Desarrollo de un método de

lC-MS/MS
Rápido y sensible para la identificación y cuantificación de
Cloranfenicol en alimentos marinos.

Introducción

La aplicación de drogas veterinarias en la producción de alimentos de origen marino puede

llevar a la existencia de residuos tóxicos que requieren el desarrollo de métodos analíticos
convenientes y rápidos.
Este problema particular se demostró en el año 2001 en los Países Bajos y Bélgica dónde se
importaron camarones contaminados con cloranfenicol que luego fueron entregados a
través de un consignador a empresas radicadas en Alemania, Austria, Dinamarca, Polonia y
Rumania.

Para permitir un fácil control a estos problemas se ha desarrollado un método rápido y

sensible para la identificación y cuantificación de cloranfenicol en camarones que utiliza
cromatografía liquida acoplada a un espectrómetro de masas compacto de triple cuádruplo
(LC-MS/MS).

Condiciones experimentales

Preparación de muestras:

La extracción del cloranfenicol (CAP) de los camarones se realizó de acuerdo a un

procedimiento previamente descrito (J.M.Degroodt, B. Wyhowski de Bukanski, J. De Groof,
H. Beernaert and S. Srebrnik, J. Liquid Chrom., 15,13, 2355-2371, 1992), según el cual 10
gr de tejidos de camarones (a los cuales se agrego como estándar interno cloranfenicol
deuterado, CAP-d5,en una concentración de 1 ppb) son mezclados y agitados con 12 ml de
acetato de etilo y posteriormente centrifugados.

La fase orgánica se evapora a sequedad y se redisuelve en una mezcla de eter de petróleo

– Acetato de amonio (7:1, v/v). La mezcla es agitada y luego de su centrifugación se
agregan 3 mL de pentano a la fase acuosa.
Después de agitar y centrifugar, se agregan 2 mL de acetato del etilo a la fase acuosa, se
realiza una extracción y la fase de acetato de etilo se evapora a sequedad redisolviendo
en la fase móvil.

Condiciones Cromatográficas:

• HPLC: Waters Alliance 2695

• Columna: C18 (3.2 x 150 mm, 5 µm)
• Fase móvil: Agua - Metanol (45:55, v/v)
• Caudal : 400 µl/min
• Volumen de inyección :10 µl
• Válvula AutoDivert: La válvula Rheodyne ubicada en el frente del espectrómetro
de masas fue programada para desviar el caudal del HPLC, durante los primeros
2 minutos y el último minuto de la corrida cromatográfica, a descarte.

Condiciones de MS

• Espectrómetro de masa: Micromass Quattro Micro.

• Modo de Ionizacion: ES iones negativos.
• Voltaje capilar: 3.5 kV.
• MS/MS: Argón a 3.3 x 10-3 mbar como gas de colisión.

Resultados Y Discusión

El cloranfenicol- d5 se usó como estándar interno para los propósitos de cuantificación. En

la tabla 1 se resumen las condiciones de monitoreo múltiple de reacción (MRM) y las
condiciones que se usaron en el análisis de cloranfenicol y su análogo deuterado.

Tabla 1: Iones precursores y producidos bajo ESI (-)

La figura 1 muestra los cromatógramas LC-MS-MS obtenidos en el análisis de una muestra

de camarones contaminados con 0.1 ppb de cloranfenicol. El estándar interno esta en una
concentración de 1 ppb.

Basándose en la respuesta observada para el ion producido en menor intensidad al nivel

de 0.1 ppb, es posible predecir un limite de detección (LOD) menor a 0.05 ppb.

Para la evaluación de la linealidad del método, se fortificaron los blancos de los extractos
de camarones con concentraciones conocidas (0 -0.1 - 0.5 - 1 - 5 y 10 ppb) de
cloranfenicol y el estándar interno se agrego a cada muestra en una concentración de 1
ppb.

Cada nivel de concentración se inyectó por triplicado y la curva de la calibración se generó

por medio del software de cuantificación QuanLynx.
El grafico típico de respuesta vs. concentración se muestra en Figura 3 (las tres
transiciones de MRM fueron usadas para producir curvas de calibración separadas y, cada
una de las transiciones de MRM individuales mostró una respuesta lineal en el rango de
concentraciones investigada pudiéndose usar para la cuantificación).

Dos muestras de camarones contaminadas con 0.1 y 0.5 ppb se inyectaron cinco veces y
se determino la exactitud del método comparando la media de las concentraciones halladas
con la concentración teórica agregada a las muestras. Estos resultados se presentan en la
tabla 2

Tabla 2: Exactitud del método de LC-MS/MS desarrollado para la determinación de

cloranfenicol en camarones

La precisión de inyección también fue evaluada calculando la desviación relativa estándar

(% RSD) de la relación área de cloranfenicol / área del estándar interno para los tres iones
producidos. Los resultados se presentan en Tabla 3.

Tabla 3: Precisión de inyección

Además, el método se probó en muestras de camarones reales obtenidas durante la crisis

del cloranfenicol. Una muestra dio negativa, mientras dos muestras restantes se
encontraron contaminadas con concentraciones de cloranfenicol de 0.43 y 0.80 ppb.

El cloranfenicol se identificó claramente en estas muestras (se observaron las tres

transiciones de MRM diferentes, y las proporciones de intensidad de las transiciones
coincidieron con las calculadas) superando las especificaciones vigentes. Según las
recomendaciones de la Unión Europea sólo seria necesario verificar dos transiciones MRM.

La Figura 3 corresponde a los cromatogramas LC-MS-MS obtenidos para la muestra real

con 0.43 ppb de cloranfenicol

Conclusión
El presente método permite un análisis rápido y sensible para la identificación y
cuantificación de cloranfenicol en muestras de camarones, siendo potencialmente aplicable
a otros alimentos de origen marino.

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