Electroforesis

Química II, Universidad de las islas Baleares

grado en Bioquímica
Lucía Gallardo Prado
 Índice
Introducción..........................................................................................1
Fundamento de las separaciones electroforéticas...........................................1
Factores que afectan la electroforesis........................................................2
Tipos de electroforesis...........................................................................3
Métodos electroforeticos zonales: métodos más utilizados...............................3
Electroforesis en gel de poliacrilamida.......................................................3
electroforesis con geles SDS.................................................................3
Electroforesis discontinua con geles de poliacrilamida....................................4
Electroforesis en geles de agarosa...........................................................4
Electroforesis capilar..............................................................................5
Isoelectroenfoque...................................................................................5
Fuentes de error en la electroforesis .......................................................5
Bibliografía y webgrafía...........................................................................5
 Introducción

Electroforesis
Electroforesis es una técnica de laboratorio empleada para la separación analítica de moléculas
biológicas según su tamaño y carga empleando un campo eléctrico. Es una metodología aplicada a
sustancias de bajo peso molecular. La separación se puede realizar sobre varios medios: una superficie
hidratada de un soporte sólido como papel o acetato de celulosa, sobre una matriz porosa como gel,
o en disolución, y dependiendo de la técnica utilizada la separación se realiza de forma distinta de
acuerdo a la carga y masa de la molécula analizada.
Fue empleado por primera vez por el año 1937, pero su importancia vino a incrementarse cuando en
los años cincuenta E. L.Durrum y Arne W.K. Tiselius , impulsaron la electroforesis de zona, nombre
que se asignó a la separación de materiales en un campo eléctrico en presencia de algún tipo de
soporte; aunque este término se limitó originalmente al análisis de coloides y partículas submicroscopicas
con lo que se ha convertido en estos últimos años en una metodología aplicada a sustancias de bajo
peso molecular.

Fundamento de las separaciones electroforéticas

Sabemos que tanto macromoléculas y electrolitos, están cargadas eléctricamente y dependiendo de la
constante de ionización de sus grupos ácido-básico, se clasifican en débiles o fuertes. La técnica se
utiliza para conocer el carácter de la molécula lo cual se determinará por la velocidad con la que se
mueve en un campo eléctrico. En el caso de proteínas, se puede determinar la masa molecular o
detectar cambios en los aminoácidos; separar distintas especies moleculares.
Para la separación de las especies a analizar, se genera un campo eléctrico para la molécula puesta
en un líquido portador. Al generar el campo, habrá una intensidad pasando constantemente del polo
positivo al negativo, lo que quiere decir, que actuará una fuerza sobre la molécula la cual
experimentará una aceleración donde se obtendrá una velocidad que se neutralizara por la viscosidad
del medio.

La velocidad que obtiene la molécula depende de la carga de la ella misma, la intensidad de corriente
eléctrica que apliquemos, del radio (tamaño) de la molécula y la viscosidad del medio donde esta
inserta.

La movilidad molecular, refleja la velocidad relativa a la fuerza del campo y depende de la carga de
la partícula que, a su vez, depende del pH del medio en el que se encuentre. Por esta razón es
necesario indicar el electrolito o el pH utilizado para determinar la movilidad.

Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta son depositadas en un campo eléctrico,
éstas, experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posee carga opuesta. Al transcurrir un
periodo de tiempo, las moléculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el cátodo (polo
negativo) y aquellas cargadas negativamente se desplazaran hacia el ánodo (el polo positivo).
El movimiento de las moléculas esta condicionado por dos fuerzas adicionales; primero la fricción con
el solvente lo que dificultará el movimiento originando una fuerza que se opone , por otro lado las
moléculas tienen que poseer un movimiento browniano como resultado de su energía cinética propia
denominado difusión. La energía cinética de las moléculas aumenta con la temperatura, por ello a
mayor temperatura mayor difusión.

La suma total de estas fuerzas provoca que las moléculas no migren de una manera homogénea, de
tal manera que, si las moléculas son colocadas en un cierto lugar de solución, los iones comenzaran
a moverse formando un frente cuya anchura aumentara con el tiempo.
Para reducir la anchura de este frente se reduce el movimiento de las moléculas utilizando un medio
que oponga mas resistencia a dicho movimiento. La forma común de hacer esto es formar un gel. El
gel consiste de un polímero soluble de muy alto peso molecular que atrapa moléculas de agua y forma
un tamiz que dificulta el movimiento de los solutos, consecuentemente, la migración electroforética de
las moléculas será mas lenta, pero el ensanchamiento del frente se vera reducido también.

Los factores que afectan la electroforesis

• La electroforesis depende directamente del campo eléctrico y este depende de distintos

parámetros.
• La diferencia de potencial, corresponde al campo eléctrico el cual es proporcional a la velocidad
de avance.
• La resistencia, la cual es inversamente proporcional a la velocidad de las moléculas.
• La intensidad, cuantifica el flujo de carga eléctrica, se relaciona directamente con la distancia
recorrida por las moléculas.
• la temperatura, puesto que por el efecto Joule el paso de una corriente eléctrica va a producir
calor y este es directamente proporcional a la diferencia de potencial y a la resistencia. Por lo
tanto, es necesario controlar de manera estricta la temperatura para que esta no afecte a la
muestra desnaturalizándola.
 Tipos de electroforesis
Existen 3 tipos de electroforesis: de frente móvil, zonal y continua.

Electroforesis de frente móvil: Las moléculas están presentes en toda la disolución y su posición se
determina en función del tiempo por la óptica de Schlieren- técnica analítica utilizada para determinar
el movimiento y punto isoeléctrico de proteínas-. Debido a que la utilidad de la determinación
cuantitativa de la movilidad es poco utilizada, este tipo de electroforesis también lo és.

Electroforesis Zonal: Son los mas comunes debido a su alta aplicabilidad en diferentes campo, con el
fin de separar mezclas complejas. La solución a tratar se aplica en pequeñas cantidades sobre un
soporte sólido y homogéneo, como papel o ciertos tipos de geles; se impregna con una solución
tampón. Los soportes son generalmente polímeros o un gel poroso el cual restringe el movimiento de
las moléculas a través del medio durante la electroforesis y disminuyen los flujos de convección del
solvente.
Como soporte se utiliza: papel (celulosa), almidón, poliacrilamida, agarosa y acetato de celulosa,
entre otros. Esta técnica se utiliza para analizar muestras, para determinar la pureza de las muestras,
para detectar cambios de movilidad o conformación, y para la purificación de sustancias.
La determinación cuantitativa de la movilidad nunca se realiza, debido a la imposibilidad virtual de los
efectos que produce el soporte en el proceso electroforético. En cambio posee un gran poder resolutivo
ya que al aplicar una pequeña cantidad de proteína en una zona estrecha la longitud del trayecto es
mayor que la zona de aplicación. El equipamiento requerido es simple, fuente de poder, cubeta vertical
u horizontal donde se colocan el soporte y dos electrodos.

Electroforesis continua: la muestra se aplica también en una zona pero se añade continuamente a lo
largo del proceso.

Métodos electroforeticos zonales: métodos más utilizados

A continuación veremos los métodos mas utilizados dentro de las técnicas electroforéticas las cuales
corresponden al tipo de electroforesis zonal. Estas son:
Electroforesis en gel de poliacrilamida
Los geles de poliacrilamida son polímeros de acrilamida
formados de forma entrecruzada, químicamente inertes
con propiedades uniformes, con la facultad de ser
preparados de forma rápida y reproducible. Forma geles
transparentes con estabilidad mecánica, insolubles en
agua, relativamente no iónicos y que permiten buena
visualización de las bandas durante un tiempo
prolongado. Variando la concentración de polímeros, se
puede modificar de manera controlada en el tamaño del
poro. Es el medio mas eficiente para la electroforesis
de proteínas y pequeñas moléculas de RNA. Se han
desarrollado dos variaciones con objetivos especiales:

a)electroforesis con geles SDS: Se ha demostrado que los pesos moleculares de la mayoría de las
proteínas se pueden determinar con el detergente SDS (dodecilsulfato sódico) a pH neutro con SDS
al 1% y mercaptoetanol 0.1 M, la mayoría de proteínas se unen al SDS y se disocian los puentes
disulfuro abriéndose gracias al mercaptoetanol. Así las proteínas tratadas se comportan como si tuvieran
una forma similar y relación carga/masa idéntica. Todo ello da como resultado que la movilidad
efectiva esté únicamente relacionada con el peso molecular de la proteína a causa de la acción del
gel como tamiz molecular. De este modo proteínas con PM desconocido se someten a electroforesis
con proteínas con PM conocido.

b)Electroforesis discontinua con geles de poliacrilamida:

Técnica que se utiliza para conseguir máximas resoluciones. Consiste en concentrar una fina capa de
muestra. El sistema de geles se prepara en una columna vertical constituida por 3 regiones: superior o
gel muestra y otra intermedia o gel espaciador( ambos con mayor tamaño de poro y menos
concentrado) y la inferior o gel separador. Se
preparan en un tampón y a distintos pHs. El mayor
tamaño de poro permite una mayor movilidad de
moléculas que en el gel separador.
La baja fuerza iónica crea una resistencia eléctrica
mayor, donde el campo eléctrico es mayor en
regiones superiores con lo que la movilidad es mayor
en regiones muestra y espaciador. Los distintos
componentes ademas de acumularse se apilan por
orden de movilidades. Al final del proceso se extrae
el gel del tubo de vidrio y se procede a la
identificación de las zonas.

Electroforesis en geles de agarosa

La agarosa - polisacárido obtenido de algas de composición
homogénea), cuyas disoluciones (típicamente de 0.5 a 2 %)
poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50
grados C y formar un gel, semisólido al enfriarse. Este gel
esta constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras
poliméricas embebida en gran cantidad de medio líquido, que
retarda el paso de las moléculas, se usa usualmente para
separar moléculas grandes de alrededor 20.000 nucleótidos.
Este tipo de electroforesis es muy utilizada para caracterizar
ácidos nucleicos de distintas procedencias. Los geles se
comportan como un tamiz molecular y permiten separar
moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. Así, moléculas de DNA de diferente tamaño van
a emigrar de forma distinta en una electroforesis en gel de agarosa. Además, si en dicha electroforesis
se aplican marcadores de peso molecular (fragmentos de DNA de tamaño conocido) se puede calcular
el tamaño aproximado del DNA en estudio.

Electroforesis capilar
Se conoce con electroforesis capilar (EC) al conjunto de técnicas que emplean corriente eléctrica alta
(a veces supera los 500V/cm) que atraviesan tubos capilares / 20-100 μm de diámetro interno/ de
silice fundida para realizar separaciones de alta resolución
de los componentes de una mezcla. Requiere muy poca
cantidad de muestra y reactivo y es aplicable a una amplia
gama de analitos. La corriente electroendosmótica (FEO)
generada por los grupos silanol de la superficie interna del
capilar da como resultado una corriente plana del frente del
líquido que contrasta con el frente parabólico de la
cromatografía líquida de alta resolución .
La ventaja de esta técnica es que el capilar de silica
fundida que generalmente se cubre con una capa de
polimina para darle mayor rigidez y resistencia, tiene una
ventaja a través de ella que permite el pasaje de la luz
UV de tal manera que la visualización es on-line.
Con esta técnica descripta es posible separar moléculas
de muy diferentes propiedades físicas ( carga, peso
molecular, polaridad, etc) como: cationes, aniones,
proteínas, macromoléculas y sustancias no cargadas en
forma simultánea. Se obtiene una detección y
cuantificación de moléculas orgánicas e inorgánicas.
Algunas determinaciones habituales realizadas por técnicas
de electroforesis capilar:
herbicidas, insecticidas, fenoles, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, marcadores tumorales, drogas de
abuso, control de calidad de productos farmacéuticos, aminoácidos, azucares, aditivos, vitaminas,
contaminantes, etc.

Isoelectroenfoque: También llamada electroenfoque, la

técnica se basa en el desplazamiento de las moléculas en
un gradiente de pH. Las moléculas amfotéricas, como los
aminoácidos, se separan en un medio en el que existe una
diferencia de potencial y un gradiente de pH . La región del
ánodo es Ácida y la del cátodo es alcalina. Entre ambos se
establece un gradiente de pH tal que las moléculas que se
han de separar tenga su punto isoeléctrico dentro del rango.
Las sustancias que inicialmente se encuentran en regiones
de pH inferior a su punto isoeléctrico estarán cargadas
positivamente y migraran hacia el cátodo, mientras aquellas
que se encuentran en medios con pH más bajos que su
punto isoeléctrico tendrán carga negativa y migraran hacia el
ánodo. La migración les conducirá a una región dónde el
pH coincidirá con su punto isoeléctrico, tendrán una carga
neta nula y se detendrán. De esta forma las moléculas
amfotéricas se sitúan en estrechas bandas donde coincide
su punto isoeléctrico con el pH.

Fuentes de error en la electroforesis

La electroforesis es una técnica muy sensible y puede ser afectada por muchos errores experimentales,
como la temperatura durante la polimerización y la corrida del gel,, niveles de catalizador, velocidad de
la polimerización, pureza del reactivo, tiempo de corrida y preparación de las muestras.
Bibliografía:
-Técnicas de bioquímica y biología molecular -David Freifelder. (pag 234)
-Técnicas instrumentales en bioquímica y biología- Francisca Barceló Mairata,Universidad de las Islas Baleares (pag 169)
-Biologia Celular Y Molecular-Arnold Berk,Harvey Lodish (pag 87)
-Introducción a la biología celular- Bruce Alberts,Dennis Bray (pag 163)
-Bioquímica- Donald Voet,Judith G. Voet (pag 152)
-Fundamentos De Bioquimica/ Fundamental of Biochemistry-Donald Voet,Judith G. Voet (pag 105)
-Principios de análisis instrumental-Douglas A. Skoog,F. James Holler,Stanley R. Crouch (pag 867)
Webgrafía:
http://es.wikipedia.org/wiki/Fotograf%C3%ADa_Schlieren -http://es.wikipedia.org/wiki/Electroforesis-
http://bvs.sld.cu/revistas/uni/vol1_2_00/uni07200.htm