Вы находитесь на странице: 1из 33

COLETA E PROCESSAMENTO DE AMOSTRAS AMBIENTAIS

SOLOS E SEDIMENTOS
Solos são ambientes heterogêneos e descontínuos que contêm um grande número
de diferentes grupos de microrganismos. Populações microbianas do solo variam com a
profundidade e tipo de solo, sendo que a região mais superficial do solo geralmente
apresenta mais organismos que a região da subsuperfície. Populações não variam somente
com a profundidade e tipo de solo, mas também variam de local para local, e até em um
mesmo local, em decorrência de variações naturais de microsítios que podem permitir que
microrganismos bem diferentes coexistam lado a lado. Dada a grande variabilidade dos
ecossistemas, é geralmente necessário que se retire mais de uma amostra para se obter
uma análise microbiana representativa de um local. Por esta razão, a estratégia global de
amostragem vai depender de muitos fatores, incluindo o objetivo da análise, os recursos
disponíveis e as características do local. A abordagem mais precisa é tirar muitas amostras
de um dado local e realizar uma análise separada para cada uma. Contudo, em muitos
casos, tempo e esforço podem ser poupados pela combinação de amostras retiradas para
formar uma amostra composta, que é usada para limitar o número de análises a serem
realizadas. Outra abordagem utilizada com freqüência é a de se amostrar uma localidade
seqüencialmente ao longo de certo tempo a partir de um pequeno local definido para
determinar efeitos temporais sobre os microrganismos. Como tantas opções estão
disponíveis, é importante delinear uma estratégia de amostragem para garantir a
confiabilidade do estudo. Isso pode ser feito pelo desenvolvimento de um plano para o
projeto de garantia de qualidade (QAPP). Um QAPP envolve o delineamento de
detalhes da estratégia de amostragem, métodos de amostragem e o subseqüente
armazenamento de todas as amostras. Pode incluir, ainda, detalhes das análises
microbiológicas a serem empregadas na avaliação das amostras. Componentes básicos de
um QAPP incluem:
- Estratégia de amostragem: número e tipos de amostras;
- Métodos de amostragem: técnicas específicas e equipamentos a serem utilizados;

1
- Armazenamento das amostras: tipos de recipientes, métodos de preservação das
amostras e tempo máximo de armazenamento.

8.1.1) Estratégias e métodos de amostragem para solos superficiais.


Amostras de solo volumosas são facilmente obtidas com uma pá ou,
preferencialmente, com um trado (Fig 8.1). Trados são mais precisos que pás, uma vez
que garantem que as amostras são tiradas a uma mesma profundidade em cada ocasião.
Isso é importante, já que cada fator do solo pode variar consideravelmente com a
profundidade, tal como o oxigênio, umidade, conteúdo de carbono orgânico e a
temperatura do solo. Um simples trado de mão é útil para se retirar amostras rasas de solo
de áreas não saturadas. Em condições adequadas, um trado de mão pode ser usado para
profundidades de até dois metros, embora alguns solos sejam compactados demais ou
com rochas demais para permitir a amostragem a essa profundidade. Ao se retirar
amostras para análise microbiológica, deve-se considerar a contaminação que pode
ocorrer conforme o trado é empurrado dentro do solo. Neste caso, microrganismos que se
prendem aos lados do trado, na medida em que ele é inserido no solo e empurrado para
baixo, podem contaminar amostras retiradas de profundidades maiores. A fim de
minimizar tal contaminação, pode-se usar uma espátula estéril para raspar a camada mais
externa da amostra e utilizar somente a parte mais central da amostra para análise. A
contaminação também pode ocorrer entre amostras, mas isto pode ser evitado pela
limpeza do trado após a retirada de cada amostra. O procedimento de limpeza envolve a
lavagem do trado com água, enxágüe com etanol a 75% ou solução de cloro a 10%, e um
enxágüe final com água esterilizada.
Como os solos são heterogêneos e um trado possui diâmetro limitado, a amostra
coletada pode não ser verdadeiramente representativa para aquele local. Assim sendo,
várias amostras devem ser coletadas e estruturadas em uma amostra composta, a fim de
reduzir o número total de amostras e o custo associado ao número de análises que serão

2
realizadas. Amostras compostas são obtidas pela coleta de iguais quantidades de amostras
de solo retiradas ao longo de uma área ampla que são colocadas em um balde ou saco
plástico. A massa de solo é então misturada e se obtém a amostra composta. Para se
reduzir o volume de amostras a serem armazenadas, uma parte da amostra composta pode
ser removida e se tornar a amostra a ser analisada. Em todos os casos, as amostras devem
ser armazenadas sob refrigeração até serem processadas e analisadas. Dependendo do tipo
de análise que será realizada (por exemplo, as que envolvem a extração de DNA ou RNA
para estudos moleculares das comunidades microbianas), as amostras devem ser
congeladas. Quando o interesse é a atividade microbiana ou a determinação da biomassa
ou tamanho das populações microbianas, ou quando se deseja isolar microrganismos do
solo, as amostras devem ser mantidas sob refrigeração.

Fig 8.1 - Trado de mão

Em alguns casos, uma série de parcelas ou de campos experimentais precisa ser


amostrada para se testar o efeito de tratamentos dados ao solo, tal como a adição de
fertilizantes, de pesticidas ou de biossólidos obtidos em sistemas de tratamento do esgoto,
sobre populações microbianas. Neste caso, uma amostra do solo deve ser retirada de cada
uma das parcelas ou campos para comparar parcelas-controle não-tratadas com as
parcelas que receberam um dado tratamento. Por exemplo, um pesquisador pode estar

3
interessado na influência de fertilizantes nitrogenados sobre as populações nitrificantes do
solo. O pesquisador irá então amostrar uma parcela não-fertilizada (o controle) para
comparar com uma parcela que tenha sido tratada com o fertilizante inorgânico. Outro
exemplo seria o de um solo que recebeu a aplicação de biossólido de esgoto tratado, o
qual é amostrado para subseqüente análise de vírus patogênicos. Em ambos os exemplos,
múltiplas amostras ou réplicas sempre fornecem uma estimativa mais precisa dos
parâmetros de interesse. Contudo, os trabalhos de campo podem ser custosos e o número
de amostras retiradas deve ser definido de acordo com o custo das análises e com os
fundos disponíveis. Nos exemplos dados, planos de amostragem bidimensionais podem
ser utilizados para determinar-se o número e a localização das amostras que serão
retiradas. Na amostragem bidimensional, para cada parcela são atribuídas coordenadas
espaciais e um conjunto de pontos de amostragem é escolhido de acordo com um plano
estabelecido. Alguns padrões de amostragem bidimensional típicos, incluindo ao acaso,
de corte transverso, em dois estágios e amostragem em grade, são ilustrados na Fig. 8.2.

Figura 8.2 – Padrões de amostragem

4
A amostragem ao acaso envolve a escolha fortuita de pontos dentro da parcela de
interesse, os quais são então amostrados a uma profundidade definida. Amostragem de
corte transverso consiste na coleta de amostras em uma só direção. Por exemplo, a
amostragem de corte transverso pode ser útil em uma área próxima às margens de um rio,
onde os cortes transversais poderiam ser escolhidos adjacentemente ao leito do rio, e a
ângulos retos do leito do rio. Dessa forma, a influência do rio (ou córrego) nas populações
microbianas poderia ser avaliada. Na amostragem em dois estágios, uma área é dividida
em subunidades regulares chamadas unidades primárias. Dentro de cada unidade
primária, sub-amostras podem ser retiradas ao acaso ou sistematicamente. Esta
abordagem pode ser útil, por exemplo, quando um local consiste de um declive lateral de
um morro e um nível plano, e é provável que haja variabilidade entre as unidades
primárias. O exemplo final de padrão de amostragem é a amostragem em grade, na qual
as amostras são retiradas sistematicamente em intervalos regulares com espaçamento fixo.
Esse tipo de amostragem é útil para o mapeamento de uma área quando pouco se sabe
sobre a variabilidade do solo.
Amostragem bidimensional não fornece nenhuma informação sobre mudanças nas
populações microbianas de acordo com a profundidade. Assim sendo, amostragem
tridimensional é usada quando se requer informação em relação à profundidade. Tal
informação sobre profundidade é crítica quando são avaliados locais que foram
contaminados por resíduos perigosos ou por derramamento de contaminantes.
Amostragem tridimensional pode ser tão simples quanto retirar amostras a 50-cm
aumentando até 200-cm, ou pode envolver perfurações de até várias centenas de metros
na sub-superfície. Para amostragem na subsuperfície, é necessário equipamento
especializado e é essencial que se garanta que as amostragens da subsuperfície não
estejam contaminadas por solo da superfície.
Finalmente, deve-se atentar para a existência de uma zona especializada do solo
que está sob influência direta das raízes de plantas. É a chamada rizosfera, que é de
especial interesse dos microbiologistas de solo e fitopatologistas, dada a acentuada
atividade microbiana e a ocorrência de várias interações planta-microrganismos

5
específicas. O solo da rizosfera existe como uma continuação da superfície da raiz
(rizoplano) até um ponto onde a raiz não mais exerce influência nas propriedades
microbianas. Para a amostragem de solo rizosférico, normalmente escavam-se
cuidadosamente as raízes para remover excessos ou solo que não seja da rizosfera. O solo
aderido às raízes da planta é então considerado como solo da rizosfera. Embora esse seja
um mecanismo simples de amostragem de solo rizosférico, ele permanece inalterado até
os dias de hoje. Como resultado, a amostragem de rizosfera permanece como o principal
limitante experimental, indiferente à sofisticação das análises microbianas que são
realizadas subseqüentemente.

8.1.2) Estratégias e métodos de amostragem para subsuperfície.


Abordagens mecânicas usando equipamentos de perfuração são necessárias para a
amostragem do ambiente da subsuperfície. Isto aumenta significativamente o custo da
amostragem, especialmente para a subsuperfície profunda. Como resultado, poucos cores
(material que fica contido no cilindro central) foram até o momento retirados da
subsuperfície a grandes profundidades, e todas as tentativas de se realizar tal feito
envolveram grandes equipes de pesquisadores (Veja Capítulo 4, Estudo de Caso). A
abordagem usada para amostragem, tanto na subsuperfície rasa como profunda, depende
se a mesma está saturada ou não. Para sistemas não-saturados, a perfuração por
perfuratriz a ar pode ser usada para se obter amostras de profundidades de até várias
centenas de metros (Chapelle, 1992). Na perfuração por perfuratriz a ar, um grande
compressor é usado para forçar o ar para baixo em um cano perfurador, para fora da broca
de perfuração e para cima, do lado de fora do buraco escavado (Fig. 8.3). Conforme o
cilindro central vai atravessando o solo, indo para baixo, o ar serve para “assoprar” o
material trespassado primeiro para fora do buraco, bem como para resfriar o cilindro
central. Isto é importante, porque se o cilindro central se superaquecer, microrganismos
dentro da amostra podem ser efetivamente esterilizados, apresentando dificuldade para

6
análise microbiana subseqüente. Em uma perfuração normal com ar, pequenas
quantidades de água contendo um surfactante são injetadas na corrente de ar para
controlar a poeira e ajudar a resfriar o equipamento perfurante. No entanto, isto aumenta a
possibilidade de contaminação, de modo que cores como os obtidos na planície do Rio
Snake, em Idaho, foram perfurados somente com ar (Colwell, 1989). Para ajudar a manter
o cilindro central resfriado, a retirada de material é simplesmente feita lentamente, a fim
de se evitar superaquecimento. Para auxiliar a manutenção de condições estéreis e
prevenir contaminação por ar da superfície, todo o ar utilizado no processo de retirada do
core era pré-filtrado por um filtro particular de alta eficiência (HEPA) de 0,3 µm.
Imediatamente após o core ser coletado, a camada superficial foi raspada com uma
espátula estéril, e então o subcore foi retirado com uma seringa plástica estéril de 60 mL
com a extremidade removida. As amostras foram imediatamente resfriadas e enviadas a
um laboratório, onde as análises microbianas foram iniciadas dentro de 18 horas após a
coleta.

7
Figura 8.3 – Na perfuração rotatória, a rotação mecânica de uma ferramenta de perfuração
é usada para criar um buraco. Ora ar (perfuração rotatória por ar) ora um fluido composto
por lama de perfuração (perfuração rotatória por lama) é forçado pela haste da broca
abaixo para deslocar os restos do buraco perfurado para fora da broca e para cima da
superfície. Esta figura ilustra a perfuração rotatória por lama.

Ambientes saturados de subsuperfície são amostrados de forma um pouco


diferente, porque os sedimentos são bem menos coesivos que aqueles encontrados em
regiões não-saturadas. Assim sendo, o orifício deve ser mantido de forma que um core
intacto possa ser retirado e removido a cada profundidade desejada. Para amostragem a
profundidades abaixo de 30 metros, utiliza-se um trado de haste oca e um tubo para
empurrar (Fig. 8.4). O trado consiste de um tubo oco com uma parte rotatória na ponta
que perfura o buraco. Na parte externa do invólucro, o trado oco possui um espiral
reverso de forma que o material perfurado é empurrado para cima e para fora do buraco,
conforme a perfuração prossegue. Enquanto o orifício é perfurado, o invólucro do trado é

8
mantido no lugar para manter o buraco aberto. Dessa forma, o invólucro atua como uma
proteção dentro da qual o segundo tubo, o cilindro central, é inserido para coletar a
amostra quando a profundidade desejada foi alcançada. O cilindro central é basicamente
um tubo estéril que é colocado na ponta do trado de haste oca, direcionado para baixo
para coletar a amostra de sedimento e depois recuperado. A perfuração pode continuar até
a próxima profundidade desejada e o processo de retirada de amostra é repetido. Cada
core coletado é removido, resfriado e enviado a um laboratório para estudo. Para evitar a
contaminação das amostras, a parte externa é removida ou o core pode ser subcored
(dividido em subcores).

Figura 8.4 – Diagrama de trado de haste oca. Note a perfuração reversa no exterior do trado. Isto é
utilizado para deslocar os retos do buraco perfurado para cima da superfície. Este tipo de trado era usado
na universidade de Purdue para coletar amostras de core (núcleo) em profundidades de até 26m para
análise microbiana e de solo conforme descrito por Konopca e Turco (1991) (veja fig. 4.19). Um subcore
de cada core coletado é removido usando-se um amostrador de colher de ruptura ou um tubo de empurrar.
Em ambos os casos a parte externa do core deve ser considerada como contaminada. Assim sendo, a aprte
externa é raspada com uma espátula estéril ou o subcore pode ser removido usando-se uma seringa
plástica estéril. Alternativamente, como mostrado na figura, cores intactos são automaticamente aparados
para remover o material externo contaminado, deixando somente o core interno estéril..

9
Para cores de profundidades maiores que 30 metros, um perfurador rotatório de
lama é utilizado (Chapelle, 1992). Neste caso, o buraco é também perfurado usando-se
um equipamento giratório. No entanto, fluidos da perfuração são usados para remover o
material perfurado do orifício e para aplicar pressão às paredes do buraco, para evitar que
ele desmorone. Perfuratriz rotatória de lama tem sido usada para obter amostras de
sedimento a 900 metros abaixo da superfície do solo. Um exemplo de tal core é um
retirado a partir de sedimentos profundos da subsuperfície da planície costeira, na
Carolina do Sul. Durante esta perfuração, amostras foram retiradas de profundidades que
variavam de 360 a 460 metros. A fim de garantir a integridade dos cores obtidos, os
fluidos da perfuração receberam “rastreadores”, brometo de potássio e corante rodamina.
O uso desses dois marcadores permitiu que os pesquisadores avaliassem quanto os fluidos
de perfuração haviam penetrado nos cores. Qualquer área dos cores que estão
contaminadas com os marcadores devem ser descartadas. Os cores eram recuperados em
sacos de plástico, resfriados e enviados para análise imediata.
É importante enfatizar que perfurações tanto de ambientes saturados quanto não-
saturados é um processo difícil por várias razões. Primeiro, pode levar anos para se
planejar e obter fundos para proceder um core como aqueles descrito aqui para a planície
do rio Snake e a planície costeira do sudeste. A perfuração efetiva e a recuperação de
amostras é um problema de engenharia cuja sofisticação foi somente comentada nesta
seção. Também lembre-se que os cores obtidos não são sempre verdadeiramente
representativos dos sedimentos dos quais são retirados. Por exemplo, um core de 4 pés
pode ser consideravelmente comprimido durante o processo de remoção, de forma que é
difícil identificar exatamente a profundidade de qual foi retirado. Uma segunda
dificuldade na obtenção de amostras representativas deve-se à heterogeneidade no
material da subsuperfície. Tais heterogeneidades podem significar que duas amostras
retiradas a poucos pés de distância podem ter características físicas, químicas e
microbiológicas diferentes. Finalmente, para análises microbiológicas não é suficiente
simplesmente recuperar a amostra; a amostra deve ser descontaminada e a logística do
armazenamento e análise deve ser considerada também.

10
8.1.3) Processamento e armazenamento de amostragem
Análises microbianas deviam ser realizadas o mais rápido possível após a coleta de
solo para minimizar os efeitos do armazenamento sobre as populações microbianas. Uma
vez removidas do campo, populações microbianas de uma amostra podem e irão mudar
indiferentes ao método de estocagem. Reduções no número de microrganismos e na
atividade microbiana foram relatadas mesmo quando amostras de solo foram armazenadas
nas mesmas condições de humidade do campo a 4°C por somente 3 meses (Stotzky et al.,
1962). Curiosamente neste estudo, embora populações bacterianas tenham mudado,
populações de actinomicetos permaneceram inalteradas.
O primeiro passo na análise microbiana de uma amostra de superfície de solo
geralmente envolve peneiramento através de uma malha de 2 mm para remover pedras
grandes e fragmentos. Entretanto, para isso a amostra deve ser geralmente seca ao ar para
facilitar o peneiramento. Isso é aceitável contanto que a humidade do solo não fique baixa
demais, pois isto também pode reduzir a população microbiana (Sparkling & Ceshire,
1979). Após o peneiramento, o armazenamento em curto prazo deve ser a 4°C
anteriormente a analise. Se amostras forem estocadas, alguns cuidados devem ser
tomados para a garantia de que as amostras não se ressecaram e que condições
anaeróbicas não foram desenvolvidas, uma vez que isso também pode alterar populações
microbianas. O armazenamento por até 21 dias parece deixar a maioria das propriedades
microbianas do solo inalteradas (Wollum, 1994), mas novamente o tempo é a essência da
análise microbiana. Note que a amostragem rotineira da superfície do solo não requer
procedimentos estéreis. Esses solos são continuamente expostos à atmosfera, então se
pode presumir que tal exposição durante a amostragem e processamento não afetarão o
resultado significativamente.
Mais cuidado é tomado com o processamento de amostras da subsuperfície por três
razões. Primeiro, elas têm contagens de culturas mais baixas, o que significa que um
contaminante microbiano externo pode afetar significativamente os números contados.
Segundo, os sedimentos da subsuperfície não estão constantemente expostos à atmosfera,

11
assim, contaminantes microbianos da atmosfera podem contribuir substancialmente para
os tipos microbianos encontrados. Terceiro, é mais caro obter amostras subsuperficiais, e
geralmente não há segunda chance para a coleta. Amostras subsuperficiais obtidas por
coring são ora congeladas imediatamente e mandadas para o laboratório como um core
intacto ora processados no local de coring. Em ambos os casos, a parte externa do core é
normalmente raspada com uma espátula estéril ou um subcore é retirado usando-se uma
seringa plástica de diâmetro menor. A amostra é então colocada em uma sacola plástica
estéril e analisada imediatamente ou congelada para análise futura.

8.1.3.1) Processamento de amostras de solo e sedimento para bactéria


Métodos tradicionais para análise de populações microbianas geralmente envolvem
análises de cultura utilizando diluições e metodologia de plaqueamento em meios
seletivos e diferenciais ou contagem direta (veja Capítulo 10). Contagens diretas oferecem
informação sobre o número total de bactérias presentes, porém não fornece informação
sobre o número ou diversidade de populações presentes. Contagens por plaqueamento
permitem a enumeração do total de populações ou das populações selecionadas da cultura
e por essa razão provêm informações sobre as diferentes populações presentes. No
entanto, dados obtidos indicam que geralmente menos que 1% das bactérias do solo são
cultiváveis (Amann et al., 1995), então as informações culturais fornecem somente uma
parte do quadro. Em adição, o tipo de meio escolhido para contagens em cultura vai
selecionar as populações que melhor crescerem naquele meio em particular. Assim, a
escolha do meio é crucial na determinação dos resultados obtidos. Isso está ilustrado pelos
dados da Tabela 8.1, que mostra que enquanto contagens diretas de uma série de amostras
de sedimento medindo 4-9 m de profundidade eram similares, as contagens de cultura
variaram dependendo do tipo de meio utilizado. Um meio nutricionalmente rico, PTYG,
composto de peptona, tripticase, extrato de levedura, e glicose, consistentemente forneceu
contagens que eram de uma a três ordens de magnitude menores que as contagens a partir
de dois meios pobres em nutriente que foram testados. Estes eram uma diluição 1:20 de
PTYG e ágar de extrato de solo de uma suspensão 1:20 de superfície de solo. Esses dados

12
refletem o fato de que a maioria dos microrganismos do solo vive sob condições
limitantes de nutrientes.

Uma técnica poderosa que foi desenvolvida nos últimos anos envolve a obtenção e
o estudo de extratos de DNA total de bactérias de uma amostra de solo (veja Capítulo 13).
Essa abordagem permite que informação seja obtida sobre os tipos de populações
presentes e seu potencial genético. Como nas demais técnicas, há limitações nos dados
que podem ser obtidos com extração de DNA. Por conseguinte, muitos pesquisadores
utilizam a extração de DNA em conjunto com contagens diretas e contagens em cultura
para maximizar os dados obtidos de uma amostra ambiental. Há duas metodologias para o
isolamento de DNA bacteriano a partir de amostras de solo (Fig. 8.5). A primeira se
baseia no fracionamento da bactéria do solo seguido de lise celular e extração do DNA. O
segundo método envolve a lise da bactéria in situ na matriz do solo com subseqüente
extração do DNA liberado a partir das células. Ambos os métodos são discutidos mais
adiante nas próximas seções.

13
Fig 8.5 - Métodos de obtenção de DNA de comunidade do solo.

Extração de células do solo e subseqüente recuperação de DNA


Nesta abordagem, células completas são removidas da amostra e depois lisadas
para a retirada do DNA. Um protocolo de extração de bactérias do solo a certa
profundidade foi desenvolvido por Holben (1994). O primeiro passo é a homogeneização
da amostra de solo ou sedimento para quebrar agregados e desalojar fungos e células
bacterianas. Para homogeneizar uma amostra, normalmente 10g do solo são colocados em
um tampão contendo polivinilpolipirrolidona (PVPP). O PVPP forma um complexo com
os ácidos húmicos e auxilia em sua remoção, um passo importante, visto que materiais

14
húmicos geralmente interferem na análise de DNA. As partículas de solo e sedimento,
bem como células fúngicas, são removidas por centrifugação em baixa velocidade,
seguida de centrifugação em alta velocidade para recuperar as células bacterianas. Esse
processo é conhecido como centrifugação diferencial. Geralmente são necessárias várias
seqüências de centrifugação para garantir que um número máximo de bactérias seja
recuperado.
Após as células serem recuperadas, elas são lisadas pela adição da enzima
lisozima. Os fragmentos celulares são removidos por centrifugação e o DNA livre
extraído do sobrenadante é purificado. O rendimento de DNA obtido varia com a amostra,
mas geralmente fica em torno de 1-5 µg por grama de superfície de solo. Para pôr isto em
perspectiva, o protocolo vai recuperar cerca de 33% população bacteriana total de um solo
complexo contendo areia, argila e lodo (Holben et al., 1988). Solos com altas taxas de
argila, não irão produzir altas recuperações por células bacterianas firmemente agrupadas
são removidas com partículas de solo durante a etapa de centrifugação em baixa
velocidade. Agrupamento das células também afeta as populações bacterianas específicas
que são recuperadas. Bactérias de metabolismo acelerado que produzem novas células por
fissão binária são menos firmemente agrupadas e preferencialmente recuperadas. Em
contraste, células mais velhas que não estão crescendo ativamente tendem a se agruparem
mais firmemente e são perdidas (Holben, 1994). Assim sendo, esse processo seleciona
bactérias com base em sua viscosidade ou grau de agrupamento dos colóides de argila (ou
barro), e nem todos os tipos celulares são extraídos com a mesma eficiência. Finalmente,
note que esse processo é altamente trabalhoso (6-8 horas são necessárias para seis
amostras) e não auxilia propriamente em estudos nos quais muitas amostras precisam ser
analisadas.
O procedimento tem, contudo, algumas vantagens em relação ao método de lise in
situ. Primeiro, somente o DNA bacteriano é efetivamente recuperado porque as bactérias
são separadas das células fúngicas anteriormente à lise celular. O método também rende
células viáveis a partir da comunidade bacteriana do solo que poderiam ser sub-

15
amostradas e analisadas de formas variadas. Note, contudo, que células não viáveis
intactas também serão recuperadas.

Lise in situ e recuperação de DNA


Nesta metodologia, os microrganismos de interesse devem ser lisados dentro do
solo e seu DNA liberado antes de sua extração da amostra. Metodologias de lise celular
geralmente envolvem a combinação de tratamentos físicos e químicos. Para bactérias,
tratamentos físicos envolvem ciclos de congelamento-descongelamento e/ou sonication
(disruptura de material biológico por ondas sonoras) ou centrifugação de gotas, e
tratamentos químicos normalmente utilizam detergentes dodecil sulfato de sódio (SDS)
ou uma enzima tal como lisozima ou proteinase (More et al., 1994). Após a lise,
fragmentos celulares e partículas de solo são removidos por centrifugação, e o DNA no
sobrenadante é precipitado com etanol. O DNA pode ser purificado por passagem através
de colunas caseiras ou comerciais embaladas em resinas ou géis íon-transportadores.
Essas etapas são cruciais para a remoção de material húmico, que inibiria a análise do
DNA. Purificação adicional pode ser alcançada com extrações por fenol-clorofórmio/
isoamil álcool, seguidas mais uma vez de precipitações com etanol (Xia et al., 1995).
Amostras puras de DNA são necessárias para permitir análises moleculares subseqüentes
tais como a reação da cadeia de polimerase (PCR) (veja capítulo 13.3.2). No entanto,
independente de qual metodologia de purificação for empregada, cada passo do processo
de purificação causa perda de DNA. Dessa forma, DNA purificado é obtido somente às
custas do rendimento de DNA.
Uma maior vantagem da metodologia de lise direta é o fato de ser menos
trabalhosa e mais rápida que o método de fracionamento bacteriano. Além disso, também
geralmente produz maiores rendimentos de DNA (1-20µg de DNA por grama de solo).
Finalmente, essa abordagem parece representar melhor a comunidade bacteriana melhor
que o método de fracionamento uma vez que não é afetada pela fixação das células aos
colóides da argila. Como resultado, o método de lise direta é mais comumente utilizado.
Embora a lise direta tenha muitas vantagens, também apresenta alguns problemas. Um

16
problema associado à extração do DNA é a distinção do DNA livre do DNA celular. O
DNA livre liberado a partir dos microrganismos lisados naturalmente algum tempo antes
da extração do DNA pode, às vezes, estar protegido da degradação por fixação a
partículas do solo (Lorentz & Wackernagel, 1987). Contudo, a evidência disponível
indica que o DNA livre (extracelular) é ora degradado rapidamente ora se fixa à colóides
do barro e normalmente não é extraído por esses procedimentos (Holben, 1994). A
fixação do DNA de células lisadas à colóides do barro ou húmicos também pode reduzir o
rendimento de DNA extraído (Ogram et al., 1987). Na verdade, a maior desvantagem do
método de lise direta é que o DNA é geralmente mais contaminado por material húmico
que o DNA obtido pelo método de fracionamento bacteriano. Outra desvantagem é que o
DNA isolado pela lise direta tende a ser arrebentado ao acaso e de menor peso molecular
que o DNA extraído após o fracionamento celular. Originalmente, pensava-se que o DNA
obtido por lise in situ poderia também conter DNA de fungos e protozoários. Todavia, os
produtos químicos normalmente utilizados não lisam células fúngicas, os protozoários
estão presentes no solo a densidades muito mais baixas que as bactérias.
Conseqüentemente uma população de protozoários de 104 por grama é improvável de
contribuir significativamente com o DNA obtido de 108 – 109 bactérias, mesmo admitindo
o maior tamanho do genoma de protozoa.
Uma vez que uma amostra de DNA purificado é obtida a partir de uma amostra de
solo, ela pode ser quantificada por espectroscopia ultravioleta (UV). Normalmente as
leituras são feitas a comprimentos de onda de 260 nm e 280 nm a partir das quais a pureza
e quantidade do DNA podem ser estimadas (veja Quadro de Informações).
Após a quantidade de DNA por massa de solo ser conhecida, estimativas da
população microbiana podem ser feitas. Para bactérias como Escherichia coli, um
cromossomo típico contém 4-5 milhões de pares de bases, equivalente a cerca de 9 fg (9 x
10-5 g) de DNA. Contudo, a quantidade de DNA por célula varia e outras estimativas são
mais baixas, aproximadamente 4fg por célula. A quantidade de DNA por célula também
pode varia devido à replicação cromossômica ocorrer mais rápido que a divisão celular,
resultando em dois ou três cromossomos por célula (Krawiec & Riley, 1990). Estas

17
estimativas teóricas de DNA podem ser usadas para relacionar o DNA total extraído e o
número de microrganismos de uma amostra. A Tabela 8.4 mostra o DNA total extraído de
quatro solos alterados com glicose. A quantidade de DNA obtido aumentou com a quantia
de matéria orgânica no solo (mistura de lodo e loam – mistura de areia, argila e matéria
orgânica), presumivelmente em função da presença de populações bacterianas mais
abundantes. O DNA extraído também diminuiu em solos com altas concentrações de
argila (loam de argila), mais possivelmente devido à fixação do DNA por colóides do
solo (Ogram et al., 1987). Além de tudo, a influência dos melhoramentos pode ser notada
com o tempo conforme a população microbiana aumenta por crescimento, resultando em
DNA mais fácil de ser extraído. O número teórico de células bacterianas que o DNA
extraído representa pode ser calculado.
Por exemplo, no tempo zero para o solo de mistura de barro:

DNA extraído = 0.12 µg / g de solo


Assim sendo, se cada célula possuir 4 fg de DNA,
Número de células = 0.12 x 10-6 g de DNA / g de solo
4 x 10-5 g de DNA / célula
= 3.0 x 107 células / g de solo

Valores similares no tempo zero para outros solos são 1.6 x 108 células / g de solo
(mistura arenosa), 3.3 x 108 células / g de solo (mistura) e 4.5 x 109 células / g de solo
(mistura limosa).
No total, o processamento de solo para obtenção de DNA bacteriano representa um
método alternativo para análises subseqüentes das comunidades bacterianas.
Metodologias comparáveis para obter DNA de comunidades de fungos ainda não foram
alcançadas. Isso pode se dever em parte à dificuldade de se lisar hifas de fungos sem
também lisar bactérias.

18
8.1.3.2) Processamento de solos para hifas fúngicas e esporos
Como para as bactérias, também é impossível o cultivo de todas as espécies viáveis
de fungos a partir de uma amostra de solo ou sedimento. Métodos de cultura para fungos
são descritos no Capítulo 10.3. Todavia, várias abordagens foram desenvolvidas para
isolamento direto de hifas ou esporos do solo. A primeira, é uma metodologia de lavagem
do solo. Esta, envolve a saturação de pequenos volumes de solo com água estéril. Os
agregados do solo são delicadamente desfeitos com um fino jato de água, permitindo que
partículas mais pesadas de solo seja sedimentadas e que partículas finas sejam removidas
para outro recipiente. O procedimento é repetido várias vezes até que somente
permaneçam as partículas mais pesadas. Estas então são espalhadas em um filme de água
estéril e examinadas sob microscópio de dissecção. Agulhas esterilizadas ou pinças bem
finas podem ser usadas para se obter qualquer hifa observada.
Para esporos, uma metodologia diferente pode ser usada. Amostras de solo
colocadas em caixas esterilizadas separadas cada uma delas contendo peneiras de
tamanhos graduados. As amostras de solo são lavadas vigorosamente em cada caixa, e
solo de tamanho definido é retido em cada uma das peneiras. Os esporos são
determinados empiricamente por lavagens sucessivas em placa (2 minutos por lavagem)
de cada peneira. Como as hifas são retidas pelas peneiras, qualquer colônia de fungos que
apareça deverá ser devido à presença de esporos. Informação sobre os fungos presentes
como hifas pode ser obtida pelo plaqueamento das partículas lavadas retidas pelas
peneiras. No entanto estes métodos de lavagem são intensamente trabalhosos e são
baseados na tentativa e erro em termos de que tamanhos são mais relevantes com relação
ao tamanho individual do esporo.
8.1.3.3) Processamento de lodo, solo e sedimento para vírus
Para avaliar de forma completa e entender os riscos de patógenos no ambiente, é
necessário determinar sua ocorrência em lodo da água de esgoto (biosólidos), solos aos
quais a água descartada ou lodo são aplicados, ou sedimentos marinhos que podem ser
afetados por descargas de água de esgoto ou dejetos do lodo. Na verdade, Agência de
Proteção Ambienta do E.U.A atualmente requer monitoramento de lodo para

19
enteroviroses para certos tipos de aplicações na terra. Para detectar vírus em sólidos é
primeiramente necessário extraí-los por processos que causarão sua liberação do sólido.
Como acontece com filtros microporosos (veja Capítulo 8.2.2.1), acredita-se que os vírus
se liguem a esses sólidos por uma combinação de forças eletrostáticas e hidrofóbicas (veja
Capítulo 7.2.3). Para recuperar vírus a partir dos sólidos, substâncias são adicionadas e
irão romper essas forças de atração, permitindo que os vírus sejam recuperados no fluido
diluidor(Berg, 1987; Gerba & Goyal, 1982).
O procedimento mais comum para lodo envolve a coleta de 500 – 1000 mL de lodo
e a adição de AlCl3 e HCl para ajustar o pH para 3.5. Sob estas condições, os vírus se
ligam às partículas de lodo, as quais são removidas por centrifugação e ressuspendida em
uma solução de extração de pH neutro para diluir o vírus. O problema principal com
concentrados de lodo de água de esgoto preparados dessa maneira é que eles geralmente
contêm substâncias tóxicas à cultura de células. Um diagrama dos detalhes deste
procedimento é apresentado na Figura 8.6. Técnicas de extração similares são utilizadas
para a recuperação de vírus a partir de solos e sedimentos aquáticos (Hurst et al., 1997).

8.2) ÁGUA
8.2.1) Estratégias e métodos de amostragem para água
A amostragem de águas ambientais para subseqüente análise microbiana é um
pouco mais fácil do que a amostragem de solos por uma série de razões. Primeiro, porque
a água tende a ser mais homogênea que solos, há menos variabilidade local entre duas
amostras coletadas na mesma vizinhança. Segundo, em geral, é fisicamente mais fácil
coletar amostras de água porque isso pode ser feito com bombas e mangueiras. Dessa
forma, volumes conhecidos de água podem ser coletados de profundidades conhecidas
com relativa facilidade. O montante de água coletado depende da avaliação da amostra
ambiental, porém pode variar de 1 mL a 1000 litros. A estratégia de amostragem também
é menos complicada para amostras aquáticas. Em muitos casos, devido à mobilidade da
água, um número de amostras volumosas é simplesmente coletado no mesmo ponto
durante intervalos de tempo variados. Tal estratégia seria útil, por exemplo, na

20
amostragem de um rio, ou na planta de tratamento de água potável. Para águas marinhas,
amostras são geralmente coletadas em tempos seqüenciais dentro de uma área de interesse
definida.
Embora a coleta de água seja relativamente fácil, o processamento da amostra
anteriormente à análise microbiana pode ser mais difícil. O volume da amostra de água
necessário para a detecção de microrganismos pode ser de difícil manuseio, uma vez que
o número de microrganismos tende a ser menor em amostras aquáticas que em amostras
de solo (veja Capítulo 6). Assim sendo, estratégias foram desenvolvidas para permitir a
concentração de microrganismos dentro de uma amostra de água. Para microrganismos
maiores, inclusive bactérias e protozoários parasitas, amostras são geralmente filtradas
para prender os organismos e concentrá-los. Em relação a bactérias, isso normalmente
envolve a filtração usando-se um filtro de membrana de 0.45 µm (Capítulo 10.2.1.3). Para
parasitas protozoários, filtros grossos tecidos com fibras são usados. Para vírus, amostras
aquáticas também são filtradas, mas devido às partículas virais serem geralmente
pequenas demais para serem fisicamente capturadas, a coleta das partículas virais depende
da combinação de interações eletrostáticas e hidrostáticas do vírus com o filtro. Os
variados requerimentos para o processamento de amostras de água para análise de vírus,
bactérias, e protozoários são descritas nas próximas duas seções.

8.2.2) Processamento de amostras de água para análise de vírus


A detecção e análise de vírus em amostras de água é geralmente difícil devido ao
baixo número encontrado e aos diferentes tipos que podem estar presentes. Há quatro
passos básicos na análise de vírus: coleta de amostra, diluição, reconcentração, e detecção
viral. Para coleta de amostras, é geralmente necessário passar grandes volumes de água
(100 a 1000 L) através de um filtro devido ao baixo número de vírus presentes. Os vírus
são concentrados a partir da água por adsorção ao filtro. A recuperação dos vírus a partir
do filtro envolve diluição do filtro coletor bem como uma etapa de reconcentração para
reduzir o volume da amostra antes do experimento. Vírus podem ser detectados por
cultura de células ou métodos moleculares como PCR. No entanto, ambos os métodos

21
podem ser inibidos pela presença de substâncias tóxicas na água que são concentradas
juntamente com as partículas virais. Muitas estratégias foram desenvolvidas para superar
as dificuldades associadas à análise viral, mas elas geralmente demandam muito tempo, e
são trabalhosas e custosas. Por exemplo, o custo da detecção de enterovírus varia de $600
a $1000 por amostra de água potável. Outro problema da análise viral é que a precisão e
a meticulosidade dos métodos usados sofrem devido ao grande número de etapas
envolvidas. Particularmente, a eficiência da recuperação viral associada a cada etapa
depende do tipo de vírus analisado. Por exemplo, o vírus da hepatite A pode não ser
concentrado tão eficientemente como rotavirus pelo mesmo processo. A variabilidade
também resulta da extrema sensibilidade desses experimentos. Métodos para a detecção
de vírus em concentrações tão baixas quanto uma unidade formadora de placa em 1000 L
de água foram desenvolvidos. Em uma base peso-por-peso com água, esta é uma
sensibilidade de detecção de uma parte em 108. Por comparação, o limite de sensibilidade
da maioria dos métodos disponíveis para compostos orgânicos é de cerca de 1µg / litro.
Isso corresponde a uma parte em 108.

8.2.2.1) Coleta de amostras


A análise viral é realizada em uma ampla variedade de tipos de água. Os tipos de
água testados incluem água potável, água do terreno e de superfície, água marinha, e de
esgoto. Essas águas variam grandemente em sua composição físico-química e contêm
substâncias dissolvidas ou suspendidas em solução, o que pode interferir na em nossa
habilidade de empregar uma variedade de métodos de concentração. A adequabilidade de
um método de concentração viral depende da densidade provável de vírus, das limitações
de volume do método de concentração para o tipo de água, e da presença de substâncias
interferentes. Uma amostra de volume de menos de 1 litro pode ser suficiente para a
recuperação de vírus a partir de água de esgoto pura e primária. Para água bebível e águas
relativamente não poluídas, os níveis de vírus são improváveis de serem tão baixos que
centenas ou até milhares de litros devam ser amostrados para aumentar a probabilidade da

22
detecção de vírus. Vários métodos empregados para a concentração de vírus a partir de
água são mostrados na Tabela 8.5.
A maioria dos métodos usados para concentração de vírus depende da adsorção do
vírus a uma superfície, tal como um filtro ou precipitado mineral, embora hidroextração e
ultrafiltração tenham sido empregadas (Gerba, 1987). Sistemas de campo para
concentração de vírus geralmente consistem de uma bomba para passagem de água
através do filtro (a taxas de 5 a 10 galões por minuto), um suporte para o filtro, e um
medidor de fluxo (Fig. 8.7A). O sistema inteiro pode, na maioria das vezes, ser contido
em uma caixa de gelo de 20 litros de capacidade.

A classe de filtros mais comumente utilizada para concentração de vírus a partir de


grandes volumes de água é a de filtros microporosos de adsorção-diluição, mais

23
conhecidos como VIRADEL (para vírus adsorção-diluição) (APHA, 1995). VIRADEL
envolve a passagem da água através de um filtro ao qual os vírus adsorvem. O tamanho
do poro dos filtros é muito maior que os vírus, e a adsorção se dá por uma combinação de
interações hidrostáticas eletrostáticas (Gerba, 1984). Dois tipos gerais de filtro estão
disponíveis: eletronegativo (carga da superfície negativa) e eletropositivo (carga da
superfície positiva). Filtros eletronegativos são compostos de ora de ésteres de celulose
ora de fibra de vidro com resina orgânica de ligação. Como os filtros são carregados
negativamente, sais catiônicos (MgCl2 ou AlCl2) devem ser adicionados em conjunto com
a redução de pH a 3.5. Isto reduz a carga negativa da rede geralmente associada a vírus,
permitindo que a adsorção seja maximizada (veja Capítulo 2.1.4.1). Tal ajuste de pH pode
ser enfadonho, conforme requer a modificação da água anteriormente à filtração e uso de
materiais e equipamentos adicionais, tais como medidores de pH. O filtro eletronegativo
mais usado é o Filterite. Geralmente é usado como um cartucho pregueado com tamanho
de poros variado, ora de 0.22µm ora de 0.45µm.
Filtros eletropositivos são ideais para a concentração de vírus a partir da água do
mar e de águas com elevadas quantidades de matéria orgânica e turbidez (Gerba et al.,
1978). Filtros eletropositivos podem ser compostos por fibra de vidro ou celulose
contendo uma resina orgânica polimérica positivamente carregada, que cria uma rede de
cargas positivas na superfície, para acentuar a adsorção de vírus carregados
negativamente. Esses filtros adsorvem vírus eficientemente através de uma variação de
pH ampla, sem necessitar de sais polivalentes. Contudo, eles não podem ser usados com
água do mar ou água de pH excedendo 8.0-8.5 (Sobsey & Glass, 1980). 1MSD Virozorb
eletropositivo é especialmente manufaturado para concentração de vírus a partir de água.
Os métodos que utilizam filtro VIRADEL sofrem várias limitações. A matéria suspensa
na água tende a ficar presa nos filtros, limitando, dessa forma, o volume que pode ser
processado e interferindo no processo de diluição. A matéria orgânica dissolvida e
coloidal em algumas águas pode interferir na adsorção dos vírus ao filtro,
presumivelmente por competição com os vírus pelos sítios de ligação. Finalmente, a
eficiência da concentração varia dependendo do tipo de vírus, provavelmente devido às

24
diferenças de ponto isoelétricos dos vírus, o que influencia na rede de cargas dos vírus em
qualquer pH.

8.2.2.2 - Eluição da amostra e reconcentração


Vírus adsorvidos são geralmente diluídas a partir das superfícies do filtro por
pressão filtrando um pequeno volume (1-2 litros) de uma solução de diluição através do
filtro. O diluente é geralmente um fluido protéico levemente alcalino, tal como extrato de
carne 1.5% ajustado para pH 9.5 (Fig. 8.7B). O pH elevado as cargas negativas em ambos
vírus e superfície do filtro, o que resulta em desligamento do vírus do filtro. A matéria
orgânica no extrato de carne também compete como o pela adsorção ao filtro,
posteriormente auxiliando no desligamento. O volume do diluente de 1 a 2 litros é, ainda,
muito grande para permitir análise viral sensível, e assim sendo, uma segunda etapa de
concentração (reconcentração) é usada para reduzir o volume a 20-30 mL antes do
experimento. O processo de diluição-reconcentração é mostrado em detalhes na Figura
8.8. No final, esses métodos podem recuperar enterovírus com uma eficiência de 30-50%
a partir de 400-1000L de água (Gerba et al., 1978; Sobsey & Glass, 1980).

8.2.2.3) Detecção de vírus


Várias opções disponíveis para a detecção de vírus são descritas detalhadamente no
Capítulo 10.5. Resumidamente, vírus podem ser detectados pela inoculação de uma
amostra em uma cultura de células animais seguida da observação das células para efeitos
citopagotênicos (CPE) ou pela enumeração de zonas claras ou de unidades formadoras de
placa (PFU) em monocamadas de células coradas por corantes vitais (ex., corantes que
marcam somente células vivas sem infecção viral). O método de PFU permite uma
quantificação dos vírus mais adequada, pois eles podem ser enumerados. PCR também
pode ser usado para detectar vírus diretamente em concentrados da amostra, bem como
em cultura de células animais. O procedimento global para amostragem de detecção de
vírus na água é mostrado na Fig. 8.8.

25
Fig 8.8 - Procedimentos de amostragem e detecção de vírus a partir de água.

26
8.2.3) Processamento de amostras de água para detecção de bactérias
O processamento de amostras de água para bactérias é mais simples que o
processamento requerido para vírus. Tipicamente, bactérias são coletadas e contadas por
um de dois diferentes procedimentos: filtração por membrana e número mais provável
(MPN). Filtração por membrana, como o nome indica, se baseia na coleta e concentração
de bactérias via filtração. No método de MPN, amostras são geralmente não processadas
anteriormente à análise. Em ambos procedimentos, as bactérias são detectadas via
métodos de cultura que são descritos no Capítulo 10, Seções 1.3 (MPN) e 2.1.3 (técnica
de filtração por membrana).

8.2.4) Processamento de amostras de água para detecção de protozoários


parasitas
Assim como para vírus entéricos, é necessária a ingestão de somente uns pouco
protozoários parasitas para causar infecção em humanos. Como resultado, são necessários
métodos sensíveis para análise de protozoários. Os métodos atuais foram desenvolvidos
para concentração e detecção de cistos de Giardia e oocistos de Cryptosporidium (Hurst
et al., 1997). O primeiro passo geralmente envolve coleta e filtração de grandes volumes
de água (usualmente centenas de litros). Durante a filtração, cistos e oocistos são presos
em um filtro de trançadas de porosidade nominal de 1µm (25cm de comprimento) (Fig.
8.9) feito de Orlon ou polipropileno. O volume preciso de água coletado depende da
investigação. Para águas de superfície é comum coletar-se 100-400 litros, e volumes em
excesso, de 1000 litros, têm sido coletados para análise de água potável. Geralmente, uma
bomba funcionando a um fluxo de 4-12 litros por minuto é usada para coletar a amostra.
O cartucho do filtro é colocado em uma bolsa plástica, que é vedada, armazenada no gelo,
e enviada a laboratórios para análise dentro de 72h.

27
Fig 8.9 - Filtro de fibras trançadas para concentração de cistos de Giardia e oocistos de
Cryptosporidium

No laboratório, os cistos e oocistos são extraídos cortando-se o filtro ao meio,


desenrolando-se o fio, e colocando-se a fibra em uma solução diluidora de Tween 80,
sódio dodecil sulfato, fosfato salina tamponado. Os filtros são lavados à mão em béqueres
grandes ou lavados em um stomacher mecânico. O volume resultante, de 3-4 litros, é
então centrifugado para concentrar os oocistos, ao quais são depois ressuspendidos em
formalina 10% ou dicromato de potássio tamponado (para Cryptosporidium). Cistos e
ooscistos ficam estáveis por muitas semanas quando armazenados em formalina ou
dicromato de potássio. Uma grande quantidade de matéria é concentrada juntamente com
cistos e oocistos, e o grão é posteriormente purificado por centrifugação por gradiente de
densidade, com soluções de Percoll-sacarose, sacarose, ou citrato de potássio. Alíquotas
das amostras concentradas são então filtradas através de um filtro de membrana de
celulose e acetato, o qual coleta os cistos e oocistos em sua superfície. Os cisto e oocistos
são corados com anticorpos monoclonais fluorescentes e o filtro é colocado sob um
microscópio de epifluorescência (Fig. 8.10). Corpos fluorescentes de tamanhos e formar
corretas são identificados e examinados por microscopia diferencial de contraste por

28
interferência, para a presença de corpos internos (ex., trofozoitos e esporozoitos). O
procedimento correto é mostrado na Fig. 8.11.

Fig 8.10 - Imunofluorescência de cistos de Giardia, oocistos de Cryptosporidium e


esporos de Microsporidia, um patógeno emergente de ambiente aquático.

Embora este método consuma tempo e incômodo, tem sido bem sucedido no
isolamento de Giardia e Cryptosporidium a partir da maioria das águas de superfície nos
EUA (Rose et al., 1997). Este método também parece ser capaz de concentrar
protozoários parasitas microsporídios a partir de água. Existem várias desvantagens
associadas a este método de análise. Estas incluem eficiências de recuperação
freqüentemente baixas (5-25%); tempo de processamento de 1-2 dias; interferência
causada por algas fluorescente; incapacidade de determinar a viabilidade; e finalmente,
limitação no volume de amostra que pode ser coletada de alguns sítios devido à alta
turbidez e entupimento do filtro. Por essas razões, métodos para melhorar a eficiência

29
estão em desenvolvimento, incluindo filtração por membrana, ultrafiltração, agregação
por carbonato de cálcio e separação imuno-magnética.

Fig 8.11 - A) Procedimento de coleta e amostragem de protozoa a partir da água.

30
Figura 8.11B - Procedimento para coloração de anticorpos e exame de Giardia e
Cryptosporidium

31
8.3) Detecção de microrganismos em FOMITES
Fomites são objetos inanimados que podem estar contaminados com organismos
infecciosos e servem em sua transmissão. Roupas, louça, brinquedos, topos de mesas, e
agulhas hipodérmicas são exemplos de fomites comuns. Fomites podem variar, em
tamanho, de pequenos como uma partícula de poeira caseira a tão grandes quanto uma
superfície de chão inteira, e em complexidade, de uma estrutura plana como uma mesa a
um delicado instrumento médico. O envolvimento de fomites na transmissão de doenças
foi reconhecido muito antes da identificação de alguns microrganismos patogênicos. Na
virada do século, a dispersão de varíola entre funcionários de lavanderias não era
incomum. Em 1908, surtos de varíola foram relacionados a algodão bruto contaminado
com vírus da varíola em crostas ou cascas (England, 1984). Também acredita-se que
fomites sejam importantes na transmissão de vírus respiratórios como rinovírus. Um surto
de vírus de hepatite B, tipicamente um vírus transportado pelo sangue, associado à
transfusão sangüínea, foi associado a cartões de computador como seu provável agente de
transferência. Esses cartões, quando manuseados, infligem pequenos ferimentos nas
pontas dos dedos, permitindo a transmissão e entrada do patógeno em um novo
hospedeiro (Pattinson et al., 1974). O crescimento de bactérias entéricas patogênicas em
esponjas domiciliares e em utensílios e superfícies usadas para preparação de comida foi
há tempos reconhecido como importante rota de transferência desses organismos a outros
alimentos ou superfícies, ou mesmo auto-inoculação quando os dedos que manusearam
alguma dos utensílios ou esponjas são trazidos à boca.
Fomites podem se tornar contaminados por microrganismos patogênicos por
contato direto com secreções ou fluidos infecciosos, mãos sujas, alimentos contaminados,
ou pelo ar. Para que os fomites sirvam de veículo de doenças microbianas, os organismos
devem ser capazes de sobreviver em associação com fomites e serem transferidos com
sucesso ao hospedeiro. A sobrevivência de organismos em uma superfície é influenciada
por temperatura, humidade, evaporação, dessecação, luz, radiação ultravioleta,
propriedades físicas e químicas da superfície, e a substância na qual o organismo está
suspenso. Patógenos entéricos e respiratórios podem sobreviver por minutos a semanas

32
em fomites, dependendo do tipo de organismo e dos fatores previamente listados (Sattar
& Springthorpe, 1997).
A amostragem de fomites é essencial na indústria de manufatura de alimentos para
se avaliar as práticas sanitárias e é de uso comum nas indústrias de serviços de alimentos
e cuidados da saúde, para se avaliar a eficácia da limpeza e desinfecção. Também é útil na
investigação epidemiológica e avaliação de desinfetantes de superfícies rígidas. As
metodologias mais comumente usadas na detecção de bactérias em fomites envolvem
placas de agar Rodac e a técnica de limpeza-enxagüe. Placas de ágar Rodac são placas de
petri em que o ágar enche toda a placa para produzir uma superfície convexa, que é então
pressionada contra a superfície a ser amostrada. Meios seletivos podem ser usados para o
isolamento de grupos específicos de organismos (ex., meio m-Fc para coliformes fecais).
Após a incubação, as colônias são contadas e relatadas como unidades formadoras de
colônia (CFU) por cm2 . O método de limpeza-enxagüe foi desenvolvido em 1917 para o
estudo de contaminação bacteriana em utensílios de alimentação (England, 1984).O
método é também adequado para amostragem de vírus. Um chumaço de algodão estéril é
umedecido com um tampão ou outra solução e esfregado sobre a superfície a ser
amostrada. A ponta do chumaço é então colocada assepticamente em um recipiente
contendo uma solução coletora asséptica, o recipiente é sacudido e o fluido de enxágüe é
analisado em um meio de cultura apropriado ou por uma técnica molecular, tal como o
método de PCR.

33