого объема. В
то же время, in vivo молекула ДНК локализована внутри объема, который в
тысячи раз меньше.
Длина ДНК – 54 мкм
Диаметр упаковки - 0.1 мкм
Диаметр капсулы бактериофага Т4 почти в тысячу раз меньше длины
вытянутой молекулы ДНК. Упаковка ДНК внутри капсулы вируса настолько
плотная, что транскрипция с нее в таком состоянии невозможна [18].
При мягком лизисе фагов образуются тороидальные частицы, состоящие
из большого числа витков ДНК [19]. При помощи криоэлектронной
микроскопии интактных фагов можно увидеть локально упорядоченные,
уложенные параллельно, сегменты ДНК [20]. Было предложено несколько
моделей упаковки ДНК внутри фага:

1) ДНК намотана в виде клубка,


2) ДНК уложена параллельно при помощи
резких изломов, или
3) ДНК сложена в деформированный
тороид, который полностью заполняет все
предоставленное ему пространство [21].
Рентгеноструктурный анализ дает расстояние
между соседними двойными спиралями ДНК внутри
вирусной капсулы порядка 1-2 диаметров молекулы
воды [22]. In vitro при таком расстоянии между
молекулами при физиологической ионной силе ДНК
образует жидкокристаллическую фазу [23]. Это
позволяет сделать предположение о возможности жидкокристаллической
упаковки ДНК in vivo.

4
Упаковка ДНК внутри фага осуществляется за счет работы,
совершаемой мощным молекулярным мотором. Это белковый комплекс,
который, вращая нить ДНК вокруг своей оси, вталкивает ее внутрь капсулы
через отверстие, сравнимое с диаметром двойной спирали. Словно сжатая
пружина, ДНК внутри фага обладает энергией упругости, и поэтому
оказывает сильное давление на стенки капсулы [24]. В заполненном
бактериофаге Ф29, например, внутреннее давление обуславливает силу
порядка 50 pN [25], которой достаточно для инициации самостоятельного
выхода ДНК из фага внутрь клетки-хозяина при инфицировании. Таким
образом, первая стадия инфицирования может проходить без участия белков,
и контролироваться осмотическим давлением, а так же соотношением
концентраций противоионов внутри и вне капсулы [26].
Запасенной внутри фага Ф29 энергии, однако, хватает лишь для выхода
части нити ДНК [27]. Таким образом, процесс вирусного инфицирования
нельзя полностью свести к неспецифической электростатике. Важную роль
играет и специфическое взаимодействие с белками [28].

4
Рис. 11. Взаимодействие Т4 с оболочкой бактерии.

Основание бактериофага Т4 состоит из 16 различных типов белков.


Перед иньекцией эти протеины собираются вместе, формируя
гексагональную структуру.
Длинные отростки сперва находят E. Coli, а, затем короткие прочно
прикрепляются к клетке. Основание при этом передает импульс в ствол,
который сокращается, как мускул, выдавливая из себя вирусную ДНК в
клетку-хозяина. Основание вируса управляется как прокалывающим
устройством, расположенным у ствола, и энзимом, режущим мембрану

4
клетки E. Coli. Этот энзим делает отверстие нанометровых размеров в
мембране клетки, через которое вирусная ДНК поступает в клетку-хозяина.
E. Coli, таким образом, инфицируется и биохимическая машина клетки
продуцирует новые фаговые частицы, и, в конце концов, клетка гибнет.

Рис. 12. Модель работы белковой машины впрыска фага Т4.

4
Рис. 13. Строение белков основания, смоделированное с помощью
программного обеспечения «SPIDER».

Данные для модели получены при исследовании 418 микрофотографий


замороженных вирусных частиц. Область, обозначенная (gp27-gp5*-gp5c)3 –
биохимическое прокалывающее устройство. Наибольшая активность
прокалывающего энзима наблюдается посредине «иглы». Рис. а –
стереофотография основания, рис. b – его молекулярная структура. 1
ангстрем = 1/100000 см [29].

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ БАКТЕРИОФАГОВ


Уничтожение патогенных бактерий происходит в результате
инфицирования бактериальной клетки бактериофагом. Процесс

4
взаимодействия бактериофага с бактериями протекает циклично (до полного
уничтожения бактерий).
Каждый жизненный цикл бактериофага состоит из последовательных
этапов:
1. Адсорбция бактериофага на поверхности бактерии и инъекция
нуклеиновой кислоты (генетического материала) внутрь бактериальной
клетки.

2. Внутриклеточное развитие. Разрушение ДНК бактерии и репродукция


ДНК бактериофага.

3. Лизис (разрушение) бактериальной клетки и выход нового поколения


бактериофага.

4
Процент выхода годных (около 99%) говорит о невозможности какой-
либо хаотичной сборки.

СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ОБРАЗЦОВ ВИРУСА


Почему же нельзя просто посмотреть на то, как происходит сборка и
снять фильм?

ФУРЬЕ-ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ
Первые образцы вирусов были получены с помощью микрофотографий,
однако они не давали простых прямых изображений образцов. Была ощутима
ограниченность электронной микроскопии. Во-первых, были артефакты,
порожденные подготовкой образца, а также радиационные повреждения во
время наблюдения. Во-вторых, необходимо было использовать
искусственные способы усиления контраста, так как большинство атомов в
биологических образцах имели слишком малые атомные номера, чтобы
самостоятельно обеспечить достаточную контрастность.
В-третьих, получающееся изображение зависит от условий работы
микроскопа и его фокусировки, а также от имеющихся аберраций. Помимо
всего, из-за большой глубины резкости обычного микроскопа все детали
вдоль направления наблюдения накладываются на изображение. Наконец, в
случае сильно рассеивающих или толстых образцов в них имеет место
множественное рассеяние, что может разрушить даже эту связь между
объектами его образом. По этим причинам те детали, которые можно видеть
на необработанном изображении, часто ненадежны, и их нелегко
интерпретировать, если не иметь методов, которые исправляют
операционные ошибки микроскопа и позволяют разделить вклады, вносимые

4
в изображение различными сечениями образца. Важно также уметь
оценивать степень сохранности образца в каждом конкретном случае.

ДВУМЕРНАЯ РЕКОНСТРУКЦИЯ: ЦИФРОВАЯ


КОМПЬЮТЕРНАЯ ОБРАБОТКА
Далее ученые нашли альтернативу, а именно метод негативного
окрашивания, который был разработан незадолго до этого Хаксли и
Бреннером и Хорном [30]. По этому методу образец погружается в тонкий
аморфный слой соли тяжелого металла, которая одновременно сохраняет и
проявляет форму областей, из которых она вытеснена. Было видно большое
количество тонких деталей, но в большинстве случаев было нелегко понять,
что они означают.

Рис. 14. Оптическая дифракция и фильтрация изображений трубчатых


структур, известных как «полиголовки», состоящих из основного белка
головки бактериофага Т4 [31].

а) Электронная микрофотография негативно окрашенной уплощенной


частицы (200 000);

4
б) оптическая дифркционная картина рис. б), на которой кругами
обвелен набор дифракционных пиков, соответствующий одному слою
структуры;
в) отфильтрованное изображение одного слоя на рис. а) с
использованием дифракционной маски, показанной на рис. б). Апертура в
маске выбирается таким образом, что усреднение здесь захватывает только
несколько соседних клеток. Можно вдеть отдельные молекулы,
организованные в гексамеры.

ТРЕХМЕРНАЯ РЕКОНСТРУКЦИЯ ИЗОБРАЖЕНИЯ


Чтобы получить единственную или
надежную картину трехмерной структуры,
необходимо иметь возможность
рассмотреть образец со множества
различных направлений[32]. Эти различные
ракурсы часто получались, когда образец
был при наблюдении произвольно
ориентирован, но их можно также получить,
как говорилось выше, поворачивая образец
под микроскопом.
Однако набор изображений,
полученных при различных направлениях
взгляда, можно объективно объединить,
чтобы реконструировать трехмерный образ
объекта.

Рис. 15. Схема общего процесса


трехмерной реконструкции объекта
по набору двумерных проекций [32].

4
ФАЗОВОКОНТРАСТНАЯ МИКРОСКОПИЯ
Электронная микроскопия в сочетании с тем или иным методом анализа
образцов, примененная к негативно окрашенным образцам, оказалась
идеальным инструментом для определения расположения и формы малых
белковых субъединиц в естественных и искусственных структурах, среди
которых — двумерные кристаллы и макромолекулярные ансамбли, такие, как
вирусы и микротрубочки. Структурная информация, получаемая этим
методом, оказалась весьма надежной для деталей, размеры которых не
меньше 20 или 15 А. Однако стало ясно, что этот масштаб ограничен
зернистостью негативного окрашивания и тем, насколько точно оно
повторяет поверхность образца [33]. Чтобы получить более высокое
разрешение, лучше 10 А, нужно отказаться от окрашивания и смотреть
непосредственно на белок. При высоком разрешении возникает другая
проблема: радиационное повреждение. Его можно уменьшить, снизив
интенсивность облучающего пучка, но тогда увеличивается статистический
шум и первичное изображение становится все менее и менее надежным.
Чтобы получить свое эффектное трехмерное реконструированное
изображение пурпурной мембраны Halobacterium с разрешением около 7 А.
м, Хендерсон и Анвин зафиксировали ряд изображений при низких дозах
облучения разных кусков мембраны, повернутых на различные углы.
Финальная картина была результатом усреднения примерно по 100 000
молекул. Слабый контраст на отдельных микрофотографиях, полученный
дефокусировкой, был затем усилен и откорректирован с помощью ЭВМ по
методу, описанному выше. Это был первый раз, когда внутреннюю
структуру белковой молекулы «увидели» с помощью электронного
микроскопа.

4
СФЕРИЧЕСКИЕ ВИРУСЫ
Сферические наночастицы можно получить путем термической
денатурации белка оболочки вируса (например, ВТМ). В 1956 году вирусолог
Роджер Харт показал, что термическая обработка частиц ВТМ при
температуре 80–98 °C в течение 10 секунд ведут к набуханию вирионов из-за
денатурации белков и преобразования их в шарообразные частицы [34].
Российские вирусологи выяснили, что размер сферических частиц варьирует
в диапазоне 50–800+ нм. Для получения сферических наночастиц (СНЧ) они
использовали собственно вирус табачной мозаики и его белковую оболочку
[35]. Посредством электронной микроскопии было выявлено две стадии
термической трансформации нативного вируса:

Рис. 15. Двухстадийная модификация ВТМ в СНЧ. Слева: первая стадия,


температура 90 °C. Справа: дальнейшее нагревание, температура 94 °C.
Фотографии из статьи «Температурная модификация нативного вируса
табачной мозаики и ВТМ-белков без РНК в сферические наночастицы» И.Г.
Атабекова и его коллег.

Нагревание до 90 °C — набухание частиц с одного или с двух концов и


формирование несферических частиц различных размеров и форм.
Дальнейшее нагревание до 94 °C — зрелые СНЧ.
Нагревание палочковидных ВТМ при 94–98 °C дает 100% выход СНЧ,
объем которых не обязательно соответствует объему «палочек» ВТМ (радиус
4
около 52 нм). Все СНЧ нерастворимы в воде и могут существовать в виде
коллоидного раствора или стойкой суспензии. Что интересно, СНЧ
получаются из любых фрагментов оболочки ВТМ, вплоть до А-белков (но
при более низких температурах из-за меньшей стабильности, чем целостный
ВТМ)

Рис. 16. Схема (не в масштабе) показывающая СНЧ, порожденные из


природной ВТМ и ВТМ без РНК. Природный ВТМ (слева) и ВТМ без РНК
(справа) нагревают при 94 или 65 ° С. Диапазоны размеров сферических
наночастиц указаны.

Схема синтеза СНЧ из нативного ВТМ (слева) и белковых агрегатов


ВТМ (справа). Указаны концентрации исходных структур и размеры СНЧ
[35].

МОДЕЛЬ САМОСБОРКИ ПРОСТЕЙШИХ СФЕРИЧЕСКИХ


ВИРУСОВ
Большинство вирусных частиц с замкнутым чехлом обладает
икосаэдрической симметрией. Это самая эффективная симметрия для
конструирования замкнутого чехла из отдельных субъединиц: в этом случае
при сборке чехла фиксированного размера используются строительные блоки

4
минимального размера. На поверхности любой структуры с икосаэдрической
симметрией имеется 60 идентичных элементов, связанных друг с другом
осями симметрии 2, 3 и 5-го порядков.
Способ упаковки элементов в структуру с данной симметрией показан
на рисунке. Запятые, связанные осями симметрии 2-го порядка, расположены
«лицом-к-лицу», связанные осями 3-го порядка — «затылком-к-затылку», а
5-го порядка — «хвостом-к-хвосту». Замкнутые капсиды с симметрией более
высокого порядка, чем икосаэдрическая, строго говоря, существовать не
могут. Молекула нуклеиновой кислоты большинства вирусов слишком
велика, чтобы ее можно было упаковать в чехол из 60 субъединиц разумной
молекулярной массы. Субъединица состоит из нескольких белковых цепей,
иногда (например, в случае полиовируса) химически неидентичных. Однако
нередко эти цепи бывают «генетически эквивалентны», и тогда вирусный
чехол состоит из 60 п (где п>1) идентичных структурных элементов. В связи
с этим возникают две важные проблемы, Поскольку не все субъединицы
данного типа связаны друг с другом симметричным образом, то каждая
субъединица в зависимости от ее местоположения в чехле оказывается
включенной в один из нескольких возможных видов взаимодействия с
соседями. Отсюда возникает первая проблема — проблема белковой
архитектуры. Каким образом обеспечивается альтернативность связывания
субъединиц? Вторая проблема — регулярность сборки: как в процессе
сборки осуществляется столь точное переключение с одного вида
взаимодействия на другой, что в чехле не возникает нерегулярностей и не
происходит его неправильного замыкания?

4
Рис. 17. Структура, обладающая икосаэдрической симметрией и
состоящая из 60 субъединиц. Б. Икосаэдрическая структура, состоящая из
180 субъединиц. Все 180 субъединиц образуют примерно одинаковые
локальные контакты, однако строго говоря, здесь возникает три вида
упаковочных модулей. Они обозначены буквами А, В и С.

Каспар и Клуг предложили одно из возможных решений первой


проблемы, т. е. попытались ответить на вопрос, как могут возникать
альтернативные типы связывания между субъединицами одного вида. Почти
полная идентичность контактов между 60 п субъединицами в
икосаэдрической капсиде может быть получена следующим образом.
Рассмотрим плоскую гексагональную решетку из идентичных элементов. Из
такой решетки можно получить икосаэдрическую оболочку, удалив
«ломтики» в 60° и «сшив» края разрезов. Через каждую вершину такого
икосаэдра проходит ось 5-го порядка. Если удалить «ломтик» у каждой из
вершин гексагональной решетки, то получится икосаэдр из 60 субъединиц с
идентичными меж-субъединичными контактами. Эти контакты аналогичны
контактам в исходной гексагональной решетке, хотя наличие у оболочки
кривизны подразумевает, что элементы конечной толщины не смогут
полностью сохранить в икосаэдрической структуре те же связи, которые
существовали между ними в плоской решетке. Если вырезать «ломтики» из
каждого второго ближайшего соседа, получится оболочка большего размера

4
— из 180 субъединиц, а не из 60. При этом все контакты будут сходны,
однако в действительности субъединицы окажутся разбитыми на три типа.
На рисунке они обозначены буквами А, В и С. Отметим, что среди контактов,
стабилизирующих эту структуру, будут присутствовать связи трех типов:
«голова-к-голове» — между парами субъединиц, «спина-к-спине» —
объединяющие в кольцо три элемента и «хвост-к-хвосту» — замыкающие
кольцо из пяти или шести элементов. Каждая субъединица будет участвовать
во всех трех типах взаимодействия. Таким образом, несмотря на различия в
деталях упаковки субъединиц А, В и С, с точки зрения образуемых ими
контактов они очень сходны. Например, все субъединицы образуют контакты
типа «хвост-к-хвосту», но субъединицы А-типа замыкаются в кольцо из пяти
элементов, как в простых ансамблях из 60 субъединиц, а субъединицы В- и
С-типов — из шести. Контакты типа «хвост-к-голове» вообще отсутствуют.
Гомологичные участки субъединиц всех классов образуют примерно
одинаковые контакты. Такое связывание было названо Каспаром и Клугом
«квазиэквивалентным», чтобы подчеркнуть, что все субъединицы образуют
сходные, хотя и неидентичные контакты. Каспар и Клуг отметили, что
нековалентные связи в белках обладают определенной лабильностью и это
позволяет генетически и химически идентичным молекулам образовывать
неидентичные контакты. Подобная упаковка (правда, немного отличающаяся
от описанной выше) действительно наблюдается в случае вируса кустистой
карликовости томатов (TBSV) и некоторых других вирусов. Это
подтверждает постулат о «близко родственных» специфических
взаимодействиях.
О структурах, подобных представленным на рисунке, иногда говорят,
что они построены из пентамеров и гексамеров. Это действительно так, если
связи «хвост-к-хвосту» особенно прочны. Если все контакты, кроме
контактов «хвост-к-хвосту», разрушить, структура распадется на 12
пентамеров и 30 гексамеров. Часто субъединицы бывают снабжены
выступающим наружу элементом, расположенным так, что на электронно-

4
микроскопических фотографиях многих структур действительно
наблюдаются группы из пяти и шести выступов. Это явление назвали
пентамерно-гексамерной кластеризацией. Примером такого рода может
служить CCMV. Подобные кластеры — чисто морфологические образования.
По ним можно судить о форме поверхности субъединиц, а также о том,
каким образом они контактируют друг с другом. В действительности
большинство изученных вирусов, которые состоят из 180 субъединиц
(например, CCMV), при диссоциации в мягких условиях распадаются на
димеры. Следовательно, несмотря на выступы, которые дают характерную
картину при негативном контрастировании, «попарные» контакты («голова-
к-голове») являются самыми прочными.

КЛАССИФИКАЦИЯ МОДЕЛЕЙ
На данный момент существует некоторое количество вычислительных
моделей, имитирующих самосборку сферических вирусов. Условно можно
разделить их на следующие типы:
Формально-логические модели. В качестве примера можно рассмотреть
теорию правил локальных взаимодействий, в которой с помощью некоторого
заданного множества правил определяется набор допустимых
взаимодействий, происходящих в процессе сборки. Такую модель применяют
в совокупности с моделями более низкого уровня.
Дискретно-событийное моделирование с применением модели
Гиллеспи. Моделирование построено на решении производящего уравнения
с предположением, что реакции являются марковскими процессами. При
этом множество допустимых реакций конечно и определяется с помощью
какой-либо формально-логической модели.
Производящим уравнением называется уравнение, описывающее
d Pk
эволюцию системы во времени. Оно имеет вид =∑ Γ kl ∙ Pl , где Pk и Pl -
dt l

вероятности того, что система находится в состояниях k и l соответственно,

4
Γ kl – вероятность перехода системы из состояния k в состояние l . В общем

случае возможны обратные переходы изl в k с вероятностью Γ l k ≠ Γ kl . Тогда


d Pk
уравнение имеет вид =∑ ( Γ kl ∙ Pl−Γ lk ∙ Pl ).
dt l ≠k

Подход, построенный на молекулярной динамике. Метод молекулярной


динамики (метод МД) — это метод, в котором временная эволюция системы
взаимодействующих атомов или частиц отслеживается интегрированием их
уравнений движения. При этом применяется крупнозернистое, грубое
моделирование, где одной субъединице соответствует одна частица (в более
точных моделях – несколько частиц, имитирующих «жесткие» части
субъединицы). Как правило, применяется в сочетании с формально-
логической моделью, определяющей допустимые взаимодействия. Позволяет
исследовать динамические траектории частиц и возможные нарушения в
собирающихся структурах.
Моделирование кинетики сборки. Моделирование проводится с
помощью решения системы уравнений скоростей реакции. Семейства
траекторий в такой модели задаются явно. Модель позволяет исследовать
заданное заранее семейство траекторий [36].

ПРЕДПОЛАГАЕМЫЙ СЦЕНАРИЙ САМОСБОРКИ


СФЕЕРИЧЕСКИХ ВИРУСОВ.
Для начала рассмотрим столь
популярные опыты [37].
Физические модели были
использованы для изучения
самосборки вирусов. Справа, три
кадра из фильма, показывающие
самосборку вируса. Субъединицы
были изготовлены на основе
молекулярной структуры, а

4
магниты размещены на границах раздела. Затем модели встряхивают в
маленькой бутылке, модель собирается. Итоги данных экспериментов – ran-
dom self-assembling. На данной модели не будем останавливаться из-за её
антинаучности.

Рис. 18. Модель полиовируса капсида,


состоящий из 12 одинаковых частей с
магнитами, прикрепленными по краям.

Рассмотрим теорию, описывающую механизмы самосборки структур


вирусных капсидов в рамках теории кристаллизации Ландау.
Хиральный пентагональный порядок вирусных оболочек семейства
Паповавирусов объясняется в рамках классической теории упругости
квазикристаллов нелинейной фазонной деформацией, конечной причиной
которой является обычная неоднородная деформация додекаэдрических
граней капсида, возникающая в результате их выпучивания.
Теория, объясняющая процессы формирования капсидов вирусов, как со
сферической, так и с промежуточной формой со слабо выраженной огранкой,
разработана на основе обобщения и объединения подхода, описывающего
процессы формирования капсидов семейства Паповавирусов, с концепцией
образования капсидов малых вирусов в рамках теории кристаллизации
Ландау.
1. В рамках теории кристаллизации Ландау путем минимизации
соответствующей свободной энергии с учетом простейших ограничений на
относительное расположение структурных единиц в квазикристаллической
фазе построены квазикристаллические решетки с октагональной и
декагональной симметрией.

4
2. Разработана концепция нелинейных фазонных деформаций в рамках
классической теории упругости квазикристаллов, позволяющая рассчитать
расположение белков и, таким образом, объяснить формирование капсидов
вирусов семейства Паповавирусов.
3. Предложен основанный на принципах квазиэквивалентности
геометрический тайлинговый подход для описания капсидов малых вирусов
со сферической топологией.
4. Построена объединенная теория формирования структур малых и
средних вирусов, основанная на теории кристаллизации Ландау и
минимизации фонон-фазонной энергии вирусного квазикристаллического
порядка [38].

ТЕОРИЯ СБОРКИ, ОСНОВАННАЯ НА ЛОКАЛЬНЫХ ПРАВИЛАХ


Рассмотрим теперь более подробно теорию локальных правил, которая
лежит в основе предыдущей модели.
Для любого возможного размера капсида икосаэдрального вируса
существует одно или несколько возможных множеств локальных правил, по
которым этот капсид строится. Предполагается, что идентичные
субъединицы белка принимают небольшое число различимых конформаций.
Для каждой конформации локальные правила определяют, с какими
конформациями допустимо связывание, и приблизительные углы и
расстояние между субъединицами. Соблюдая эти правила, субъединицы
образуют замкнутую икосаэдральную оболочку определенного размера.
Теорию локальных правил можно проиллюстрировать на примере
оболочки бактериофага P22, который является T = 7 вирусом. Семь
конформаций, или форм белковых субъединиц наблюдались в предкапсиде
вируса P22, хотя не совсем ясно, все ли они различны. Вначале
предположим, что действительно, имеется семь различных конформаций.
Рассмотрим Рис. 1919. На схеме вверху слева показано правило, по которому
происходит связывание одной из конформаций, назовем ее первой. Первая
4
конформация имеет позицию взаимодействия с конформацией второго типа
и две позиции для взаимодействия с конформацией первого типа.
Аналогично, локальные правила могут быть построены для всех семи
конформаций субъединиц фага P22. Когда субъединица участвует хотя бы в
одном взаимодействии связывания, эти правила могут применяться
однозначно, определяя оставшихся соседей субъединицы. Различные
порядки применения локальных правил задают возможные пути, по которым
может протекать сборка.

Рис. 19. Локальные правила взаимодействий для сборки фага P22.

Возникает вопрос, какие структуры могут быть построены при


выполнении этих локальных правил? Применение локальных правил к
произвольному начальному белку может привести только образованию T = 7
оболочки или ее части. Для проверки этого факта можно использовать
компьютерное симулирование.
Симуляция работает следующим образом: устанавливается
энергетическая модель, при предположении, что имеется квадратичный
штраф при отклонении от заданных в правилах углов и расстояний.
Существующая позиция взаимодействия выбирается для присоединения
следующего белка. Если в существующей структуре на расстоянии до одного
диаметра белковой субъединицы нет белков-кандидатов, способных
4
присоединиться, добавляется новый белок. Локальные правила определяют
конформацию и положение каждого нового белка. После добавления белка,
получившаяся структура оптимизируется, что минимизировать энергию по
итеративному алгоритму. На каждом шаге, все белки двигаются согласно
силам и моментам, вычисленным в энергетической модели. Позиции
взаимодействия рассматриваются в случайном порядке, и по методу поиска в
ширину, в обоих случаях результатом симуляции будет образование
замкнутой оболочки.
Вычисления показывают, что локальные правила относительно
устойчивы. Даже если нарушить каждый угол в правилах на рис.19 на 9.60
(около 8%) и на 8% длину каждой связи, то это приводит к образованию
почти идентичной замкнутой оболочки в трехмерном пространстве. Если
нарушить углы на 10%, оболочка не замыкается в приблизительно половине
попыток, но, тем не менее, выглядит похожей на эталон при успешном
замыкании. При более существенных (неслучайных) изменениях локальных
правил, оболочка вируса может принять как сферическую, так и спиральную
форму.
Рассуждения, приведенные выше, наводят на мысль, что замыкание
капсида легко гарантировать. Но на самом деле симуляции показывают, что
нарушение формы растущего капсида и образование спирали могут
произойти, если локальные правила разбиты всего один раз. Такие
некорректно образованные структуры наблюдались для P22 и других
вирусов.
Локальные правила могут помочь в определении вирусных структур.

4
Рис. 20. Пример множества правил взаимодействия для T = 7 вируса с 4-
мя конформациями [39].

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОСТРАНСТВА ПАРАМЕТРОВ ПРИ


САМОСБОРКЕ
Производилось исследование пространства параметров модели сборки
икосаэдральных вирусных капсидов как функций скоростей связывания
мономеров. При этом обнаружилось три основных механизма сборки:
стандартный путь приращения мономеров и две различных иерархические
траектории сборки, кроме того, существуют области, в которых имеются
кинетические ловушки. Имеются граничные участки, в которых вероятно
встречаются и гибридные пути. Рассматривалась октамерная и
икосаэдральная модели, при этом октамерная система оказалась менее
чувствительной к изменению параметров системы. Модели наводят на
мысль, что умеренные изменения условий сборки, согласующиеся с
ожидаемыми различиями между сборкой in vivo и in vitro, могут дать
значительные сдвиги в траекториях сборки. То есть, следует быть
осторожными в выводах при сравнении динамики сборки in vivo, in vitro, и в
различных вычислительных моделях.

4
При моделировании использовалась модель Гиллеспи, представление
химии стохастических реакций, основанное на марковской модели с
непрерывным временем, представляющей возможные траектории системы
реакций с конечным числом промежуточных видов. Модель Гиллеспи
реализована алгоритмом, основанным на очередях для быстрой, эффективной
по памяти симуляции систем с большими количествами различимых
промежуточных продуктов. Здесь применяются локальные правила
взаимодействия, в которых назначаются, помимо допустимых соседей,
константы скорости реакции. Эти правила для субъединиц определяют все
структуры и реакции, которые возможны в системе. Для корректирования
скорости диссоциации, симулятор запускался с опцией, запрещающей
диссоциацию субъединиц, удерживаемую несколькими взаимодействиями,
пока все, кроме одной, соседние субъединицы не отсоединятся от сборки
первыми.
Системы параметризовались двумя константами прямой скорости и
двумя константами обратной скорости для двух типов взаимодействия
связывания. Мы обозначаем четыре константы скорости ka+ (константа
прямой скорости интракапсомерных взаимодействий), ka- (константа
обратной скорости интракапсомерных взаимодействий), kr+ (константа
прямой скорости интеркапсомерных взаимодействий), kr- (константа
обратной скорости интеркапсомерных взаимодействий). В моделях
рассматриваются фиксированные константы обратных скоростей и
варьируются константы прямых скоростей. Каждый прогон системы длился
до достижения псевдоравновесного состояния.
На Рис. показан конечный выход (Y) целых продуктов (октамеров или
икосаэдров) в равновесии и время достижения половины этого выхода (T50)
как функция от интер- и интракапсомерных скоростей связывания. Рисунки a
и c относятся к октамерной модели. Когда обе скорости высокие, мы
наблюдаем область низкого выхода, согласующуюся с прежними
свидетельствами высокой вероятности попадания в кинетическую ловушку.

4
Хотя выход в этой области мал, общая скорость роста велика, как вытекает
из малого T50 в передней области c. Напротив, когда обе скорости малы,
наблюдался почти стопроцентный выход, но за более длительное время
сборки, как и ожидалось. Две различные плоские области высокого выхода
наблюдаются в левой и правой частях рисунков, справа отвечающей низкой
скорости интракапсомерного связывания, но высокой скорости
интеркапсомерного связывания, и слева, отвечающей высокой скорости
интракапсомерного связывания, но низкой скорости интеркапсомерного
связывания.

Рис. 21. Зависимость конечного выхода и времени, требуемого для


половины от конечного выхода от скоростей связывания.

Меньшая из двух скоростей является ограничивающей в каждом из этих


доменов, поскольку Y и T50 нечувствительны к дальнейшему увеличению

4
большей скорости. Выход оказывается постоянным и в левой, и в правой
частях рассматриваемого пространства, хотя выход в левой области заметно
выше, чем в правой. Имеется непрерывный переход между этими областями
через третью область высокого выхода, где скорости близки (сзади на
рисунке). Скорость и выход чувствительны к изменениям каждого параметра
в этой области. Имеется постепенное уменьшение выхода и T50 при
увеличении параметров по направлению к передней части рисунков. Мы
можем частично интерпретировать этот рисунок в терминах главных
траекторий сборки, которые мы ожидали бы в различных точках
пространства параметров.
Рассмотрим сначала сборку октамеров. Когда интеркапсомерные
скорости значительно выше интракапсомерных скоростей, мы ожидаем
иерархический механизм сборки, в котором будут быстро накапливаться
димеры, за формирование которых отвечают интеркапсомерные скорости, до
сборки октамеров из димеров через нуклеацию тетрамеров. Авторы
называют этот тип сборки иерархической сборкой первого типа. Эта
траектория отвечает области плато с правой стороны на рисунке a и c.
Поскольку быстро производящиеся димеры являются строительными
блоками для образования октамеров, некоторое количество гексамеров
образовалось бы и продолжило свое существование в псевдоравновесном
состоянии, когда не останется димеров, чтобы расширить гексамеры до
октамеров. Тогда эти гексамеры окажутся кинетической ловушкой, вызывая
наблюдаемое уменьшение выхода октамеров в таком домене параметров.
Когда интракапсомерные скорости выше, мы ожидаем быстрое
накопление тетрамерных «капсомеров» в четырехступенчатой реакции, за
которой следует накопление пар тетрамеров в октамеры за один
дополнительный шаг. Мы называем это иерархической сборкой второго типа.
Она соответствует области плато с левой стороны рисунков a и c.
Когда скорости примерно равны, мы ожидаем стандартную
одношаговую сборку с ограниченной нуклеацией, где за четырехступенчатой

4
нуклеацией тетрамеров следует двухступенчатая элонгация присоединением
мономеров. Ядра могут быть капсомерами или гетерогенными тетрамерами.
Мы называем этот неиерархический механизм сборкой третьего типа. Он
отвечает области прямо посередине графиков.
Несмотря на различные траектории сборки, домены типа 2 и 3 способны
достигнуть одинакового конечного состояния почти полного превращения
мономеров в октамеры. Однако сборка типа 2 дает более эффективную
траекторию для достижения этого состояния. Сборка типа 3 подвержена
попадания в кинетическую ловушку, когда обе скорости связывания высоки.
Такая кинетическая ловушка наблюдалась во многих ранних симуляциях и
экспериментальных исследованиях таких систем. Впрочем отметим, что
такой анализ траекторий является очень сильным упрощением. Он может
приблизительно описать поведение систем при крайних значениях скоростей
в терминах трех дискретных механизмов. Однако, эмпирические данные
показывают гладкий переход выхода и скорости при перемещении между
доменами. Поэтому, большая часть пространства параметров занята
областями, где ожидаются комбинации трех главных типов сборки или
гибридные реакции, не включенные ни в один из рассмотренных типов.
Рис. b и d показывают изменение выхода и T50 для икосаэдра. Как и с
предыдущими рисунками, мы выявляем три продуктивные области
пространства параметров: область первого типа сзади справа, область
второго типа сзади слева и область третьего типа сзади посередине. Рис. b
показывает области высокого выхода вдоль всей задней границы рисунка,
отвечающие малым скоростям по обоим параметрам. Высокие
интеркапсомерные скорости относительно интракапсомерных скоростей
дают область умеренного выхода сзади справа рисунка. Высокие
интракапсомерные скорости относительно интеркапсомерных скоростей
дают область высокого выхода сзади слева. Хотя эти особенности
качественно аналогичны наблюдаемым в октамерной системе, имеются

4
заметные отличия. Икосаэдр показывает крутое падение каждой области
высокого выхода при увеличении ограничивающей скорости.
Напротив, октамер показывает только постепенные уменьшения выхода.
Правая область фазового пространства для сборки икосаэдра достигает
максимального выхода при заметно большей общей скорости сборки, чем это
возможно для левой области. Левая область существенно шире и
подвергается более плавному уменьшению выхода и увеличению скорости с
возрастанием скорости интеркапсомерного связывания. Например, правая
область падает от почти стопроцентного выхода до нулевого выхода при
изменении интракапсомерной скорости примерно на сто порядков, в то время
как в левой области для достижения подобного эффекта требуется изменение
интеркапсомерной скорости в 10000 раз. Таким образом, правая область
выглядит оптимальным доменом для максимизации скорости пикового
выхода при жестко управляемых условиях, тогда как левая область может
быть лучшей для достижения устойчивого высокого выхода при
непредсказуемых условиях. Опять же, имеется гладкий переход между этими
условиями через промежуточную область, где две скорости связывания
примерно пропорциональны. Скорости и выходы чувствительны к обеим
скоростям связывания в этой средней области, но почти нечувствительны к
большей из двух скоростей за ее пределами.
Мы можем снова интерпретировать рисунок в терминах трех вероятных
путей связывания. Следующий рисунок показывает три траектории,
ожидаемые для икосаэдральной системы. Первый тип снова отвечает
быстрому интеркапсомерному связыванию, приводящему к производству
димеров, которые затем собираются в целые капсиды через нуклеацию
гетерогенных гексамеров. Второй тип снова является иерархическим
механизмом, за счет быстрого интракапсомерного связывания. Однако, для
икосаэдра сборка второго типа протекает через агрегацию в пентамеры, а
затем рост, ограниченный нуклеацией, через ядро вида тример из
пентамеров. Асимметрия чувствительности к изменению скорости между

4
этими областями может в основном объясняться различиями в числе
требуемых шагов элонгации после этапа агрегации. Обе области имеют
скорости трехступенчатой нуклеации после агрегации, но тип 2 имеет
намного меньше шагов элонгации, чем тип 1, поскольку рост происходит за
счет присоединения пентамеров, а не димеров. Длинная фаза элонгации
делает домен первого типа менее устойчивым к кинетическим ловушкам и
изменениям скорости при малых изменениях параметров. Область
неиерархической сборки третьего типа снова предсказывается при
примерном равенстве скоростей. В этом случае, неиерархическая сборка,
ограниченная нуклеацией, как ожидается, протекает за счет медленной
нуклеации пентамеров, за которой следует присоединение мономеров. Как
ожидается, все три области демонстрируют ограниченный нуклеацией рост
после реакции агрегации, что делает их уязвимыми к кинетическим
ловушкам, когда скорости связывания высоки. «Ловушечные»
промежуточные виды могут, однако, быть различными для этих трех
доменов. Большие порядки большинства ключевых шагов сборки для
икосаэдра, по отношению к октамеру, объясняются общей большей
чувствительностью скоростей и выхода для икосаэдра. Заметим, что эти три
типа траекторий являются результатом определенного шаблона
взаимодействий связывания, используемого в нашей капсидной модели.
Модель допускает больше типов взаимодействий связывания с
независимыми скоростями, и потенциально может открыть дополнительные
типы траекторий, недоступные для двухпараметрической модели
рассматриваемой в исследовании [40].

СИМУЛЯТОР
Существует симулятор, позволяющий моделировать сложные
биологические самособирающиеся системы, в том числе белковые оболочки
вирусов. Симулятор применяет обобщенную модель самосборки,
основанную на локальных правилах взаимодействия, определяющих
поведение сложных реакций самосборки.
4
Теория локальных правил предполагает, что образование вирусного
капсида может управляться локальными взаимодействиями между
субъединицами белков, образующих капсид, при этом геометрия капсида
является следствием того, что субъединицы при выборе положения в капсиде
и выборе партнеров для образования связей исходят только из их
непосредственного окружения в капсиде.
Простейшее множество локальных правил, используемое для описания
вируса типа T=1, изображено на Рис. . Эта модель применялась для
объяснения нормальных геометрических структур вируса и возможных
причин нарушения сборки. Позднее появился базис для более сложной
модели, получившей название динамики локальных правил, сочетающей
локальные правила со сложной динамической моделью движения и
структуры частиц, и скоростей реакций. Однако, из-за большого объема
требуемых вычислений, применение данной модели ограничено.

Рис. 22. Локальные правила для капсида T=1.

МОДЕЛЬ ДИСКРЕТНЫХ СОБЫТИЙ


Химические реакции часто описывают формулой вида:

4
kf
A+ B ⇌ C .
kr

Формула означает, что молекулы A и B взаимодействуют, образуя


молекулу C с характеристической скоростью k f . C может обратно
преобразовываться в A и B со скоростью k r.
Системы таких реакций часто детерминировано моделируются с
использованием обыкновенных дифференциальных уравнений (ОДУ), что
позволяет отследить концентрации молекул, участвующих в реакции как
функций от времени и постоянных параметров реакции. Модель дискретных
событий использует стохастический подход для моделирования протекания
реакций в терминах отдельных событий, разделенных временем ожидания.
Времена ожидания распределены экспоненциально со средними временами
T f и T r для каждого типа реакции. Если объем симуляции равен единице, мы

можем легко связать ОДУ модель и модель дискретных событий для


1 1
некоторой системы. Если мы определим единицу времени как T f = k и T r= k ,
f r

то дискретное количество реагентов в модели дискретных событий будет


приближаться к непрерывной концентрации реагентов в ОДУ модели для
достаточно больших систем.

МОДЕЛЬ БЕЛКА
Модель выведена из теории локальных правил и определяет
самособирающиеся системы в терминах простых парных взаимодействий
связывания. Теория локальных правил является не только гипотезой о сборке
капсида, происходящей в действительности, но и полезной вычислительной
абстракцией. Физическая модель симулятора аналогична модели динамики
локальных правил. Однако новая модель использует метод симуляции
дискретных событий, а не более требовательный к вычислениям метод,
подобный методу молекулярной динамики. Базовый строительный блок в
симуляции – субъединица, которая представляет отдельный белок или

4
капсомер в биологической самособирающейся системе. Каждая субъединица
имеет установленное множество позиций связывания с определенных
положением в пространстве относительно центра субъединицы и множество
позиций связывания, с которыми она может соединиться. К свойствам
каждого типа позиций относится среднее время ожидания образования и
прекращения связывающего взаимодействия, T a и T d. Поскольку времена
ожидания распределены экспоненциально, средние полностью определяют
распределения времени ожидания. Некоторые модели сборки требуют, чтобы
субъединицы могли динамически изменять свои конфигурации связывания.
Для этого в симуляторе субъединицы определены как комбинации доменов,
каждый из которых имеет несколько допустимых конформаций.

РЕАЛИЗАЦИЯ СОБЫТИЙ
Все возможные события для каждого объекта берутся из
экспоненциальных распределений. Эта модель математически эквивалента
N-кратной модели для кинетики реакции Гиллеспи, которая, в свою очередь,
является представлением системы как непрерывного марковского процесса.

ТЕХНИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
При запуске симуляции системе задается популяция из m сборок и
пустая очередь событий. Для каждой сборки выбираются все возможные
события, возникающие в процессе сборки, и одно из них с минимальным
временем ожидания помещается в очередь событий. Выбор события
образования связи (FormBondEvent) задействует парные взаимодействия
между всеми сборками. Для предотвращения дублирования выбора и
добавления в очередь этого события, производится m(m-1)/2 сравнений, и
созданный список событий просматривается, и повторные события
удаляются. В реализации симулятора на настоящий момент этот метод
инициализации требует однократного вычисления с оценкой сложности O(m-

4
) и является узким местом с точки зрения загрузки процессора. Однако
2

авторы собираются применить более эффективный метод.


После того, как событие с наименьшим временем задержки извлекается
из очереди, текущее время симуляции обновляется. Событие считается
действительным, если изменения состояний частиц, участвующих в
предыдущем событии, к этому моменту обновили свое состояние. В
противном случае, событие признается недействительным. Различные типы
событий обрабатываются следующим образом.
Действительное событие разрушения связи (BreakingBondEvent): если
разбиение может разделить сборку на две несоединенные подсборки,
выбираются новые события для них, и их состояния изменяются (события,
время выборки, информация о компонентах, и т. п.). В некоторых случаях
могут быть применены дополнительные правила.
Действительное событие образования связи (FormBondEvent): обычно
это событие включает две сборки, которые объединяются в единую сборку, и
будет выбрано новое событие минимального времени для единой сборки.
Связывание может произойти и между совместимыми позициями
взаимодействия в единой сборке и запускает повторный выбор событий для
этой сборки. Такое связывание разрешено, если только позиции
взаимодействия имеют совместимые типы и расстояние и углы между ними
находятся в определенных пределах. Добавленное в очередь событие
связывания может оказаться невыполнимым, если две сборки имеют
субъединицы, которые после связывания будут перекрываться, это
называется «пространственная помеха», или из-за того что количество
субъединиц в сборке превысит некоторый заданный порог. В этих случаях
событие связывания не выполнится, и новые события будут выбираться для
двух сборок.
Действительное событие изменения конформации (ConfChangeEvent):
текущая конформация мономера переключается на другую, заданную в этом

4
событии. Это запустит выбор новых возможных событий для
задействованной сборки.
Недействительное событие: такое событие не вызывает изменений в
состоянии симуляции. Однако если один агент в недействительном событии
впоследствии не участвует в событиях, то создается новое событие с
минимальным временем. Это гарантирует, что для каждой сборки всегда
будет некоторое событие в очереди.
Во время запуска симуляции повторный выбор новых событий по-
прежнему включает получение одного типа событий с минимальным
временем. Однако, поскольку не более, чем для двух сборок нужно назначать
новые события, за один шаг в очередь помещается не более двух событий, в
отличие от инициализации. Объем вычислений за один шаг линейно зависит
от размера системы.

Рис. 23. Схема выполнения шага симуляции.


Симулятор написан на языке Java и является кроссплатформенным [41].

4
ДИНАМИЧЕСКИЕ ТРАЕКТОРИИ СБОРКИ ВИРУСНОГО КАПСИДА
Разработан класс моделей, которые имитируют сборку частиц в объекты
наподобие капсидов T1 с использованием ньютоновской динамики.
Выполняя симуляцию для различных значений параметров системы,
варьируются силы, направляющие сборку. Для некоторых диапазонов
параметров сборка протекает легко, для других сборка динамически
нарушается кинетическими ловушками, соответствующими «уродливым»,
или незавершенным капсидам. Симуляции замеряют большое число
независимых траекторий при различных концентрациях капсомеров, что
позволяет сделать статистически значимые выводы. В зависимости от
геометрии субъединицы (т. е., капсомера), успешная сборка протекает
разными способами, включая связывание промежуточных продуктов разных
размеров.
Изучение самосборки с помощью численных моделей является
непростой задачей, поскольку короткодействующие свойства
межсубъединичных взаимодействий управляют образованием общей
структуры. Соединение и разъединение отдельных субъединиц происходит
на порядки быстрее общего процесса сборки. Кроме того, эти скорости
управляются взаимодействиями, определенными на расстояниях,
сопоставимых с размером атомов, которые на три порядка меньше типичного
размера капсидов.
В данной модели предпринята попытка изучения природы возможных
кинетических ловушек и объем ансамблей событий успешной сборки.
Вычисляются термодинамические свойства модели, обсуждаются результаты
динамических симуляций. Симулированием сборки для различных значений
параметров системы, варьируются силы, благоприятствующие и, наоборот,
препятствующие сборке. Определяются области пространства параметров, в
которых преобладают два вида кинетических ловушек и разъясняются
процессы, благодаря которым удается избежать попадания в кинетические
ловушки в других областях пространства параметров.

4
МОДЕЛЬ
Белки капсида обычно содержат несколько сотен аминокислотных
остатков, которых сворачиваются в четко определенные фигуры со
специфическими взаимодействиями, которые приводят к притяжениям
между комплементарными сторонами близлежащих субъединиц.
Представляется, что интегрированием по степеням свободы можно прийти к
модели, в которой субъединицы имеют исключенный объем и
асимметричные парные взаимодействия связывания между
комплементарными сторонами. В данной модели используется исключенный
объем в виде сферы для каждого капсомера, и используются внутренние
векторы связывания, чтобы учесть эффекты формы белка и
комплементарности. Целью является определение того, достаточно ли, и если
достаточно, то при каких условиях этих компонентов, чтобы управлять
сборкой.
Рассматриваются три типа моделей: B3, B4 и B5, которые содержат три,
четыре и пять внутренних векторов связывания, соответственно. Векторы
связывания, b(αi ), изображены на Рис. . Индекс α пробегает от 1 до n b, где n b=3
для модели B3, n b=4 для модели B4 и n b=5 для модели B5, i пробегает от 1 до
N, где N – число капсомеров в системе. Вектор r (α) (α )
i =Ri +b i является позицией

взаимодействия α в капсомере i, где Ri является центром капсомера i. Все


векторы связывания имеют одинаковую длину b и жестко фиксированы в
системе отсчета относительно центра капсомера. Движения осуществляются
только за счет перемещений и вращений капсомера. Возможные в
действительности флуктуации мы считаем усредненными, и не учитываем их
в модели с рассматриваемым уровнем абстракции.

4
Рис. 24. Геометрия векторов связей в моделях капсомеров B3, B4 и B5. Ri
является центром капсомера i. Углы между векторами связей указаны в
градусах.

Общая потенциальная энергия взаимодействия между N капсомерами,


N

U(1, 2, …, N) считается попарно: U(1, 2, …, N) = ∑ u(i , j), где u(i , j) зависит


i> j=1

от векторов связей и центров капсомеров i и j . Конкретный вид потенциала


зависит от выбранного типа капсомера, B3, B4 или B5. Однако потенциал
должен быть таким, чтобы конфигурация с наименьшей энергией
соответствовала отдельным икосаэдральным кластерам из 60-ти идентичных
капсомеров. В каждой модели, векторы связей или позиции взаимодействия
имеют комплементарные пары. Например, в модели B3 пары позиций
взаимодействия ( α , β )=( 1,2 ) и(3,3) являются первичными комплементарными
парами. Это значит, что благоприятная потенциальная энергия
взаимодействия между парой капсомеров i и j может образоваться двумя
способами:

4
1. Взаимодействие позиции 1 одного капсомера с позицией 2 другого
капсомера, при этом соответствующие векторы связей почти
антипараллельны.
2. Взаимодействие позиции 3 одного капсомера с позицией 3 другого
капсомера, при этом соответствующие векторы связей почти
антипараллельны.
Благоприятными взаимодействиями (т. е. взаимодействиями
притяжения) являются только взаимодействия, связанные с первичными
комплементарными парами.
Кроме того, имеются вторичные комплементарные пары. Например, в
модели B3 с первичной комплементарной парой ( 1,2 ), имеется вторичная
комплементарная пара (3,3). Это означает, что благоприятное
взаимодействие, вызванное первичной комплементарной парой ( 1,2 ), также
требует, чтобы векторы b 3i и b 3j были почти компланарны. Аналогично, для
первичной комплементарной пары (3,3), вторичная пара - ( 1,2 ) или ( 2,1 )
означает, что если b 3i и b 3j антипараллельны, благоприятные взаимодействия
появятся, только если b 1i и b 2j почти компланарны, и b 2i и b 1j почти
компланарны. Конечно, поскольку капсомеры являются твердыми телами, из
компланарности b 1i и b 2j вытекает компланарность b 2i и b 1j . Первичные и
вторичные пары для каждой модели перечислены в Табл. 1. Локальные связи,
ассоциированные с этими комплементарными парами и результирующими
капсидными структурами, показаны на Рис. 25. При создании этих
изображений предполагалось, что взаимодействия исключенных объемов
запрещают позициям взаимодействия участвовать одновременно более чем в
одном благоприятном комплементарном взаимодействии.

Табл. 1. Первичные и вторичные комплементарные пары и


соответствующие углы для трех моделей капсомеров.
Первичные Вторичные
α β γ ε η ν

4
1 2 2 1 3 3
B3 2 1 1 2 3 3
3 3 1 2 2 1
1 4 2 3
2 3 1 4
B4
3 2 4 1
4 1 3 2
1 5 5 1 2 4
2 2 3 1 1 3
B5 3 4 2 5 4 3
4 3 5 2 3 4
5 1 1 5 4 2
( b(γi ) × Rij ) ∙ ( R ij ×b(εj ) )
cos ( θ )=−b cos ( ϕ )=
( αβ ) (α ) (β ) 2 ( αβ ,1)
∙ b /b , Rij =Ri −R j , ,
|b(γi ) × Rij||R ij ×b(εj )|
ij i j ij

(b(η)
i × Rij ) ∙ ( Rij × b j )
(ν )

cos ( ϕ ( αβ ,2)
)= .
|b(η)
i × Rij|| Rij × b j |
ij (ν)

4
Рис. 25. Комплементарные пары и связи капсомеров. Первый столбец
определяет модель, второй изображает локальное связывание, согласованное
с комплементарными парами векторов связей, третий – полученный целый
капсид.

Зависимость взаимодействий субъединица-субъединица от ориентации


первичных и вторичных пар включает то, что существует движущая сила,
выравнивающая комплементарные области в субъединицах, чтобы
максимизировать контакт между комплементарными остатками. Кривизна
капсида при ориентации с минимумом потенциальной энергии вытекает из

4
того, что углы между векторами связывания для заданной субъединицы не
равны в сумме 2 π .

ПАРНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ
Парный потенциал взаимодействия между двумя капсомерами, скажем,
1 и 2, состоит из симметричной отталкивающей части, u0 (|R 2−R1|) и
притягивающей части. Она, в свою очередь, зависит от R2−R 1 и векторов
связей, относящихся к двум капсомерам,

( 1,2 )=u 0 (|R2−R1|) + ¿


(1)
+u1 ( R 2−R1 , {b(2α ) } , {b(1β ) }).

Для отталкивающей части выбран потенциал WCA (Weeks-Chandler-An-


dersen),

[( ) ( ) ]
12
σ σ 6 1
u0 ( R )=4 ε − + , R< 21/ 6 σ ;u 0 ( R ) =0 , R ≥ 21 /6 σ
R R 4 (2)

Для притяжений выбран

u1 ( R2 −R 1 , { b2α } , {b1β })=∑ uatt (|r 2α −r 1β |) s αβ (1, 2),


( ) ( ) ( ) ( )

αβ
(3)
где сумма берется по первичным комплементарным парам,

[( ) ( ) ( ) ( ) ]
12 6 12 6 1
σ σ σ σ
uatt ( r )=4 ε b − − + , r +2 6 σ <r c ;
1
6
1
6
rc rc
r +2 σ r +2 σ
(4)
1/6
uatt ( r )=0 ,r + 2 σ ≥ r c
имеет минимальное значение −ε b, достигаемое при нулевом разделении
между позициями взаимодействия, и sαβ (1 ,2) - переключательная функция,
заданная

sαβ ( 1 , 2 )=
1
8 [ ( ) ][ ( ) ][ ( ) ]
cos
π θ (12αβ )
θm
+1 cos
π ϕ (12αβ ,1 )
ϕm
+ 1 cos
π ϕ (12αβ ,2)
ϕm
+1
(5)
для моделей B3 и B5 и

4
[ ( ) ][ ( ) ]
1
sαβ ( 1 , 2 )= cos
4
π θ(12αβ )
θm
+ 1 cos
π ϕ (12αβ ,1)
ϕm
+1
(6)
для модели B4. Переменные – углы, используемые в этих выражениях,
определены в Табл. 1. Заметим из таблицы, что определение первичной пары
комплементарных связей задает соответствующие вторичные пары.
Переключательная функция плавно изменяется от 1 до 0 при изменении
переменных-углов θ(12αβ ), ϕ (12αβ ,1 ) и ϕ (12αβ ,2 ) от 0 до θm , ϕ m и ϕ m, соответственно.
Увеличение максимальных углов θm и ϕ m расширяет область
конфигурационного пространства, в котором две близлежащие субъединицы
притягиваются друг к другу, но также ослабляет силу, толкающую систему к
ориентации с минимальной энергией. Вид потенциалов взаимодействий
выбраны так, чтобы дать сильные, короткодействующие, зависящие от
ориентации взаимодействия. Все остальные особенности потенциалов
взаимодействия, характеризующие взаимодействия между белками вируса,
игнорируются.

СВЯЗЬ МОДЕЛИРУЕМЫХ КАПСИДОВ С РЕАЛЬНЫМИ


Модели капсомеров рассматриваемых типов могут быть выведены из
капсидных кристаллических структур помещением центра тяжести
капсомера в центр тяжести каждой субъединицы и назначением связей
между каждой парой сильно взаимодействующих субъединиц. Полученные
связи задают ориентации векторов связей в субъединицах модели, и
свободная энергия связей белок-белок задает силы взаимодействия в модели,
ε b. Модели выведены из трех различные решеток, изображенных на Рис. , но

не из определенных кристаллических структур. Эти решетки покрыты


упрощенными белками, имеющими форму треугольников, ромбов и
трапеций для B3, B4 и B5, соответственно. Пары схематичных белков
испытывают благоприятных взаимодействия на общем ребре целиком, или
его части. Решетка B4 вписана в кристаллическую структуру canine par-
vovirus. Решетка B5 наиболее точно представляет T1 вирусы. Модель B3
4
меньше других согласуется с кристаллическими структурами вирусных
капсидов. Хотя B4 и B5 покрывают икосаэдр, B3 покрывает двойственный ему
додекаэдр. Каждая решетка представляет вирус T1 в том смысле, что эти
капсиды имеют 60 идентичных белков и икосаэдральную симметрию.

Рис. 26. Решетки, из которых выведены три капсомерные модели.


Толстые черные линии определяют икосаэдр для B4 и B5 или додекаэдр для
B3. Тонкие черные линии, как укладываются простые фигуры, определяющие
капсомеры. Прерывистые линии показывают один белок. Для B4 показана
структура canine parvovirus.

Динамика для трех моделей капсомеров изучается для определения


условий, которые приводят к сборке в такой простой модели. При заданных
различных связностях в трех различных моделях неудивительно, что все они
собираются по разным траекториям. Однако, несмотря на эти различия,
кинетика сборки качественно аналогична во всех трех классах моделей.

ДИНАМИЧЕСКИЕ СИМУЛЯЦИИ
Динамические траектории вычислялись с помощью броуновской
динамики, в которой движения частиц вычисляются из законов Ньютона с
силами и моментами, взятыми из межсубъединичных взаимодействий, а
также сопротивлением и случайным бафтингом, обусловленными неявным
присутствием раствора. Используются пары уравнений движения
(
Ṙi=γ F i+ δ Fi , ω̇ i=γ τ i +δ τ i,
−1 −1

7)
где ω - угловая скорость, сила задается

4
F i=−∂ U /∂ Ri, (8)
момент задается
τ i =−∑ b(α) (α )
i ×(∂U /∂b i ¿)¿, (9)
α

где δ F i и δ τ i - случайная сила и момент с ковариациями, заданными

⟨ δ F i (t )δ F i (t' )⟩=1 δ ( t −t ' ) δij 2 k B T / γ , (1


⟨ δ τ i (t )δ τ i (t' )⟩=1 δ ( t −t ' ) δij 2 k B T / γ r, 0)

где 1 - единичная матрица. Коэффициенты трения для переноса и


вращения задаются γ и γ r , соответственно, k B T - тепловая энергия.
В реализации, вращения твердого тела выполнялись с помощью
кватернионов. Вращения и сдвиги вычислялись с помощью стохастического
метода Рунге-Кутта второго порядка. Применялись периодические
граничные условия для моделирования всей системы. Использовались
сокращенные единицы, в которых диаметр частицы σ =1, k B T - единица
тепловой энергии. Время масштабировалось на t 0 ≡ γ σ 2 /(48 k B T ). В каждой
траектории рассматривается N=1000 субъединиц и выполняется 108 шагов,
обычно с шагом по времени 0,006. Значения всех параметров указаны в Табл.
2. Если единицы длины, σ =2 нми T =300 K , конечное время наблюдения через
10
8
шагов будет равно t obs =227,5 мкс; концентрации субъединиц, C 0,
варьируются от 2,0810-4 до 0,156 моль/л; энергии связей, ε b ,варьируются от
5,4 до 13,2 ккал/моль. Поскольку допустимые времена симуляций меньше,
чем наблюдаемые в типичных экспериментах in vitro (примерно минуты),
концентрации в симуляции значительно выше, чем типичные
экспериментальные значения (~1 – 100 мкмоль/л). Однако, изменение
кинетики симулируемой сборки в зависимости от концентрации и времени
наблюдения означает, что выводы для экспериментальных времен и
концентраций будут аналогичными.

4
Табл. 2. Значение параметров, используемых в динамических
симуляциях. σ - единица длины, k B T - тепловая энергия, γ - постоянная
трения смещения, ур. (7), t 0=γ σ 2 / 48 k B T – единица времени.
Параме
Значение Определение
тр
ε / kB T 1 Параметр энергии WCA, ур. (2)
ε b /k B T 9 – 22 Величина энергии притяжения, ур. (4)
b /σ 2−5 /6 Длина вектора связи
γ r /γ σ 2 0,4 Коэффициент трения вращения, ур. (7)
Максимальный двугранный угол, ур.
ϕ m ( рад) 3,14
(5)
θm ( рад) 0,1 – 3,0 Максимальный угол связи, ур. (5)
L/ σ 11 – 100 Размер симулируемого параллелепипеда
N 1000 Число субъединиц
0,001 –
C 0=N σ L
3 −3
Концентрация субъединиц
0,75
rc / σ 2,5 Расстояние отсечки энергии притяжения
δt /t 0 0,006 Шаг времени
t obs /t 0 6 ×10
5
Конечное время наблюдения, 108 шагов

ТЕРМОДИНАМИКА СБОРКИ КАПСИДА


Равновесные концентрации свободных субъединиц (мономеров) и
промежуточных продуктов сборки могут быть связаны законом
действующих масс

ρn σ 3 =(ρ1 σ 3 )n exp ⁡(−β ∆ Gn ), (11)

где ρn - плотность промежуточного продукта из n субъединиц, σ - размер


молекулы, β=1/k B T - величина, обратная тепловой энергии, ∆ Gn – движущая
сила, образующая промежуточный продукт размера n. Движущая сила
сборки выбирается из соображения, что субъединицы обладают

4
благоприятной энергией ε b при связывании, но также сталкиваются с
энтропийным штрафом, который зависит от количества связей и сети
локальных связей.
Свободная энергия образования единичной связи для получения димера
может определяться вычислением отношения статистических интегралов
двух связанных субъединиц к двум свободным субъединицам, как
q2
q 2
=
1
8π 2∫ [ ( α) (β)
]
d R2∫ d Ω2 exp −βu ( R1 , R2 , {b1 } , {b2 }) H (1 ,2),
1 (12)
где uопределено в ур. (1), Ω2 описывает углы Эйлера 2-й субъединицы,
которые определяют множество ориентаций векторов связей{ b 2 }, H (1 , 2) -
единица, когда u ( R 1 , R2 , {b1α } , {b2β }) ←2 k B T , и ноль в противном случае. Другими
( ) ( )

словами, два капсомера определяются связанными, если их потенциальная


энергия взаимодействия ←2 k B T . Свободные субъединицы берутся в
стандартном состоянии с единичной плотностью и свободным вращением, с
центром системы координат в R1.
Разложение u(1 , 2) до второго порядка по каждой координате в
минимуме потенциала дает
q2
∆ G2=−k B T ln 2
=−ε b −T sb ,
q1 (13)
и

| (1
2 3 7
sb −3 2 πβ ∂ uatt (r ) 1 2β ε π
≈ ln + ln 4 b 2 ,
kB 2 ∂r
2
r=0
2 θm ϕ m 4)
где два слагаемых представляют энтропию переноса и вращения,
соответственно. Результат сравнен с симуляциями Монте-Карло на Рис. 1.

4
Рис. 17.Свободные энергии связывания для димеризации, вычисленные из ур.

и (14) (линия) и симуляций Монте-Карло (точки).

Хотя существует много возможных структур капсидов, согласованных с


много большими значениями n, есть только одна структура, согласованная с
целым капсидом, который имеет n=N c субъединиц ( N c =60 в рассматриваемых
капсидах). Тот факт, что неправильно сформированные капсиды и
промежуточные продукты обычно не наблюдаются означает, что ∆ Gn имеет
острый пик при n=N c ; дефекты, ведущие к большим или меньшим капсидам,
неблагоприятны. Имеется порог плотности, ρcc ,при котором доля субъединиц
в капсидах становится значительной

ln ρcc a3 ≈ β Δ GN /N c.
c
(15)

Свободная энергия завершенного капсида может быть записана как


−N c nb ε b
ΔG N = −T ( N c −1 ) sb (n b),
c
2 (16)
где sb – энтропийный штраф для субъединицы в целом капсиде, где у
каждой субъединицы n b связей. Если пренебречь зависимостью энтропийного
штрафа от числа связей (т. е. положить sb ( nb ) ≈ sb ), можно использовать
уравнения (14)

4
для вычисления ρcc . Значения ρcc для модели капсида B3 (n b=3) с ϕ m =π
(значение, используемое для всех динамических симуляций) показано на Рис.
и сравнивается с кинетическими результатами сборки.

Рис. 28. Критическая термодинамическая концентрация субъединиц для


образования капсида, ρcc , вычисленная из ур. (14)

для модели B3 и ϕ m =π .

КИНЕТИКА СБОРКИ КАПСИДА


Кривые скорости образования капсидов имеют сигмоидальный вид.
Была рассмотрена динамика сборки капсида для модели B3 (см. 24, 25)
при разных концентрациях субъединиц, C 0, рассматриваемых в безразмерных
единицах, C 0=N σ 3 / L3; разных энергиях связывания, ε b; и разных
максимальных углах связывания θm . В приведенных результатах используется
ϕ m =π , эффект от изменения ϕ m аналогичен эффекту от изменения θm , но менее

выражен.
Доля субъединиц в целых капсидах, f c, показана как функция от времени
для нескольких энергий связывания на Рис. (a). Во всех случаях, при которых
происходит значимая сборка, скорость образования капсидов имеет
приблизительно сигмоидальную форму. Это общая особенность реакций
сборки. Имеется фаза начальной задержки, за время которой образуются и
проходят каскад реакций сборки промежуточные продукты, фаза быстрого
роста, во время которой эти промежуточные продукты собираются в целые

4
капсиды. Наконец, рост замедляется, когда мономеры (свободные
субъединицы) заканчиваются, и оставшиеся промежуточные продукты
оказываются не в состоянии соединиться в капсид.

Рис.29. Примеры влияния параметров системы на динамику сборки для


модели B3.

Конечный выход капсидов немонотонно зависит от значений


параметров, но возможно достижение высокого выхода.
Доля субъединиц в целых капсидах, f c в конечный момент времени
наблюдения, t=6 ×10 5, показана на Рис.. При увеличении C 0 , ε b или θ m,
промежуточные продукты образуются и растут быстрее, поэтому выход
капсидов возрастает до 90%, т. е. 15 из 16 возможных капсидов завершаются.
Одним из главных результатов этого исследования является то, что модель
частицы, не включающая гетерогенную нуклеацию или конформационные
изменения, может предсказывать такие высокие выходы капсидов.
Хотя капсиды образуются быстрее при увеличении значений
параметров, насыщение роста также происходит раньше, и выходы капсидов
немонотонны по каждому параметру. Чувствительность выхода капсидов по

4
отношению к параметрам, наблюдаемая на Рис., изображена на Рис. . Также
приведена кинетическая фазовая диаграмма, показывающая парные
зависимости выходов капсидов от параметров системы. Фазы разделены в
зависимости от того, наблюдается ли в них значимая сборка, которая
произвольно определяется как f c ≥ 30 %.

Рис. 30. Изменение параметров модели открывает кинетическую


фазовую диаграмму для модели B3.

Сплошные точки обозначают значения параметров, для которых 30%


субъединиц находятся в завершенных капсидах ( f c ≥ 30 %) за время
наблюдения (t obs), пустые точки показывают значения, при которых f c < 30 %,
пунктирная линия показывает положение критической термодинамической
поверхности, посчитанной в ур. (14).
Немонотонное изменение выхода капсидов при изменении значений
параметров обусловлено конкуренцией между более быстрым ростом
капсида и попаданием в кинетические ловушки.

4
Начальные шаги в сборочном каскаде приводят к образованию
меньшего числа связей, чем более поздние шаги. Если энергия притяжения
этих связей недостаточна, чтобы преодолеть энтропийные потери, начальные
шаги с трудом преодолевают барьер свободной энергии, и потому, медленны.
Для значений параметров, близких к ρcc , (Рис. ) когда половина субъединиц
находится в целых капсидах в равновесии, из того, что целые капсиды имеют
намного больше связей, чем начальные продукты сборки вытекает, что
барьер свободной энергии должен быть в несколько раз больше тепловой
энергии, k B T . Поэтому значимая сборка не происходит за рассматриваемое
конечное время наблюдения, пока значения параметров не станут много
больше критических термодинамических значений. Исходя из этого,
определяется нижняя критическая поверхность, которая ограничивает
области со значимой сборкой снизу и слева на Рис. . Рассматриваются
конечные времена, поскольку реакции сборки капсидов ограничены in vivo
временем расщепления белков и in vitro временем наблюдения.
Увеличение параметров увеличивает общую скорость роста капсидов.
Более высокие концентрации субъединиц, C 0, приводят к более частым
столкновениям субъединиц, более высокие значения θm увеличивают
вероятность связывания при столкновении, более высокие значения энергии
связывания, ε b уменьшают скорость обратной реакции (расцепления
субъединиц). Когда значения параметров пересекают нижнюю критическую
поверхность, более быстрый рост капсидов приводит к значимому выходу
капсидов, как показано на Рис.. Однако, при еще больших значениях, сборка
начинает нарушаться из-за попадания в две кинетические ловушки (см.Рис. ),
и поэтому определяется верхняя критическая поверхность сверху и справа от
областей, в которых сборка кинетически достижима. Из-за этих
кинетических ловушек сборка происходит, только когда энергии связывания
субъединиц значительно меньше значений, вычисленных в работе Reddy et al
[42]. Однако, при включении энтропии связывания (см. ур. (14)),
получившиеся свободные энергии согласуются с константами ассоциации,

4
относящимся к экспериментам по сборке капсидов вируса гепатита B в
работе Ceres, Zlotnick [43].

КИНЕТИЧЕСКИЕ ЛОВУШКИ

Рис. 31. Скриншоты, соответствующие точка на Рис. ,


демонстрирующие две кинетические ловушки. (a) соответствует точке,
отмеченной ромбом, (b) – треугольником.

Представлены результаты для трех времен наблюдений, показывающие,


как расстояние между границами расширяются во всех направлениях при
увеличении времени. Примерная граница кинетически достижимой области
на Рис. является мерой статистической погрешности, которая вызвана тем,
что каждая точка описывает одну стохастическую траекторию. Для
траекторий, пробегающих с различным начальным значением генератора
псевдослучайных чисел для заданных значений параметров, конечное число
готовых капсидов обычно не различается более, чем на единицу, но различия
во время фазы быстрого роста были больше.
Кинетическая ловушка, изображенная на Рис. (a) появляется из-за того,
что начальные шаги сборки проходят слишком быстро, начинается сборка
настолько большого числа капсидов, что запаса свободных субъединиц и
малых промежуточных продуктов не хватает, чтобы завершилась сборка
4
значимого числа капсидов. Если оставшиеся частичные капсиды имеют
несовместимую геометрию, дальнейшее связывание потребует
предварительной разборки. Эта кинетическая ловушка наблюдалась в
экспериментах и была предсказана теоретически (правда, только для
ситуации, когда допускается присоединение только отдельных субъединиц).
Описанная кинетическая ловушка может не ограничить рост in vivo,
когда имеется непрерывное подпитывание новых белков капсида. Однако
связывание субъединиц в конфигурации, несогласованные с целым капсидом
(некорректное связывание) может привести к кинетической ловушке, которая
может нарушать сборку даже при неограниченном количестве субъединиц.
Заметим, что подход с уравнением скорости, который предполагает заведомо
определенные траектории сборки, неспособен выявить такую ловушку.
Неудивительно, что некорректное связывание случается чаще при
увеличении θm , поскольку в этом случае движущая сила, направляющая
систему в конфигурацию с минимальной энергией, слабее. Но, как
показывают исследования Бергера, увеличение концентрации и энергии
связывания может стабилизировать субъединицы с деформированными
связями, и при этом бо΄льшая скорость роста капсидов будет достигнута,
прежде чем некорректно связанные субъединицы станут причиной
кинетической ловушки. Поскольку имеется так много траекторий сборки, не
приводящих к целым капсидам при этих значениях параметров,
конфигурация с минимальной энергией с целыми капсидами редко
реализуется, и некорректные капсиды со спиральными или
многоголовочными конфигурациями преобладают, как показано на Рис. (b).
Развитие их этого состояния до целого капсида исключительно медленно,
поскольку требуется разбиение большого числа связей. Было бы сложно
оценить значимость конфигураций, показанных на Рис. (b), с моделями,
использующими предопределенные траектории сборки.
Капсиды B5 растут преимущественно за счет присоединения отдельных
субъединиц, соединение кластеров обязательно для сборки капсидов B3 и B4.

4
Изменения конечного выхода капсидов в зависимости от ε b для типов
капсидов B3, B4 и B5 показаны на Рис. (a). Хотя сборка происходит при
различных диапазонах ε b для каждого типа, кинетика внутри этих диапазонов
аналогична, как видно на Рис. (b). Оптимальная сборка ( f c ≈ 0,9) для каждого
типа достигается примерно при одном и том же значении n b ε b ≈ 50 , означая,
что целые капсиды примерно одинаково устойчивы. Изменения сборки в
зависимости от C 0 или θm также аналогичны для всех типов капсидов.

Рис. 32. Кинетика сборки аналогична в типах капсидов B3, B4 и B5.

Хотя способность к спонтанной сборке аналогична для всех типов


капсидов, механизм сборки вблизи оптимального значения для B5
качественно отличается от механизма для B3 и B4. Были вычислены
механизмы сборки из симуляций сведением в таблицу размера n b e
наименьшего промежуточного продукта, участвующего в каждом событии
соединения или разъединения. Общий вклад в рост капсида промежуточных

4
продуктов размера n b e, b net (n be ), показан для каждого типа капсида на Рис. .
Хотя примерно 33% субъединиц собирались в кластеры (n be >1) для капсидов
B3 и B4, на связывание кластеров пришлось только 6% всех реакций
связывания для капсидов B5. При превышении параметрами оптимальных
значений, образование малых промежуточных продуктов становилось более
быстрым, и связывание кластеров приобретало большее значение для всех
типов капсидов.

Рис. 33. Влияние типа капсида на механизм можно понять


рассмотрением траекторий сборки доступных, если рост происходит только
за счет присоединения мономеров, как показано на Рис. .

Как только происходит образование димера для B5, все последующие


мономеры могут присоединяться так, что образуются две и более связей. Для
оптимальных значений параметров, образование единичной связи
неблагоприятно из-за энтропийных потерь, но образование двух и более
связей благоприятно. Следовательно, примерное математическое ожидание
свободной энергии в зависимости от размера кластера, показанное на Рис. ,
монотонно уменьшается после образования димера. Заметим, что эти

4
свободные энергии сравнивают относительную устойчивость различных
кластеров. Также имеются непоказанные барьеры свободной энергии,
связанные с соединением и разъединением субъединиц, требующиеся для
перехода между этими состояниями.

Рис. 34. Примеры путей сборки.

Рис. 35. Зависимость свободной энергии от числа частиц в капсиде.

Для архитектур B3 и B4 невозможно построить траекторию сборки, для


которой мономеры образуют множественные связи при всех размерах
кластеров больше двух субъединиц. Профили свободных энергий,
согласованные с этими архитектурами, показаны на Рис. и имеют
многочисленные барьеры свободной энергии и локальные минимумы. Шаги,

4
которые переходят через эти барьеры присоединением мономеров с
образованием одной связи, сравнимо по скорости с первым шагом сборки,
образованием димера. Злотник показал, что промежуточные продукты
накапливаются, когда шаг, ограничивающий скорость следует за
метастабильными видами, или, когда энергии ассоциации или концентрации
высокие и начальные шаги сборки (шаги нуклеации) сопоставимы по
скорости с поздними шагами (шагами элонгации). Однако, как показано на
Рис. , некоторые промежуточные продукты могут связываться с другими
таким образом, что избегается образование единичных связей.
Следовательно, поздние шаги траекторий, включающие эти шаги связывания
кластеров быстрее начальных шагов, и промежуточные продукты не
накапливаются для значений параметров, рассматриваемых на Рис. .
Например, тримеры – преобладающий промежуточный продукт сборки для
B4, но доля субъединиц в триммерах всегда мала по сравнению с долей
субъединиц в мономерах или целых капсидах (см. Рис. ).

Рис. 36. Массовая доля мономеров, триммеров, целых капсидов как


функция от времени для модели B4.Используются параметры из Рис.

В поддержку гипотезы, что шаги связывания кластеров необходимы,


чтобы избежать накопления промежуточных продуктов для B3 и B4,
рассмотрена кинетическая модель, в которой только мономеры могут

4
присоединяться к растущим капсидам. В этой модели разрешены только
промежуточные продукты с минимальной энергией и недеформированными
связями. Мономеры присоединяются или отсоединяются от промежуточных
продуктов стохастически со средними скоростями связывания и
разъединения, удовлетворяющими уравнению детального равновесия.
Динамика сборки, предсказанная для этой модели для B5 согласуется с той,
что мы видели в симуляциях броуновской динамики. Однако концентрации
промежуточных продуктов в локальном минимуме свободной энергии
построены для B4, как для моделей в работе Endres, Zlotnick. Поскольку эти
промежуточные продукты не могут связываться друг с другом, кинетическое
уравнение предсказывает, что сборка будет значительно менее эффективной,
чем для симуляций броуновской динамики. Результаты говорят о том, что
может быть важно учитывать связывание кластеров, а не только отдельных
субъединиц при построении гипотез о механизмах сборки из
экспериментальных данных.
Для многих вирусов базовыми единицами сборки можно положить
малые промежуточные продукты, такие как димеры или тримеры.
Экспериментально наблюдаемые концентрации этих видов во время сборки
говорят, что они образуются быстро и обладают высокой
метастабильностью. Эта особенность может быть включена в иодель
разработкой новой субъединицы, представляющей базовую единицу сборки,
или выбором более высоких энергий связывания для соответствующих
векторов связей. В рассматриваемой модели все максимальные энергии
связывания равны, и важность связывания кластеров для капсидов B3 и B4 не
является результатом взаимодействия между отдельными субъединицами.
Вместо этого, общие взаимодействия многих субъединиц приводят к
профилю свободной энергии с многочисленными локальными минимумами,
который заставляет траекторию сборки проходить через связывание
кластеров. Хотя связывание триммеров и других кластеров необходимо для
сборки B4 в симуляции, доля субъединиц, содержащихся в этих

4
промежуточных продуктах, всегда мала по сравнению с долей субъединиц в
мономерах или целых капсидах (см. Рис. ). Следовательно, значимость
связывания кластеров было бы трудно определить только в экспериментах,
таких как рассеяние света или эксклюзионная хроматография. Комбинация
этих техник с выборочным удалением остатков или экспериментов над
отдельными молекулами, впрочем, может дать объяснение важности
различных субъединиц в сборке капсидов.
Капсиды метастабильны в бесконечно малой концентрации, разборка
капсидов проявляет гистерезис.
Поскольку даже одного вириона может быть достаточно, чтобы заразить
клетку, вирусные капсиды должны быть метастабильными в бесконечно
малой концентрации. Капсиды в модели демонстрируют эту особенность,
например, значимая сборка при C 0=0,008 не происходит для ε b< 20,0, (см. Рис. )
но изолированные целые капсиды симулируемые с периодическими
граничными условиями (для имитации бесконечно малой концентрации)
являются метастабильными при t=6 ×10 5 для ε b ≥ 14,0. Это показывает, что
конечный выход капсидов при некоторых значениях энергий связывания
будет различаться для траектории, начинающейся с почти собранного
капсида и траектории, начинающейся со случайных конфигураций
субъединиц (Рис. ). Другими словами, имеется гистерезис между сборкой и
диссоциацией. Гистерезис происходит, потому что могут быть большие
барьеры свободной энергии, разделяющие ранние этапы сборки, когда на
субъединицу приходится мало связей, и целыми капсидами, у которых на
субъединицу приходится n b связей. Поэтому мономеры (или целые капсиды)
могут быть метастабильными на конечной траектории выше (или ниже) ρcc .
Как только первая субъединица будет удалена из метастабильного целого
капсида, ближайшие субъединицы потеряют часть связей, и дальнейшая
разборка пойдет быстро. Гистерезис в сборке-разборке капсидов наблюдался
в экспериментах Злотника.

4
Рис. 37. Выход капсидов, как функция, зависящая от ε b, показывает
гистерезис между ассоциацией и диссоциацией.

ПРИЛОЖЕНИЕ
Уравнения движения, заданные в ур. (7), интегрируются следующим
образом. Ориентации векторов связей определяется в привязанных к частице
координатах до симуляции. Координаты, привязанные к пространству, { b(tα )} ,
определяются из матрицы вращения, A(t ), изменение которой в зависимости
от времени определяется с помощью кватернионов, которые удовлетворяют
уравнению движения. Это уравнение требует задание угловых скоростей, ω,
которые вычисляются аналогично смещениям

ω i=2 γ r−1 ( τ ia+ τ bi ) + δ τ i , (17)

где моменты вычисляются в двух точках

a b b b
(
τ i (t)≡τ i ({ Ri ( t ) , b(t) }), τ i (t)≡τ i ({ Ri ( t ) , b (t )}),
18)
где прогнозируемые позиции определяются как
b −1
Ri =Ri +δt (γ Fi + δ F i ). (19)
Прогнозируемые ориентации связей {b b (t) } определяются из
прогнозируемой матрицы вращения, вычисленной по прогнозируемым
угловым скоростям как

4
ω bi =γ r−1 τ ai + δ τ i. (20)

Такая формулировка предполагает, что субъединицы гидродинамически


изолированы, и что источники трения, связанные с вращением и переносом
не сцеплены.
Вклад связывания кластеров в конечный продукт сборки вычислялся в
симуляциях следующим образом. Кластеры обозначались количеством
субъединиц, соединенных одной или более связями. Событие связывания
происходило, когда менялся размер кластера или при объединении двух
кластеров (положительное связывание), или разделением кластера
(отрицательное связывание). Размеры кластеров выводились через каждые 10
шагов, т. к. более одного события связывания для одного кластера за 10
шагов происходило крайне редко. Размер события связывания, n be,
определяется как размер наименьшего кластера, участвовавшего в реакции
для положительного связывания или размер меньшего продукта при
отрицательном связывании. Общее количество связываний, вызванное
событиями размера n be задано формулой

b net ( nbe )=n be ¿,


(21)
где b+ ¿¿ и b−¿¿ - количества положительных и отрицательных событий
связывания размера n be, соответственно.
Свободная энергия,
(
[ ] ( )
ni 3
−b j ε b π σ C0
∆ gi =∑ −( n i−1 ) T [k B ln + s b (1)],
j=1 2 6 22)
где сумма берется по всем субъединицам в капсиде, ni - число
субъединиц в конфигурации i, b j - число связей для субъединицы j. Берется
математическое ожидание свободной энергии по числу субъединиц в капсиде
n суммированием по конфигурациям, содержащим n субъединиц
Gn=−k B Tln ∑ δ n ,n exp ⁡( −β ∆ g i).
i (23)
i

4
Суммирование выполнено с помощью симуляций Монте-Карло, в
которых пробные конфигурации капсидов генерировались добавлением или
удалением субъединиц из текущих конфигураций, а затем принимались или
отклонялись согласно критерию Метрополиса с больцмановским
распределением, заданным уравнением. Рассматривались только
конфигурации, согласованные с минимальной энергией связывания, поэтому
подход применим только для параметров, при которых некорректные
капсиды не собираются. Средняя свободная энергия капсидов размера n
эффективно вычислялась выполнением зонтичного измерения, в котором
использовался гармонический потенциал как функция от размера капсида
для смещения числа субъединиц в капсиде [44].

АНАЛИЗ КИНЕТИКИ СБОРКИ ВИРУСНЫХ КАПСИДОВ,


ОСНОВАННЫЙ НА МОДЕЛИРОВАНИИ
Сборка вирусных капсидов или других сферических полимеров –
пустых замкнутых структур, состоящих из сотен белковых субъединиц плохо
понятна. Существует модель, основанная на каскаде низкоуровневых
реакций, позволяющая произвести кинетические симуляции. Поведение
модели отражает кинетику сборки, наблюдаемую в растворе. Представлено
два примера общей модели, описывающие икосаэдральные и
додекаэдрические капсиды. Показано, как получить устойчивые оценки
параметров сборки из доступных экспериментальных данных. Эти
параметры, размер ядра, средняя скорость нуклеации и средняя свободная
энергия ассоциации могут быть определены при измерении изменений
субъединиц и капсидов в зависимости от концентрации и времени.
Приведены математические выводы анализа, сделанные из общей модели.
Объяснение сборки капсидов довольно обобщенное, примеры могут быть
изменены для имитации различных биологических систем.
Накопление капсидов показывает сигмоидальную кинетику, типичную
для многоступенчатых реакций. За время фазы начальной задержки
успешные промежуточные продукты временно накапливаются и затем
4
используются в последующих реакциях. Однако, без регуляции, реакция
сборки склонна к попаданию в кинетические ловушки. Были предложены
несколько регулирующих механизмов, уменьшающих склонность к
попаданию в кинетические ловушки. Автостерия, в которой свободные
субъединицы находятся в равновесии между состояниями готовности и
неготовности к сборке, ее разновидность использовалась в модели
квазиэквивалентной сборки с локальными правилами. Здесь регуляция
входит в нуклеацию включением «кинетического ограничения» раннего шага
в реакции, где первые несколько промежуточных продуктов собираются
медленно, или неустойчивы. Нуклеация наблюдалась в сборке капсидов,
структура-ядро может быть целой вершиной или замкнутым кольцом из
субъединиц. Эти и другие механизмы регуляции могут быть включены в
общие модели.
В максимально общем виде модель допускает присваивание различных
скоростей и/или порядков для каждого каскада сборочных реакций.
Табл. 3. Обозначения констант и переменных
N число субъединиц в целом капсиде
[N] концентрация капсидов
[m] концентрация m-го вида
[u] концентрация субъединиц
u0 начальная концентрация субъединиц
nuc число субъединиц в ядре
вырождение (количество лежащих в одной плоскости
j
симметрий вращения) отдельной субъединицы
c число контактных позиций в субъединице
число межсубъединичных контактов в m-м промежуточном
cm
продукте
C число межсубъединичных контактов в целом капсиде
K Acap константа ассоциации для целого капсида, выраженное в M − N
K Acon константа ассоциации для одного субъединичного контакта

4
микроскопическая константа прямой скорости для реакций
f elong
элонгации
микроскопическая константа прямой скорости для реакций
f nuc
нуклеации
статистический коэффициент, вырождение прямой реакции,
sm
приводящей к m-у виду
статистический коэффициент, вырождение диссоциации m-го
σm
вида
bm постоянная обратной скорости для диссоциации m-го вида
отношение f nuc / f elong постоянных прямых скоростей, для
ν реакций нуклеации
ν≪1
[m] ∞ концентрация m-го вида при равновесии, t=∞
явная константа диссоциации, значение [u]∞, для которого
K Dapp
[N ]∞=[u]∞
Km константа равновесия для [ m ] /([m−1][u ])

МЕТОДЫ
Моделирование сборки капсида в равновесии

Рис. 38. Геометрии капсидов. (А) Додекаэдрическая модель капсида из


12-и пятиугольных субъединиц. (B) Икосаэдральная модель капсида из 30-и
парных симметричных субъединиц.
4
В симуляциях используются две модели капсидов (см. Рис. 38). Первая
модель, изначально разработанная без нуклеации как равновесная (EQ)
модель, состоит из 12 пятивалентных пятиугольных субъединиц,
собирающихся как грани додекаэдра за счет 30 межсубъединичных
контактов. Такая геометрия отражает четвертичную структуру
пикорнавирусов. Вторая система построена из 30 четырехвалентных
прямоугольных субъединиц (образующих 60 межсубъединичных контактов),
ее можно считать T=1 икосаэдром, построенным из димеров.
Четырехвалентные субъединицы отражают геометрию, используемую в
схематичных представлениях димеров капсида вируса гепатита B.
Чтобы описать полимеризацию капсида, разработана система
скоростных уравнений для концентраций видов, образующихся в каскаде
сборки (37). Уравнения определяются геометрией капсида, траекторией
сборки и энергиями межсубъединичного связывания. В равновесии,
дифференциальные скоростные уравнения превращаются в системы
алгебраических уравнений, из которых можно определить равновесные
значения для субъединицы, капсида и промежуточных продуктов. В самой
простой модели в равновесии только мономер и капсид присутствуют в
заметных концентрациях. Равновесное отношение между конечными
точками каскада реакций:
[N ]∞
K Acap= N , (24)
[u ]∞

где N – число субъединиц в целом капсиде, например, N = 12 в


додекаэдральном, и N = 30 в икосаэдральном капсиде.
Уравнение (24) дает результат в неудобных единицах M 1−N для
константы ассоциации K Acap. Более удобными выражениями являются K D app,
прямая константа диссоциации, определенная при равновесной
концентрации капсидов и субъединиц (25), и K Acon ,парная (на контакт)
константа ассоциации между субъединицами (26). Поскольку N обычно

4
велико, практичнее использовать логарифмическую форму уравнений,
включающих K Acap, при работе с численными данными.
K D app =( K Acap)1 /(1− N) . (25)
Подстановки через последовательность уравнений модели в равновесии
дают K Acap как произведение 1) статистического коэффициента,
рассчитанного для общего вырождения реакции, 2) степени K Acon для каждого
контакта, образуемого при сборке капсида. Это может быть записано в
общем виде для сборки полиэдральной структуры из N субъединиц с c
контактами на субъединицу, где каждая субъединица имеет j-кратное
вырождение. Такая N-эдральная структура имеет всего C=cN /2 контактов,
приводя к общему виду, где j
N−1
/N - произведение статистических
множителей для вырождения компонентов реакции (26).
j N−1
K Acap= ( K Acon)c . (26)
N
Отдельные статистические факторы могут быть определены явно для
каждого шага сборки. Применяя последнее уравнения к додекаэдральной и
икосаэдральной моделям, получаем
511
K Acap= (K Acon)30 додекаэдральная модель
12 (2

K Acap=
2
29
(K Acon)60 икосаэдральная модель
7)
30
В общем, равновесное состояние описывается системой скоростных
уравнений с производными, равными нулю. Для моделей, имеющих одну
конформацию для каждого размера промежуточного продукта, полученная
алгебраическая система легко решается обратной подстановкой и дает
равновесные концентрации всех видов.
s2 ∙∙ ∙ s m C m
[m] ∞= K Acon [u]∞,
m
(28)
σ 2 ∙∙ ∙ σ m

где C m задает общее число межсубъединичных контактов, образуемых


при сборке m-х видов (состоящих из m субъединиц). Для моделей,

4
включающих несколько траекторий, это выражение представляет
усложненную зависимость от K Acon и вырождения.
В принципе, K Acon может быть не одинаковым для всех взаимодействий.
Например, K Acon, используемое для взаимодействий нуклеации, должно быть
меньше, чем используемое для контактов, устанавливаемых во время
элонгации. Если это простой энтропийный штраф, следовало бы ожидать, что
штраф будет возмещен, когда ядро соберется. Для простоты, для всех
реакций используется одинаковое значение K Acon.

МОДЕЛИРОВАНИЕ КИНЕТИКИ СБОРКИ


Описанная модель сборки допускает вычисление кинетики сборки при
дополнительных предположениях. Для простоты полагаем, что каждому
контакту сопоставляется одинаковая энергия ассоциации на контакт, ∆ Gc , из
которой мы определяем K Acon через отношение Аррениуса ∆ Gc =−RT ln K Acon.
Во-вторых, вычисления ограничиваются только двумя микроскопическими
константами прямых скоростей для нуклеации ( f nuc) и элонгации ( f elong),
которые модифицируются соответствующими статистическими
коэффициентами. В-третьих, сборка ограничивается только добавлением
отдельных субъединиц, без (псевдо)высокоуровневых шагов элонгации.
Наконец, должны быть сделаны некоторые предположения относительно
выбора траекторий сборки, используемых в кинетических симуляциях:
типичный капсид может иметь сотни или тысячи возможных траекторий
сборки, проходящих через десятки и сотни промежуточных продуктов.
Однако, первая и последняя реакции в сборке капсида имеют малое
вырождение, наибольшее вырождение встречается, когда сборка завершена
наполовину.
Есть две очевидные стратегии для ограничения количества траекторий,
используемых в модели: 1) использование «лучших» путей и 2)
использование «среднего» пути. В первой стратегии определяется мера
«значимости», или вероятность траектории. Во второй определяется только
один промежуточный продукт каждого размера, «средний» промежуточный
4
продукт этого размера. Оба этих пути следуют линии наискорейшего спуска
по энергии, причем нет энергетических минимумов, отличных от целого
капсида; эти траектории близки к гладкой линии наискорейшего спуска на
энергетической поверхности.
Одна из реализаций стратегии лучшей траектории – использование
траекторий, проходящих через максимально устойчивые промежуточные
продукты, msi-мера. Например, обычно есть две конфигурации тримера –
открытая (линейная) и замкнутая (треугольная). Известно, что геометрия
субъединицы допускает обе конфигурации, закрытая конфигурация обладает
меньшей энергией, чем открытая, поскольку имеет одну дополнительную
единицу энергии контакта. Msi-мера назначает меру 1 путям, выходящим из
самых устойчивых промежуточных продуктов, и 0 остальным, удаляя их.
Msi-мера используется для выбора промежуточных продуктов в
додекаэдральной модели. По-прежнему, для учета вырождения нужны
статистические коэффициенты.
В стратегии «среднего пути» энергия и вырождение распределены
равномерно среди шагов вдоль одной траектории сборки, которая может
быть, а может и не быть действительной траекторией. Хотя разработана
версия икосаэдральной модели с msi-мерой, поведение msi модели
незначительно отличается от версии со средней траекторией по отношению к
концентрациям капсидов ([N]) и субъединиц ([u]). При создании среднего
пути имеется 29 реакций, по которым распределяется энергия 60-и
контактов. Шаг димеризации дает только дает только одну единицу энергии,
т. к. имеет только один контакт. Следующие 26 шагов назначают по две
единицы энергии (два межсубъединичных контакта на ассоциацию
субъединицы), поскольку действительные траектории образуют от одного до
трех контактов за шаг. Последние две субъединицы образуют три и четыре
контакта при ассоциации и им назначаются три и четыре единицы энергии,
соответственно. Вырождение реакции распределено аналогичным образом.

4
Кинетика сборки симулируется как концентрации видов [u], [2], …, [N],
меняющиеся согласно дифференциальным скоростным уравнениям (37), из
которых выделен типичный пример.
d [m]
=f m sm [ u ][ m−1 ] −f m +1 sm +1 [ u ][ m ] +b m+1 [ m+1 ] −b m [ m]
dt (29)
Это уравнение учитывает вклады ассоциации субъединицы с
промежуточным продуктом (прямое f-слагаемое) и диссоциации (обратное b-
слагаемое) в кинетику m-го промежуточного продукта. Статистические
коэффициенты sm и σ m подстраивают скорости для учета вырождения
реакций. Константа обратной скорости для m-й реакции
fm
b m=σ m r (30)
(K Acon )

вычисляется из прямой скорости ( f m), энергии на контакт (из K Acon), числа


контактов r, разбиваемых при диссоциации m-й субъединицы, и вырождения
обратной реакции σ m.
Система скоростных уравнений (37), полученная из описанной
формализации, не поддается точному решению. Решения были посчитаны с
помощью BERKELEY MADONNA c численными методами интегрирования
RK4 или метода Rosenbrock, и реализации Waterloo MAPLE интегратора
RKF45.

ОБЗОР КИНЕТИКИ СБОРКИ

Рис. 39. Кинетика сборки, посчитанная для икосаэдральной модели.

4
Сигмоидальная кинетика, демонстрируемая сборкой капсида (Рис. 39),
типична для синтеза продукта любой многоступенчатой реакции. Для сборки
капсида три этапа кинетики (задержка, быстрая сборка, асимптотика) могут
быть связаны с хорошо определенными характеристиками каскада реакций.
Фаза начальной задержки характеризуется последовательным
построением промежуточных продуктов сборки. Каждый промежуточный
продукт достигает пиковой концентрации и затем его концентрация
медленно снижается к равновесной. Пока первый промежуточный продукт не
начнет подходить к своей пиковой концентрации, капсиды производятся
очень медленно. Фаза задержки может быть охарактеризована как начальный
интервал, за который собирается «сборочная линия» промежуточных
продуктов, близкая к устойчивому состоянию. В реакциях с компонентами
элонгации и нуклеации, скорость элонгации явно влияет на длительность
задержки.
Во время быстрой фазы кинетики происходит взрывной синтез
капсидов, т. к. свободные субъединицы взаимодействуют с промежуточными
продуктами, что дает почти устойчивое превращение массы свободных
субъединиц в массу капсидов. Быстрая скорость синтеза капсидов
поддерживается относительно высокими концентрациями свободных
субъединиц и промежуточных продуктов. Во время этой фазы концентрации
промежуточных продуктов сохраняются почти постоянными. Скорости
нуклеации и элонгации дают вклад в наклон этой части кинетической
траектории.
Получается, что вырождение пути сборки не является важной
проблемой для симуляций, в которых концентрации промежуточных
продуктов низки. Различные пути сборки ведут к малым изменениям
концентрации различных промежуточных продуктов, но не субъединиц и
капсидов. Обратные реакции несущественны в шагах элонгации до тех пор,
пока реакции не достигнут равновесия. Поскольку все реакции сборки
задействуют одну субъединицу за раз при почти одинаковых прямых

4
скоростях, все возможные траектории занимают приблизительно одно и то
же время, хотя некоторые траектории более вероятны, чем другие.
Асимптотическая фаза наступает, когда истощение запаса свободных
субъединиц становится значительным. Низкая концентрация субъединиц
вызывает низкую скорость образования ядер, что является главным
регулирующим фактором в синтез капсидов.
Концептуально, нуклеация происходит, когда первые несколько
промежуточных продуктов в последовательности реакции менее устойчивы,
чем последующие продукты. Нуклеация сферического полимера может
зависеть от образования примитивной замкнутой структуры, такой как
первая грань или вершина полиэдра. Энергетически, реакции нуклеации
могут отделяться от последующих реакций элонгации более медленной
прямой скоростью и (или) меньшей энергией ассоциации. Для простоты,
выбран отделенный по скорости шаг нуклеации, поскольку результаты
незначительно зависят от механизма отличий элонгации от нуклеации.
Симуляции реакций менее подвержены попаданию в кинетические
ловушки, когда сборка регулируется шагом нуклеации. Реакции нуклеации
могут дать почти равновесные концентрации капсидов без попадания в
ловушку, несмотря на относительно высокие энергии ассоциации, высокие
начальные концентрации субъединиц и большие скорости. Устойчивость к
кинетическим ловушкам приводит к предотвращению перенасыщения
сборки. Поскольку прямая скорость пропорциональна концентрации
субъединиц, когда концентрация субъединиц слишком высокая, практически
все субъединицы собираются в промежуточные продукты при отсутствии
шага регуляции. В реакциях нуклеации, или в реакциях, «автостерично»
регулируемых устойчивостью пригодных и непригодных к сборке форм
субъединиц, несвязанная субъединица содержится в резерве. Введение
непригодных к сборке подвидов является не более чем формальным
добавлением медленного начального шага реакции первого порядка. С
математической точки зрения неудивительно, что эти механизмы

4
ограничивают попадание в ловушку, поскольку вводят медленные
координаты в ранние уравнения каскада сборки.

НУКЛЕАЦИЯ И ЛИНИЯ СБОРКИ В УСТОЙЧИВОМ СОСТОЯНИИ


При отсутствии регулирующего шага, успешная сборка требует баланса
между концентрацией белка и энергией ассоциации. При увеличении
близости контакта, K Acon, или начальной концентрации субъединиц, u0,
количество субъединиц в линии сборки возрастает. Во время фазы быстрой
сборки субъединицы можно считать превращающимися через сборочную
линию «напрямую» из свободного в связанное в капсиде состояние.
Концентрации промежуточных продуктов находятся в почти устойчивом
состоянии. Когда K Acon или u0 слишком велико, сборка перенасыщена,
слишком большая масса включена в сборочную линию, из-за этого реакциям
не хватает свободных субъединиц, что приводит к кинетической ловушке.
Наоборот, слишком малая масса в сборочной линии приводит к медленной
реакции, которой не хватает промежуточных продуктов. Поскольку
производство капсидов медленно из-за той или иной крайности, имеется
оптимальная концентрация промежуточных продуктов для устойчивого
состояния для K Acon при некотором значении u0 (Рис. 41).
В сборке с нуклеацией концентрация свободных субъединиц падает
более медленно, чем при сборке без регулирующего шага. Сборка с
нуклеацией устойчива по отношению к кинетически ловушкам, но не
невосприимчива к ним. Степень устойчивости зависит от разделения между
фазами нуклеации и элонгации. Например, если отношение констант прямой
f
nuc
скорости f < 0,001, сборка может быть исключительно устойчива к
elong

f nuc
попаданию в ловушку, если f > 0,05, реакция отражает EQ сборку и может
elong

легко попасть в ловушку. Более слабая энергия контакта для реакций

4
нуклеации усиливает устойчивость сборки с нуклеацией к кинетическим
ловушкам.

Рис. 40. Изотерма сборки для икосаэдральной модели. Массовая доля


капсидов - сплошная линия, массовая доля свободных субъединиц –
пунктирная линия.

Рис. 41. Энергия на контакт, ∆ Gc , посчитанная при K Acap, наблюдаемой в


конце симуляций для додекаэдральной (пустые значки) и икосаэдральной
модели (закарашенные значки). Использовались
−1 −1 6 −1 −1
f nuc=100 М с , f elong =10 М с .

Константы ассоциации вычислялись из уравнений (24), (25) и


преобразовывались в единицы энергии с помощью ∆ Gc =−RT ln K Acon, где
T =298 К , R – газовая постоянная, равная 1,897 кал ∙ К−1 ∙ моль−1. Симуляции для

модели 12-меров соответствуют -2,5 (круги), -2,7 (квадраты) и -3,4

4
(треугольники) ккал/моль. Симуляции для модели 30-меров были посчитаны
для ∆ Gc -3,4 (круги), -4,1 (квадраты) и -4,8 (треугольники) ккал/моль.

ЯВНАЯ K D И ПСЕВДОКРИТИЧЕСКАЯ КОНЦЕНТРАЦИЯ


При увеличении u0 равновесная концентрация капсидов быстро
возрастает из-за высокой степени ур. (24). Как показано на Рис. 40, точна
максимальной чувствительности к изменению u0 хорошо аппроксимируется
K Dapp (ур. (25)), концентрации субъединиц, при которой равновесные

концентрации капсидов и субъединиц равны. Поскольку K Dapp вычисляется на


молярной основе, начальная концентрация, требуемая для достижения K Dapp
равна ( N +1) K Dapp. В этих моделях K Dapp - псевдокритическая концентрация
(Рис. 40). Из ур. (24) ясно, что концентрация свободных субъединиц [u]∞
будет изменяться, хотя медленно, для u0 ≫(N +1)K Dapp. Поскольку [u]∞
увеличивается медленно как функция от u0, создается видимость постоянной
[u]∞, приближаемой K Dapp.

K Acon может быть оценено с помощью кинетических траекторий на

больших временах.
Реакция должна находится в равновесии для точного определения
энергии ассоциации, хотя кинетические симуляции реакции сборки вирусов
достигают равновесия асимптотически (см. Рис. 39). Проведены симуляции
на длительных временах для наблюдения, как близко они подходят к
состоянию равновесия и проверки оценок парной энергии ассоциации, ∆ GC .
Реакции симулировались для диапазона значений K Acon. Для любой
фиксированной концентрации, реакции при умеренной K Acon быстро
достигают равновесия, при бо’льших значениях реакции склонны к
попаданию в ловушку. Попадание в ловушку происходит, когда
концентрации реактантов так малы, что бимолекулярные реакции не
протекают с значимой скоростью.
Когда кинетика сборки достигает равновесия, концентрация капсидов
изменяется очень медленно. Примерные значения ∆ GC вычислялись с
концентрациями капсидов [N] и субъединиц [u], измеренных за длительное
4
время при их равновесных значениях в ур. (24), (26), (27). Промежуточные
продукты не включались в эти вычисления, чтобы сделать результаты более
«реалистичными», поскольку концентрации промежуточных продуктов
ожидаются такими малыми, что их нельзя определить. В длительных
симуляциях с умеренной K Acon оцениваемая энергия на контакт, ∆ GC была
найдена с точностью до 10%. Оценки для реакций с бо’льшими энергиями
ассоциации дают худшие аппроксимации, поскольку эти реакции
нарушаются, когда начинает ощущаться недостаток субъединиц и
промежуточных продуктов в течении длительного времени. Это происходит
из-за того, что большая K Acon отвечает очень низкой равновесной
концентрации субъединиц, [u]∞ (ур. (24) и (26)), так что реакции достигают
состояния недостатка субъединиц и останавливаются, не достигая
равновесия. Оценка ∆ GC несколько более точная при малом начальном числе
субъединиц даже при том, что более высокие начальные концентрации
субъединиц дают более высокую молярную долю капсидов. Это выглядит
непонятным в свете остановки из-за недостатка субъединиц, однако, это
просто результат того, что u0 ближе к[u]∞, когда u0 мало. Для додекаэдральной
модели оценка получается точнее, чем для икосаэдральной (Рис. ), поскольку
геометрия субъединиц дает меньшую K Dapp для заданной ∆ GC , как можно
видеть из ур. (25) и (27).

K Dapp ≈ 0,27 K Dcon додекаэдральная модель


5,5
(

K Dapp ≈ 0,21 K 2Dcon икосаэдральная модель 31)

В любом случае, K Dapp намного ниже, чем 0,2 мкмоль приведет к

останову реакции.
Скорость нуклеации может быть определена из скорости образования
капсидов.
Шаг регуляции глубоко влияет на кинетику сборки. Для сборки с
нуклеацией размер ядра и скорость нуклеации должна приниматься во

4
внимание. Рассматривается случай, когда нуклеация протекает от медленной
ассоциации субъединиц к образованию метастабильного ядра.
Когда реакция достигает асимптотической фазы, сборочная линия
промежуточных продуктов все еще находится в активном состоянии, хотя
скорость производства капсидов падает. Поскольку каждое новое ядро
входит в сборочную линию и проходит ее, образуя ядро, утверждается, что
скорость образования капсидов пропорциональна скорости образования ядер.
Более точно, константа средней прямой скорости для шагов нуклеации
пропорциональна скорости образования капсидов, деленной на [u]nuc . Это
выражается в виде
d [N ] nuc
≈ f nuc s nuc K subnuc [ u ] , (32)
dt
где K subnuc - равновесная константа для образования [nuc – 1]. Значение
K subnuc является коэффициентом в ур. (28). Можно прийти к ур. (32), поскольку

в сборке с нуклеацией 1) реакции элонгации обязательно однонаправлены, 2)


начиная с относительно раннего времени, промежуточные продукты ядра
оказываются почти в своих равновесных концентрациях. Ур. (32)
выполняется при ранних временах в асимптотической фазе, до того, как
промежуточные продукты в сборочной линии начнут разбираться. При этих
условиях, почти каждое образованное ядро приводит к формированию
целого капсида, т. е. скорость образования капсидов примерно равна прямой
скорости образования ядер.
При заданном размере ядра геометрия ядра и статистические
коэффициенты могут быть выведены. Значение K subnuc может быть вычислено
из K Acon и статистических коэффициентов. Ур. (32) тогда становится
уравнением с одной неизвестной - f nuc. На Рис. 42 показано отношение
d [N ] nuc
/[u ] , (33)
dt
посчитанное с использованием трех значений f nuc. Рис. 42 отражает
влияние уменьшения прямой скорости нуклеации на это отношение.
Значение отношения не зависит от концентрации после того, как реакция

4
достигает устойчивого состояния. Высота плато в каждом случае равна
константе прямой скорости, f nuc, умноженной на K subnuc . Нужно обратить
внимание, что оценка зависит только от скорости нуклеации, но не от
скорости элонгации. В симуляциях с фиксированной скоростью нуклеации и
варьируемой скоростью элонгации, высота плато остается постоянной.
Вообще, независимость концентрации от величины, посчитанной из данных,
зависящих от концентрации, означает, что величина является параметром
системы. В этом случае, независимость концентрации на графиках
показывает зависимость отношения (33) от коэффициентов в уравнениях
(37), но не от начальных условий.

4
Рис. 42. Скорость образования капсидов по отношению к скорости
нуклеации. Значение f nuc принималось равным 104 М −1 с−1 (A), 103 М −1 с −1 (B),
2
10 М с
−1 −1
(C). f elong =106 М −1 с−1, ∆ GC =−4,1 ккал/ моль.

РАЗМЕР ЯДРА МОЖЕТ БЫТЬ ОПРЕДЕЛЕН ИЗ


ЗАВИСИМОСТИ КОНЦЕНТРАЦИИ ОТ ВЕЛИЧИНЫ СБОРКИ
Симуляции показывают, что размер ядра не может быть точно
определен поиском лучшего приближения к экспоненте в ур. (32).
Разработана чувствительная оценка для размера ядра. Анализ основывается
на двух предположениях 1) отношение в ур. (33) не зависит от u0, и 2)

4
реакции находятся в переходном устойчивом состоянии, в котором
образование капсида равно удалению свободной субъединицы (ур. (34)).
d [N ] −d [u]
N = (34)
dt dt
Результаты показывают, что размер ядра оказывается временным
минимумом функции
∂ ln [ N ]
/∂ ln [ u ]
∂u0 (35)
L=( )
∂ u0

Функция L – это наклон графика ln[N] к ln[u] в одно время на диапазоне


начальных концентраций белков, u0. Минимум может быть найден только для
семейства реакций, находящихся одновременно в устойчивом состоянии. Это
значит, что есть диапазон времен и концентрации, для которого функция L
вблизи своего минимума аппроксимирует размер ядра.
Рис. 43 показывает график функции L на диапазоне времен и
концентраций для икосаэдральной модели с размером ядра nuc = 3.
Минимальное значение L мало отличается от размера ядра. Рис. 43
показывает серии симуляций, используемых для вычисления поверхности на
рис, при этом затененная область очерчивает домен, в котором размер ядра
аппроксимирован с точностью до 0,33. Размер ядра однозначно
аппроксимируется на довольно широком диапазоне начальных концентраций
в ранее время. Для меньших концентраций, аппроксимация выполняется и
при более поздних временах. Рис. показывает поверхности z=L(u 0 , t) для
размеров ядер 3, 4, 5 в додекаэдральной модели.

4
Рис. 43. Определение размера ядра для икосаэдральной модели.
Минимум функции L задает оценку размера ядра. (A) Поверхность L (светло-
серый цвет) показана для nuc=3 , ν=7 ×10 .
−5
(B) Соответствующие
кинетические симуляции показывают, где (серая область) размер ядра
оценивается с точностью ± 0,3.

4
Рис. 44. Определение размера ядра трех различных семейств симуляций
для додекаэдральной модели.

4
Кинетика элонгации наиболее видна на ранних фазах реакций сборки

Рис. 45. Влияние скорости элонгации наиболее заметно на ранних фазах


сборки. (A) скорость элонгации варьируется при постоянной начальной
концентрации субъединиц.

Скорости элонгации равны 105, 4,6 × 104 , 2,2 ×104 и 104 М−1 с−1 слева
направо, скорость нуклеации равна 100 М −1 с−1. (B) – (E) Семейства
кинетических симуляций, где [u0 ] равняется 20, 10, 6 и 2 мкМ, соответствуя
[ u0 ] / K D, равным 0,063, 0,032, 0,019, 0,0063. Для этих реакций f elong равняется 105

, 4,6 × 104 , 2,2 ×104 и 104 М −1 с−1. Все расчеты проводились для модели 30-мера с
ядром – триммером, ∆ GC =−4,1 ккал/ моль, f nuc=100 М −1 с−1.

4
Рассмотрение симуляций кинетики (Рис. 39) показывает, что фаза
задержки обусловлена временем, требуемым для сборки промежуточных
продуктов. На длительность этой фазы влияет размер ядра, скорость
нуклеации, устойчивость промежуточных продуктов, входящих в состав ядра
(т. е. K Acon), и скорость элонгации. Симуляции показывают локализованную
зависимость длительности задержки от скорости элонгации, f elong, если другие
параметры остаются постоянными,. Заметим, что различные симуляции
сливаются при более длительных временах, когда скорость нуклеации
регулирует скорость образования капсида. При проверке диапазона
концентраций субъединиц, влияние f elong на длительность задержки наиболее
наглядно при низких [u0 ] (Рис. ). Изменение времени задержки показывает,
что возможно аппроксимировать f elong подбором кривой.
Для маленьких ядер в больших капсидах f elong становится важнее из-за
большого числа шагов после нуклеации. Скорость элонгации в основном
регулирует фазу задержки, а скорость нуклеации регулирует все фазы (37).
Поскольку скорость нуклеации влияет на все фазы, она аппроксимирует
коэффициент масштабирования общего времени симуляции.

МАТЕМАТИЧЕСКИЕ ПОДРОБНОСТИ
В самом общем случае кинетика модели описывается системой
уравнений:
dX
=V ( X), (36)
dt
где X =( X 1 , … , X N ) - заданные концентрации реактантов и продуктов, а V
¿(V 1 , … , V N ) задает скорости изменения видов. Конкретный вид V определяет

особенности каскада реакций. Ур. (36) решается для серии времен X (t , X 0 ),


где координаты – концентрации в заданное время, а X 0 - вектор начальных
концентраций.
Для упрощения модели, введены предположения: 1) за один раз
возможно присоединение лишь одной субъединицы, 2) все виды содержат

4
разное количество субъединиц, 3) имеется идеальная геометрия ассоциации,
при которой изоэнергетические контакты приводят к одинаковому продукту
и 4) все энергии аддитивны. При этих предположениях, система уравнений
(36) принимает вид:
d [u ]
=−f nuc (2 s 2 [ u ] +…+ s nuc [ u ][ nuc−1 ] )−f elong ( s nuc [ u ][ nuc ] + …+ S N [ u ][ N−1 ] ) + ν ( 2b 2+ …+bnuc [ nuc ]
2

dt
d [2]
=f nuc ( s2 [ u ] −s 3 [ u ][ 2 ] ) +ν ( b 3 [ 3 ] −b 2 [ 2 ] )
2

dt

d [ nuc ]
=f nuc s nuc [ u ][ nuc−1 ] −f elong snuc +1 [ u ][ nuc ] +b nuc+1 [ nuc+ 1 ] −ν bnuc [ nuc ]
dt
⋮ (37)
d [m ]
=f elong ( sm [ u ][ m−1 ] −s m+1 [ u ][ m ] ) + bm +1 [ m+1 ] −bm [ m ]
dt

d [N ]
=f elong s N [ u ][ N −1 ] −b N [N ]
dt
Коэффициенты обратной реакции b m определяются как
r
b m=σ m f m K Dcon , (38)
где r =c m−c m −1 задает число контактов, которые необходимо разбить,
чтобы диссоциировать субъединицу из m-того промежуточного продукта с
K Dcon=(K Acon) .
−1

Уравнения (37) решаются для начального условия X 0=(u 0 , 0 , … , 0), т. е.


реакция начинается исключительно со свободных субъединиц. Для каждого
u0 >0 решение достигает равновесия X ∞ (u0 ), полученного явно решением

алгебраической системы V ( X )=0 при выполнении уравнения сохранения


массы
N
u0 =[ u ] + ∑ m[m]. (39)
m=2

МАСШТАБИРОВАНИЕ КИНЕТИКИ СБОРКИ


Уравнение сохранения (39) инвариантно относительно произвольного
масштабирования времени и массы. Решения дифференциальных уравнений

4
(37) таковыми не являются, хотя они почти инвариантны относительно
преобразования

(
( t , X ) → K Dcon t ,
X
K Dcon ). (40)

Преобразованные уравнения идентичны уравнению (36), за


исключением дополнительного коэффициента K Acon=(K Dcon)−1, появляющемся в
каждом слагаемом для обратной реакции. Например, результат применения
этого преобразования к типичному уравнению из (37):
d [m ]
=f m ( s m [ u ][ m−1 ] −s m +1 [ u ] [ m ] ) +b m+1 [ m+1 ] −b m [ m]
dt
приводит к

d [m ]
=f m ( s m [ u ][ m−1 ] −s m +1 [ u ] [ m ] ) + K Acon bm +1 [ m+ 1 ] −bm [ m ].
dt (41)
Обратные слагаемые в преобразованных уравнениях наименее значимы,
когда 1) траектория сборки распределяет не менее двух контактов за шаг, 2)
K Dcon ≪ 1, 3) имеется запас свободных субъединиц и 4) ν ≤ K Dcon . Первое условие

вызвано тем, что обратные слагаемые будут содержать по меньшей мере


один дополнительный коэффициент K Dcon, аннулирующий K Acon,

появляющийся при преобразовании, когда имеется r≥2 контактов,


образующихся в данной реакции (38). Далее, условия 2) и 3) вызваны тем,
что прямые слагаемые инвариантны относительно преобразования и имеют
преобладающее влияние в скоростных уравнениях. Требование из пункта 4)
специфично для начального шага димеризации, где имеется только один
контакт, r = 1.
Масштабирование (37) упрощает сравнение временных серий и
соответствующих количественных параметров реакции с изменением
энергии контакта с использованием K Dcon как единицы концентрации.
Масштабирование оказывается почти точным во время задержки, стадии
быстрого роста, и начала асимптотической фазы, когда прямые слагаемые
являются определяющими и запас субъединиц не слишком истощен. После
истощения субъединиц, как только реакция достигнет равновесия, обратные

4
слагаемые приобретут большее значение, и инвариантность (37)
относительно преобразования (40) станет менее точной.

ИЗОЛЯЦИЯ СКОРОСТИ НУКЛЕАЦИИ


После пика во время фазы быстрого роста, концентрации
промежуточных продуктов падают экспоненциально до равновесных
значений. Для m-го промежуточного продукта вытекает, что
−r (t −tm )
( [ m ] −[ m ] ∞ ) ≈ [ m ] t e
m
m
, (42)

где [ m ] ∞ и [ m ] t обозначают концентрации при равновесии и при времени t m


m

, после которого аппроксимация действительна с некоторой заранее заданной


относительной ошибкой. Собирая вместе соответствующие аппроксимации
(42) для последовательных промежуточных продуктов, получаем (используя
(28) и устанавливая общее изменение количества контактов между
субъединицами r =c m−c m −1)
[m] [m ]∞ sm r (4
≈ =K m [u]∞ = K Acon [u]∞
[m−1] [m−1] ∞ σm 3)
С улучшением аппроксимации при времени t >t m . Данные стандартной
многоступенчатой сборки, изображенные на рис., показывают, почему t m
быстро увеличивается с m, т. е. высшие промежуточные продукты могут
быть построены только из низших, поэтому приближение (43) становится
точным намного быстрее для ранних промежуточных продуктов. В
частности, ур. (43) становится действительным для компонентов ядра
намного раньше, чем оно будет выполняться для ядер и промежуточных
продуктов элонгации. При стабилизации сборочной линии, концентрации
компонентов ядра будут соблюдать отношения, приближенные к условиям
равновесия, что может быть записано как
(
[ nuc− j ] ≈ K nuc− j [ u ][ nuc−1− j ] , j=1 … nuc−2.
44)

4
Кроме того, для сильной прямой реакции, пока [ u ] не слишком мало, т. е.
до более поздней части асимптотической фазы, слагаемые прямой реакции
будут стремиться преобладать в правой части

d [ nuc ]
=f nuc s nuc [ u ][ nuc−1 ] −f elong snuc +1 [ u ][ nuc ] ++b nuc+ 1 [ nuc+ 1 ] −bnuc [ nuc ]
dt (45)

С начала фазы быстрой сборки, пока масса, связанная в сборочной


линии, остается приблизительно постоянной, концентрации промежуточных
продуктов находятся в устойчивом состоянии, и, в частности, [ nuc ] является
почти постоянной. При этих условиях обратные слагаемые пренебрежимо
малы. Это значит, что почти каждое образованное ядро провидит к
образованию следующего более крупного промежуточного продукта. То же
можно сказать про все последующие промежуточные продукты, поэтому
каждое ядро приводит к образованию капсида. Скорость производства
капсидов тогда оказывается примерно равной прямой скорости образования
ядер, и мы имеем
d [N ]
=f nuc s nuc [ u ][ nuc−1 ] (46)
dt
Последовательная подстановка для [ nuc−1 ] , [ nuc−2 ] , … в ур. (46) с
использованием аппроксимации (44) дает
d [N ] nuc
≈ f nuc s nuc K nuc−1 ∙∙ ∙ K 2 [ u ] . (47)
dt
Константы K m определяются геометрией капсида и находятся обратной
подстановкой в (37) при равновесии. Когда запас субъединиц истощается,
устойчивое состояние сборочной линии и оценка (46) постепенно
нарушается.

ОЦЕНКА РАЗМЕРА ЯДРА


Последняя часть исследования посвящена зависимости [ u ] и [N ] от t и u0.
Рассматриваются симулированные реакции, в которых имеется большое
начальное количество субъединиц, и которые затем быстро входят в

4
устойчивое состояние, в котором концентрации промежуточных продуктов
медленно меняются. При этих условия выполняется (47) и отношение
∂[ N ]
λ p= /[u] p (48)
∂t
не зависит от u0 для p=nuc. Кроме того, масса, связанная в сборочной
линии, почти постоянная, так что и масса, не занятая в сборочной линии
(капсиды и субъединицы) также почти постоянна, что приводит к

( N [ N ] +[ u ] ) ≈ 0 (49)
∂t
В симуляциях точность аппроксимации (49) также не зависит от u0 для
достаточно большой u0, чтобы задавать сборку (для реакций с u0 ≤ K Dapp у
сборочной линии нет устойчивого размера, поскольку нет фазы быстрого
∂[u]
роста). Решая (49) относительно ∂ t , разделяя на [u] p и дифференцируя по u0,

получаем

( ) ( )
∂[N ] ∂ [ u]
N
∂ ∂t −∂ ∂ t
= =0 ,
∂u 0 [u ]
p
∂ u0 [ u ] p

что приводит к условиям


p ∂ ∂[N ] p −1 ∂ [ u ] ∂ [ N ] p−1 ∂ [ u ] ∂ [ u ] p ∂ ∂ [ u]
N [u ] =Np [ u ] =−p [ u ] =−[ u ] .
∂ u0 ∂ t ∂ u0 ∂t ∂u0 ∂ t ∂u0 ∂t

При этих условиях также имеем

( )
∂ [u ]
∂ ∂t p−1 ∂ [ u ] ∂ [ u ]
= .
∂u 0 [u ] [u ] ∂u 0 ∂ t
2

Разделив эти выражения и поменяв порядок производных, получаем

( ) (( )
∂ ln [ N ]
2
∂ ln [ N ]
∂t ∂u 0 [u ] ∂u 0 (
= p− .
∂ ln [ u ]
2
( p−1 ) [ N ] ∂ ln [ u ] 50)
∂t ∂u 0 ∂u 0

Теперь допустим, что для каждого u0 в момент времени t=t (u0 )

4
( )( )
2
∂ ln [ N ] ∂ ln [ N ]
∂t ∂u 0 ∂ u0
= . (51)
2
∂ ln [ u ] ∂ ln [ u ]
∂t ∂u 0 ∂ u0

Тогда в момент времени t=t (u0 ) в силу (51) ур. (50) будет иметь вид

( ) (( )
∂ ln [ N ] ∂ ln [ N ]
∂u 0 [u ] ∂u 0
= p− ,
∂ ln [ u ] ( p−1 ) [ N ] ∂ ln [ u ]
∂u 0 ∂u 0

которое может быть решено


∂ ln [ N ]

( )
2
∂u 0 [u] ( p−1 ) [ N ] ( p−1 ) [ N ]
=p =p (1− + −…)
∂ ln [ u ] [ u ] + ( p−1 ) [N ] [ u] [ u]
∂u 0

и приближение

( )
∂ ln [ N ]
∂u 0
L= ≈p (52)
∂ ln [ u ]
∂u 0

выполняется с p ( p−1 ) [ N ] /[u ], если [ u ] < ( p−1 ) [ N ] при t=t (u0 ). Значение p=nuc
является искомым размером ядра.
Как найти время t (u0 ), для которого выполняется аппроксимация? p –
временной минимум функции

( )
∂ ln [ N ]
∂u 0
L= ,
∂ ln [ u ]
∂u 0

достигаемый во время устойчивого состояния при t =t (u0 ). Для того,


чтобы убедиться в этом, продифференцируем L по t
∂ ln ⁡[u] ∂2 ln ⁡[ cap] ∂ ln ⁡[cap ] ∂2 ln ⁡[u]
− (5
∂L ∂u 0 ∂t ∂ u0 ∂u 0 ∂t ∂u 0
=
∂t ∂ ln ⁡[u] 2
3)
( )
∂u 0

4
Эта производная равна нулю при t=t (u0 ), когда достигается временной
минимум L в реакции с начальной концентрацией u0. Следовательно,
числитель (53) должен быть нулем.
Условия, при которых λ p не зависит от u0, сохраняются в течение
длительного временного интервала, но начало этого интервала откладывается
при уменьшении u0. Когда u0 мало по сравнению с K Dapp, сборочная линия
перестает существовать. Чтобы выполнялось (49), общая масса,
удерживаемая в промежуточных видах должна быть постоянной.
Сборочные каскады подвержены истощению и кинетическим ловушкам.
Для [ u ] < K Dapp, реакции истощаются из-за недостатка свободных субъединиц,
для достаточно большой [u] реакции хорошо снабжаются доступными
свободными субъединицами. Для u0 ≫ K Dapp, имеются в избытке, пока не
наступит перенасыщение сборки, приводящее к кинетической ловушке. В
истощившейся реакции нет избытка массы субъединиц для передачи через
сборочную линию, поэтому диссоциация промежуточных продуктов
становится существенным источником массы для производства капсидов
[45].

МОДЕЛИРОВАНИЕ КИНЕТИКИ СБОРКИ, ОСНОВАННОЕ НА


ЛОКАЛЬНЫХ ПРАВИЛАХ
Сборка в этой модели происходит согласно шаблонам локальных правил
связывания. Субъединицы задаются объединением сфер, обладающими
массой, заданным радиусом и конфигурацией связывания. В простейшем
случае, субъединица моделируется как одиночная сфера с множеством
связей, каждая из которых представляет потенциальное взаимодействие
связывания с другой субъединицей. Взаимодействия связывания
моделируются связями, образующимися между отдельными субъединицами.
Связь характеризуется длиной, направлением, вращательным вектором,
парой энергий активации для реакций ассоциации и диссоциации, набором
упругих констант, используемых для моделирования сил, вызванных
4
взаимодействиями связывания, множеством допусков и множеством
допустимых соседей. Связи присоединяются, или разъединяются
вероятностно, согласно их характеристическим энергиям, и расположению в
заданных допусках. Для связи с энергией ассоциации E и энергией
диссоциации -Ed вероятность образования связи с другой связью
Eτ Eτ
разрешенного типа в заданном допуске составляет e k T /( 1+ e k T ) и вероятность
b b

Ed
разрушения существующей связи (1+e k T )−1, где k b – константа Больцмана и T
b

– температура. Конформационное переключение реализуется разрешением


субъединицам принимать различные формы с характеристической энергией.
Переключения субъединиц между разрешенными формами вероятностны и
согласуются с больцмановским распределением энергий. Вероятность того,
что субъединица займет конформацию k на определенном временном шаге
Ek
k bT
e
задается формулой: P ( k )= Ei , где Ei - энергия i-й конформации. Если
∑e kb T

субъединица образовала связи, то энергии этих связей добавляются к энергии


текущей конформации, поскольку связи должны быть разрушены, чтобы
произвести конформационное переключение.
Основными силами, действующими на субъединицу, являются силы,
вызванные ее соседями. Каждая связь имеет силы, стремящиеся придать
связи идеальное значение. Они моделируются тремя упругими элементами,
представляющими силу переноса, Ft, момент вращения вокруг связи, Tt, и
момент изгиба, Ts, который распрямляет связи. Эти силы вычисляются из
следующих уравнений:
F t=k t ( ⃗ e1)
e 2−⃗

T t=k T [ ( u⃗1 × u⃗2) ∙ ⃗


d1 ] ⃗
d1

d ×⃗d

T s=k s 0.5+0.5 ( ⃗
d1 ∙⃗
d2) 2 1
‖⃗ d 1‖
d2 ×⃗

4
Здесь k t, k T , k s - упругие константы, e⃗1 и ⃗
e 2 – конечные точки связей один

и два, ⃗
u1 и ⃗
u2 - вращательные векторы, определяющие желаемые

относительные вращения двух субъединиц вокруг связей, ⃗


d1 и ⃗
d2 –

направления связей. Конечные точки связей определяют оптимальные


относительные позиции двух связанных субъединиц.
Столкновения между двумя субъединицами или между субъединицей и
искусственной границей вокруг симулируемого раствора дают второй класс
сил. Когда две сферы сталкиваются, они прикладывают друг к другу силы,

{ ( r 1+ r 2 ) −( r 1 +r 2 )‖⃗d‖
}
2

равные min C 2
,2 C , где C - константа, установленная как
‖⃗d‖
50000 а. е. м.  нм/мкс2, d⃗ - вектор между центрами сфер, r 1 и r 2 - их радиусы.
Аналогично, когда сфера сталкивается с границей, граница прикладывает к

{ }
1−o /r
m∈ Cm , 12CM
()
2
сфере силу, равную o , где M – масса субъединицы, r –
r

радиус сферы, o – расстояние, на которое перекрывается граница сферы с


границей симулируемой области. Такие силы выбраны методом проб и
ошибок, чтобы дать разумное поведение при столкновениях, и
одновременно, чтобы иметь не слишком высокую вычислительную
стоимость.
Последний класс сил взят из модели броуновского движения, чтобы
сохранять среднюю кинетическую энергию частиц близко к константе в
течение длительного периода времени. Модель содержит две силы –
демпфирующую силу и случайную силу с адаптивной величиной, введенную
для увеличения кинетической энергии. Демпфирующая сила на каждом шаге
времени вычисляется присваиваниями
2 2
⃗v ← ⃗v −d ⃗v M , o⃗ ← ⃗o −d ⃗o I 3 ,
3

где ⃗v - скорость, o⃗ - угловая скорость, M – масса субъединицы, I –


момент инерции субъединицы относительно ее оси вращения, d -
определенная демпфирующая постоянная. Демпфирующая сила стремится

4
уменьшить энергию в симуляции. Случайная сила добавляет малые
возмущения в скорость субъединицы, а их распределения адаптивно
выбираются стремящимися увеличить энергию субъединицы. Вместе эти две
силы предотвращают ошибки вычислений, заключающиеся в постепенном
увеличении или уменьшении средней кинетической энергии в ходе
симуляции, и в то же время, не вносят значительных изменений в траектории
сборки.
Основной вычислительной проблемой является интегрирование
уравнений движения, основанные на уравнениях, описанных выше.
Уравнения движения могут быть записаны в терминах векторов скоростей, ⃗v,
и позиций, ⃗x , как два дифференциальных уравнения:
d ⃗x
= v⃗
dt
d ⃗v
=f ( ⃗x , ⃗v ),
dt
где f вычисляет ускорения, основанные на текущих позициях и
скоростях. Общий подход – это адаптивный метод Эйлера с экстраполяцией
Ричардсона. Метод допускает распареллеливание с помощью многопоточной
системы Cilk.
Метод Эйлера – это простейший метод численного интегрирования,
вычисляющий симулируемое состояние в будущий момент времени, исходя
из состояния в текущий момент. Прямой метод Эйлера для интегрирования
скорости сочетается с боратным методом Эйлера для интегрирования
позиции, что дает следующую пару шагов итерации:
⃗v n+1=⃗v n+ ∆ tf (⃗xn , ⃗v n )
⃗x n+1=⃗x n + ∆ t ⃗v n +1

Это дает приближение первого порядка, которое требует одно


вычисление функции за шаг.
Из-за нерегулярной природы задачи, эта схема интегрирования
изменена, и в ней применяется адаптивный размер шага. Когда симулятор
пытается перейти на один шаг по времени, сначала решается задача при

4
единичном размере шага. Затем повторяется вычисление для всех
субъединиц при размере шага 0,5. Затем делается проверка на сходимость, то
есть проверяется, не слишком ли велика разность между полученными
результатами. Если две полученные величины лежат вне определенного
пользователем допуска, то вычисление повторяется еще раз с вдвое
уменьшенным размером шага, т. е. с размеров шага 0,25 от единичного.
Процесс продолжается до тех пор, пока тест на сходимость не даст успешный
результат. Хотя этот процесс не дает гарантии ограничения ошибок, он
устанавливает примерную границу значений численных ошибок.
Следующее усложнение – применение экстраполяции Ричардсона. Это
прием, который сочетает низкоуровневые представления для получения
высокоуровневого представления. Он сочетается с адаптивным размером
шага, так что значения для различных размеров шагов экстраполируются для
получения n-кратной аппроксимации при использовании n различных
размеров шагов. Поскольку есть вероятность вмешательства в интерполяцию
скачкообразных сил, симулятор пытается строить экстраполяцию с k
наименьшими доступными размерами шагов для каждого k, и использует
любое из сходящихся, предпочитая значения большего порядка, если более,
чем одно экстраполируемое значение сходится на данном шаге.
Каждый запуск симуляции набор субъединиц, представляющих белки
оболочки, которые свободно перемещаются в симулируемом растворе.
Субъединицы способны образовывать взаимодействия связывания друг с
другом, согласно локальным правилам, определяющим разрешенные
шаблоны связывания, снабженные определенными допусками на углы и
расстояния. Хотя идеальные правила для капсида T = 1 могут дать только
корректно сформированные капсиды T = 1, допуски и гибкость
существующих взаимодействий связывания допускают неоптимальное
связывание, которое приводит к «уродливым», капсидам, т. е. капсидам с
нарушенной геометрией. Симуляция может приостанавливаться для записи
данных текущего состояния популяции, что позволяет записывать

4
количество субъединиц, находящихся на правильной траектории сборки, и
вне ее, через регулярные промежутки времени.
В модели субъединицы имели две конформации: более устойчивую
несвязывающую конформацию м потенциальной энергией -2 ккал/моль и
неустойчивую связывающую конформацию с нулевой потенциальной
энергией. Субъединица представлялась одиночной сферой с массой 100000 а.
е. м., и диаметром 3 нм в несвязывающей конформации и 1 нм в
связывающей конформации. Разные размеры были выбраны исключительно
для удобства наблюдения. Параметры, ассоциированные с взаимодействиями
связывания выбраны эмпирически так, чтобы позволить быстрый рост
капсида и одновременно низкий уровень «уродливых» капсидов. Базовые
энергии связывания, которые управляют вероятностью образования связей,
когда частицы находятся в пределах геометрических допусков, и
вероятностью последующего разрыва связей, установлены в -8500 ккал/моль.
Выбраны угловой допуск в 30 и допуск базового расстояния в 10 нм. В
тестах использовалось 300 субъединиц. Размер симулируемой области
составлял 125 нм по каждому измерению давая концентрацию 2,4710-4
моль/л. Такая высокая концентрация, по сравнению с наблюдаемой в
экспериментах, выбрана, чтобы ускорить рост капсидов для экономии
машинного времени. Однако, авторы модели полагают, что результаты будут
при таком допущении качественно аналогичны результатам, полученным при
значительно меньших концентрациях, но большем времени симуляции с
подстройкой энергий связывания.
Скорости правильного и нарушенного роста измерялись проверкой в
пяти временных шагах через 5000 шагов количеством частиц, находящихся
на траектория правильной сборки и вне их. При этом, если в кластере из
нескольких субъединиц имелась хотя бы одна связь, которой не должно было
бы быть в кластере, принадлежащем правильной траектории, все
субъединицы, входящие в кластер, считались находящимися вне правильной
траектории. Общее время симуляции составляло 25000 шагов. К сожалению,

4
перенести это количество дискретных отсчетов на шкалу непрерывного
времени, т. е. определить физический смысл времени симуляции
невозможно.
Такой численный эксперимент позволяет определить влияние изменения
энергии связывания на рост капсида. В целом получается, что общий рост и
рост вне траектории растет с уменьшением энергии связывания (т. е. с более
сильными взаимодействиями). Рост на траектории определяется
соревнованием между общим ростом и ростом вне траектории, и его
зависимость от энергии связывания оказывается сложнее.
Также рассматривалась зависимости скоростей роста от увеличения
допусков для связывания, и увеличения концентрации. Эти зависимости
получились аналогичными.
Наконец, модель позволяет определить механизмы образования
«уродливых» капсидов. В основном, наблюдалось три механизма, влияющих
на скорость их образования:
1. Взаимодействие незавершенных капсидов, и слияние их в одну крупную
структуру, способную и далее присоединять субъединицы, но не
приводящую к правильному капсиду.
2. Возникновение локальных ошибок в растущем капсиде, которые
приводят к существенным деформациям. Например, вместо пентамера может
ошибочно образоваться тетрамер. Капсид при этом может продолжить расти,
давая замкнутую структуру, в которой все локальные взаимодействия
соответствуют корректному капсиду, но весь капсид ненормально мал.
3. Самостоятельное исправление «уродливого» капсида также
наблюдалось в симуляции.
На Рис. 46 изображены примеры этих механизмов.
Таким образом, кинетическая модель, построенная с учетом локальных
правил взаимодействия, позволяет исследовать зависимости скорости роста
от таких параметров, как энергия связывания, концентрация, геометрические
допуски. К сожалению, из-за вычислительных ограничений, приходится

4
несколько упрощать модель для вычислений по сравнению с ее
теоретическим обоснованием, и искажать некоторые параметры, в первую
очередь концентрацию, чтобы сократить объем вычислений. Однако авторы
считают, что такие упрощения не вносят качественные изменения по
сравнению с полной моделью с действительными параметрами. Что особенно
интересно, модель позволяет провести качественный и количественный
анализ возможных нарушений, происходящих в процессе роста капсида, и
приводящих к формированию «уродливых» капсидов [46].

4
Рис. 46. Примеры механизмов, влияющих на скорость «нарушенного»
роста капсидов.
ЦИТОСКЕЛЕТ
К элементам цитоскелета относят микротрубочки, микрофиламенты и
промежуточные филаменты. Цитоскелет придаёт клетке определённую
форму и выполняет множество других функций (например, обеспечивает
подвижность клетки и внутриклеточный транспорт).

4
Рис. 47. Микротрубочка.

Микротрубочки состоят из 13 параллельных тубулиновых


протофиламентов (нитей), образующих полые цилиндры диаметром 25 нм и
длиной в несколько микрометров. Каждая нить собрана 13 параллельно
расположенных протофиламентов состоят из отдельных субъединиц -
димеров α- и β-тубулина. 13 параллельно расположенных тубулиновых
протофиламентов формируют полый цилиндр диаметром 25 нм.
Протофиламенты образуются путём полимеризации гетеродимерного белка
тубулина, состоящего из глобулярных субъединиц - α- и β-тубулина из
гетеродимерного белка тубулина, состоящего из двух глобулярных
субъединиц - α- и β-тубулина. Сборка микротрубочек осуществляется в т.н.
центре организации микротрубочек в центросоме. Микротрубочки -
динамичные структуры, постоянно подвергающиеся полимеризации и
деполимеризации [47].

4
Рис. 47. Из тубулина с одного конца собирается микротрубочка.

Рис. 48. Микротрубочка разбираются с другого конца.

4
ВЫВОД
Несомненно, что процесс сборки вируса детерминирован и управляем и
для полного понимания этого процесса необходимо определить средства
детерминации и механизмы управления. Научное мышление второй
половины ХХ века было очаровано созданием компьютера и открытием
системы управления синтезом белков. Обе системы идеологически
идентичны и являются воплощением принципа сосредоточенного
управления. Носителем сосредоточенного управления является знаковая
система - линейный императивный управляющий язык. Совершенно
естественно, что первые попытки математического моделирования процессов
самосборки и самовоспроизведения были предприняты в рамках теории
автоматов, например фон Нейман. Однако данные экспериментальных
наблюдений не подтверждают состоятельность таких моделей. Процессы
самосборки не укладываются в схему сосредоточенного управления.
Данные экспериментов позволяют утверждать, что в процессе
самосборки отсутствует управляющий элемент и ни в какой форме не
обнаруживается знаковая система, описывающая порядок следования
монтажных актов или порядок расположения элементов в структуре
продуктов самосборки. Специфика феномена самосборки заключается в том,
что процесс несомненно детерминирован, но механизм детерминации не
вписывается в простой и понятный метод сосредоточенного управления
Самосборка есть реализация метода распределённого управления, при
котором управляющие функции реализованы во внутренней структуре
элементов участвующих в процессе, а управляющая информация,
детерминирующая процесс, распределена по всем элементам. Следовательно,
носителем детерминации при распределённом управлении являются
специфические знаковые системы кардинально отличающиеся от
простейших императивных линейных языков, подобных компьютерным или
системе ДНК-белок. Главная задача исследования самосборки это

4
определение логики взаимоотношений элементов и поиск знаковых систем,
носителей распределённого управления [48].

4
CПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Fraenkel-Conrat H., Williams R. C— Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1955, v.
41, p. 690
2. Fraenkel-Conrat H., Singer В.— Biochim. and Biophys. Acta, 1959,v. 33, p.
359.
3. M a t h e w s R. E. F.— Virology, 1966, v. 30, p. 82.
4. Caspar D. L. D.— Adv. Protein Chem., 1963, v. 18, p. 37.
5. Durham A. C. H., Finch J. Т., Klug A.— Nature (London), New Biol.,1971,
v. 229, p. 37.
6. Zimmern D.— Ibid., p. 463.
7. Zimmern D., Butler P. J. G Cell, 1977, v. 11, p. 455
8. [Клини С., Весли Р. Основания интуиционистской математики. –
Москва. Наука. 1978.
9. Махиборода А. В. Проблемы создания вычислительных средств
непроцедурными внутренними языками. - Киев. УСИМ. 1993. Наукова
думка, №3, с. 52 – 62.
10. Мизин И. А., Махиборода А. В. Архитектура самоопределяемых данных
в среде взаимодействия открытых систем. – Москва. ВИМИ. 1995.
Информатика и вычислительная техника. Вып. 1,2. с. 60 –71.
11. Мизин И. А., Махиборода А. В. Концепция самоопределяемых данных и
архитектура распределенных вычислительных систем. – Москва.
Информационные технологии и вычислительные системы. 1995. Наука,
№1, с. 22 – 31.
12. Мизин И. А., Махиборода А. В. Фундаментальные проблемы создания
средств математической поддержки технологии открытых систем.
Москва. 1996. Тезисы докладов третьей международной конференции
“Развитие и применение открытых систем”, с. 27 – 31.
13. Фон Нейман Дж. Теория самовоспроизводящихся автоматов. – Москва.
Мир 1971.

4
14. Вирусология: В 3-х т. Т. 1: Пер. с англ./Под ред. Б. Филдса, Д. Найпа. –
М.: Мир, 1989.
15. В. А. Костюченко, В. В. Месянжинов. Архитектура сферических
вирусов. Успехи биологической химии, т. 42, 2002, с. 177 – 192.]
16. Введение в биофизическую химию Мартин Р.N. 1966 СТР.263
17. Страйер Л. Боихимия: В 3-ч т., Т.3 Пер. с англ. – М: Мир, 1985, 173-176
18. Bloomfield, V. A., (1996), Curr. Opin. Struct. Biol., 6, 334-341.
19. Klimenko, S. M., Tikchonenko, T. I., Andreev, V. M., (1967), J. Mol. Biol.,
23, 523-533.
20. Lepault, J., Dubochet, J., Baschong, W., Kellenberger, E., (1987), EMBO J.,
6, 1507-1512.
21. Hud, N. V., (1995), Biophys. J., 69, 1355-1362.
22. Schellman, J. A., Parthasarathy, N. J., (1984), J. Mol. Biol., 175, 313-329. 31.
23. Strzelecka, T.E., Davidson, M.W., Rill, R.L, (1988), Nature, 331, 457-465.
24. Smith, D. E., Tans, S. J., Smith, S. B., Grimes, S., Anderson, D. L., Busta-
mante, C., (2001), Nature, 413, P. 748- 752.
25. Kindt, J., Tzlil, S., Ben-Shaul, A., Gelbart, W. M., (2001), Proc. Natl. Acad.
USA, 98, 13671–13674.
26. Mrevlishvili, G. M., Mdzinarashvili, T., Al-Zaza, M., Tsinadze, L.,
Tushishvili, D., Razmadze, G., (1999), Pure Appl. Chem., 71, 1291–1299.
27. Kindt, J., Tzlil, S., Ben-Shaul, A., Gelbart, W. M., (2001), Proc. Natl. Acad.
USA, 98, 13671–13674.
28. Pesavento, J. B., Lawton, J. A., Estes, M. K., Prasad, B. V. V., (2001), Proc.
Natl. Acad. USA, 98, 1381–1386.
29. Нано биотехНанороботы на основе бактериофага Т4 - будущая вакцина
против рака, Свидиненко Юрий (Svidinenko) 2004.08.23 2004, Nanotech-
nology News Network.
30. Вrenneг S., Hоrne R. W.— Biochim. and Biophys. Acta, 1959, v. 34, p. 103.
31. DeRоsieг D. J., Кlug A.— J. Mol. Biol., 1972, v. 65, p. 469
32. De Rоsie r D. J., Кlug A.— Nature (London), 1968, v. 217, p. 130.

4
33. Unwin P. N. Т.— J. Mol. Biol., 1974, v. 87, p. 657.
34. Hart R. G. (1956). Morphological changes accompanying thermal denatura-
tion of Tobacco mosaic virus. Biochim. Biophys. Acta 20, 388–389;
35. Atabekov J., Nikitin N., Arkhipenko M., Chirkov S., Karpova O. (2011).
Thermal transition of native Tobacco mosaic virus and RNA free viral pro-
teins into spherical nanoparticles. J. Gen. Virol. 92, 453–456;
36. R. Schwartz, P. W. Shor, P. E. Prevelige, Jr. Berger, B. Berger. Local Rules
Simulation of the Kinetics of Virus Capsid Self-Assembly
37. Olson, A. J., Hu, Y. H. E., & Keinan, E. (2007). Chemical mimicry of viral
capsid self-assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences,
104(52), 20731-20736.]
38. Коневцова Ольга Викторовна Теория кристаллизации Ландау и подход
волн плотности в комплексных системах Автореферат диссертации на
соискание ученой степени кандидата физико-математических наук
Ростов-на-Дону 2013, 128 стр.
39. Local Rules Simulation of the Kinetics of Virus Capsid Self-Assembly, Rus-
sell Schwartz, Peter W. Shor, Peter E. Prevelige, Jr., and Bonnie Berger, Bio-
physical Journal, Volume 75, December 1998, 2626–2636
40. Exploring the Parameter Space of Complex Self-Assembly through Virus
Capsid Models, Blake Sweeney,* Tiequan Zhang,* and Russell Schwartz*y
*Department of Biological Sciences, and yComputer Science Department,
Carnegie Mellon University, Pittsburgh, Pennsylvania ,Biophysical Journal
Volume 94 February 2008 772–783
41. IMPLEMENTATION OF A DISCRETE EVENT SIMULATOR FOR BIO-
LOGICAL SELF-ASSEMBLY SYSTEMS, Proceedings of the 2005 Winter
Simulation Conference M. E. Kuhl, N. M. Steiger, F. B. Armstrong, and J. A.
Joines, eds., TiequanZhang, Rori Rohlfs, Russell Schwartz, Dept. of Biologi-
cal Sciences and Computer Science Dept., Carnegie Mellon University, 4400
Fifth Avenue, Pittsburgh, PA 15213, U.S.A, 9 pages

4
42. Reddy, V., H. A. Giesing, R. T. Morton, A. Kumar, C. B. Post, C. L. Brooks
3rd, and J. E. Johnson. 1998. Energetics of quasiequivalence: computational
analysis of protein-protein interactions in icosahedral viruses. Biophys. J.
1998:546–558.
43. Ceres, P., and A. Zlotnick. 2002. Weak protein-protein interactions are suffi-
cient to drive assembly of hepatitis B virus capsids. Biochemistry. 41:11525–
11531.
44. Dynamic Pathways for Viral Capsid Assembly, Michael F. Hagan and David
Chandler, Biophysical Journal Volume 91 July 2006 42–54
45. Model-Based Analysis of Assembly Kinetics for Virus Capsids or Other
Spherical Polymers, Dan Endres and Adam Zlotnick,, Biophysical Journal
Volume 83 August 2002 1217–1230
46. Local Rules Simulation of the Kinetics of Virus Capsid Self-Assembly, Rus-
sell Schwartz, Peter W. Shor, Peter E. Prevelige, Jr., and Bonnie Berger, Bio-
physical Journal, Volume 75, December 1998, 2626–2636
47. Гистология, эмбриология, цитология: учебник для вузов / Под ред.
Э.Г.Улумбекова, Ю.А.Челышева - 3-е изд., - 2009. – электронный
учебник http://vmede.org/sait/?
page=5&id=Gistologija_ulumbekova_2009&menu=Gistologija_ulumbekova
_2009
48. Феномен самосборки: исследования и применение Махиборода А.В.,
Исследовательская компания «Abercade», 2009, Март. http://www.aber-
cade.ru/research/analysis/1295.html

Вам также может понравиться