Enzimas

CAPITULO
FIGURA 8~1

Cristeles de quimotripsine bovina

M. Kunltz

0Il rnm

8

Enzimas: cinetica e inhibici6n

Los enzimas son proteinas especializadas en la catalisis de las reacciones bioloqicas, Se encuentran entre las mas notables de las biomoleculas conocidas debido a su extraordinaria especificidad y a su poder catalitico, que es mucho mayor que la de los catalizadores hechos por el hombre.

Gran parte de la historia de la bioquimica es la historia de Ia investiqacion de los enzimas. EI nombre enzima (cen la levaduras ) no se empleo hasta 1877, perc mucho antes ya se sospechaba que ciertos catalizadores bioloqicos intervenian en la Iermentacion del azucar para formar alcohol (de aqui el nombre inicial de «fermentos»). La primera teoria general sobre la catalisis quimica, publicada por J. J. Berzelius en 1835, incluia un ejemplo de 10 que ahora se conoce como enzima, la diastasa de la malta. y sefialaba que la hidrolisis del almidon se cataliza por la diastasa con mas eficacia que por el acido sulfurico.

Aunque Luis Pasteur reconocio que la Iermentacion es catalizada por enzimas, postulo en 1860 que estes se hallaban ligados de modo inextricable con la estructura y la vida de las celulas de la levadura. Constituyo, por ello, un logro importante en la historia de la investiqacion enzimatica que, en 1897. E. Buchner consiguiera extraer los enzimas que catalizan la fermentaclon alcoholica de/las celulas de levadura. Este hecho demostraba claramente que estos importantes enzimas, que catalizan una ruta metabolica principial productora de enerqia, pueden actuar independientemente de la estructura celular. Hasta muchos afios despues, sin embargo. no fue aislado por vez primera un enzima en forma cristalina; ello 10 consiquio J. B. Sumner, en 1926, con la ureasa, aislada de extractos de la alubia Canna valia enzyformis. Sumner demostro que los cristales se hallaban constituidos por proteina y lleqo a la conclusion, contraria a la opinion que prevalecia por aquel entonces, de que los enzimas son proteinas. Sus puntos de vista no fueron aceptados inmediatamente, sin embargo, y hasta el periodo comprendido entre 1930 y 1936, durante el cual Northrop aisle la pepsina cristalizada, la tripsina y la quimotripsina (fig. 8-1), no quedo bien establecida la naturaleza proteica de los enzimas.<En la actualidad se han identificado cerca de 2000 enzimas diferentes. Muchos de ellos se han aislado en forma pura y homoqenea, y alrededor de un os

189

PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

200 se han podido cristalizar. Aunque se han identificacl<1la mayor parte de los enzimas relacionados con eI metabolismo basico corriente de la celula quedan por resolver much os problemas importantes, entre ellos el control genetico de la sintesis enzimatica, los mecanismos moleculares mediante los que se regula la actividad enzimatica y el papel de las Iormas multiples de algunos enzfmas en el desarrollo y en la diferenciacion. Pero sobre todo, todavia no se conoce en terminos moleculares, COmo catalizan los enzimas las reacciones quimicas con tal eficacia, precision y especificidad.

En este capitulo y el siquiente no se hara ninqun intento para catalogar y describir el gran numero de enzimas diferentes conocidos hasta la fecha; se examinaran mas bien las propiedades y caracteristicas comunes a la mayor parte de los enzimas. Los enzimas especificos que participan en diversos ciclos metabolicos se estudiaran, mas detalladamente en capi-

tulos sucesivos. .

Nomenclatura y clasificaci6n de los enzimas

Muchos enzimas han sido designados afiadiendo el sufijo -asa a1 nombre del suscreto, es decir, de la molecula sobre la eual el enzima ejerce su accion catalitica. Por ejernplo, la ureasa cataliza la hidrolisis de 1a urea con produccion de amoniaco y CO2, 1a arginasa cataliza la hidrolisis de 1a arginina a ornitina y urea, y 1a fosfatasa cataliza 1a hidrolisis de los esteres fosforicos. Esta nomenclatura, sin embargo, no siernpre ha resultado practice, 10 cual ha ocasionado que muchos enzimas hayan recibido nombres que quimicamente son poco informativos; par ejemplo, la pepsina, 1a tripsina, y 1a catalasa. Por dicha razon, y porque el mimero de enzimas que se descubren esta aumentando rapidamente, se ha adoptado una clasificacion sistematica de los enzimas sequn recomendacion de una comisi6n internacional de enzimas. El nuevo sistema divide a los enzhnas en seis c1ases principales, cada una de las cuales se divide a su vez en subclases, de acuerdo con el tipo de reacci6n catalizada (tabla 8~ 1 ). Cada enzima es designado por un nombre recomendedo, generalmente corto y apropiado para su uso habitual; por un nombre sistematico, que identifica la racci6n que cataliza, y par un niimero de clesiiicecion, que se emplea cuando se precis a la identiflcacion inequivoca del enzima, tal como ocurre en las revistas internacionales de investiqacion, en los resumenes y en los indices. Se da como ejemplo, el enzima que cataliza la reacci6n

A TP + creatina ~ AD P + fosfocreatina

El nombre recomendado de este enzima, el que se emplea normalmente, es creatin~quinasa y el nombre sistematico, que se basa en 1a reaccion catalizada, es ATP: creatin~/osfotrans[ecese. Su numero de clasificacion es EC 2.7.3.2, en donde EC siqnifica, abreviadamente, Comislon de Enzimas: la primera cifra (2) representa el nombre de la c1ase (transferasas), la segunda cifra (7) representa a la subclase (fosfotransfera .. sas}, la tercera cifra (3) la sub-subclase (fosfotransferasas con un grupo nitroqeno como aceptor) y la cuarta cifra (2) designa a la creatin-quinasa (vease tabla 8~ 1 ). En este libro utilizaremos los nombres recomendados de los enzimas, tal como se

190

TABLA 8-1. Clasfflcaclon Internacional de los enzimas (denominaciones de las clases, numeros de codiqo

y tipos de reacciones catalizadas},

1. Oxldo-reductasas
[Reacclones de oxldo-reducclon]
1.1 Actuan sobre ~CH-OH
1.2 Actuan sobre "'C=O
/
-,
1.3 Actuan sobre C=CH-
/
1.4 Actuan sobre "'-
/CH-NH2
1.5 Actuan sobre <,
CH-NH-
/
1.6 Actuan sobre NADH;
NADPH 2. Transferasas
(Transferencia de grupos funclo-
nales)
2.1 Grupos de un atomo de
carbono
2.2 Grupos aldehidicos 0
cetonicos
2.3 Grupos acilos
2,4 Grupos glucosilo
2.7 Grupos fosfato
2.8 Grupos que contienen azufre
3. Hidrolasas
(Reacciones de hidrollsis]
3.1 2.steres
3.2 Enlaces glucosidicos
3.4 Enlaces peptidicos
3.5 Otros enlaces C-N
3.6 Anhidridos de acido
4. Liasas
(Adicion a los dobles enlaces)
4.1 "'- /
C=C
/ "'-
4.2 \:=0
/
4.3 -,
C=N-
/
5. Isomerasas
(Reacciones de Isomerlzaclon]
5.1 Racemasas
6. Ligasas
(Formacion de enlaces con escision
del ATP)
6.1 C-O
6.2 C-S
6.3 C-N
6.4 C-C TABLA 8~2. Algunos de los enzimas que contienen iones metalicos 0 los necesitan como cofactores.

Zn%+ Alcohol-deshldroqenasa Anhtdrasa-carbonlca Carboxipeptidasa

Mg2+ Fosfohidrolasas Fosfotransferasas Mn2+

Arginasa Fosfotransferasas

Fel .. 0 Fe3+ Citocromos Peroxidasa Catalasa Ferredoxina

euz+ (Cu") 'Ttrostnasa Cttocromo-oxidasa K+

Piruvato-quinasa (tamblen necesita Mgz+)

Na+

A TPasa de la membrana plasmatica

(necesita tambien K+ y Mg2+)

Capitulo 8 Enzimas: cinetice e inhibicion

hallan catalogados en la edicion de Enzyme Nomenclature, 1973 {vease Bibliografia), salvo unas pocas excepciones.

Cofactores enzimaticos

La actividad de algunos enzimas depende solamente de su estructura como proteinas, mientras que otros necesitan, ademas uno 0 mas componentes no proteicos, llamados cofac~ tores. El cofactor puede ser un ion metitlico, 0 bien una molecula orqanica llamada coenzime: algunos enzimas necesitan de ambos. Los cofactores son generalmente estables frente al calor, mientras que much as proteinas enzimaticas pierden la actividad por calefaccion, EI complejo enzuna-cofactor cataliticamente activo recibe el nombre de holoenzime, Cuando se separa el cofactor, la proteina restante, que por SI misma es inactiva cataliticamente, se designa con el nombre de apoenzima:.

La tabla 8~2 reune algunos enzimas que precisan de iones metalicos como cofactores. En tales enzimas el ion metalico puede actuar como: 1) centro catalitico primario; 2) como grupo. puente para reunir el sustrato y el enzima, formando un complejo de coordinacion: 0 3) como agente estabilizante de la conformacion de la proteina enzimatlca en su forma cataliticamente activa. Los enzimas que precisan de iones metalicos se Haman a veces meteloenzimes: en algunos de ellos, el componente metalico, por si solo, ya posee una actividad catalitica primaria, muy incrementada a $U vez por la proteina enzimatica: por ejemplo, la cataiasa, es un enzima Ierro-. porfirinico que cataliza la descomposicion muy rapida del peroxide de hidrogeno, en agua y oxigeno; las simples sales de hierro tambien catalizan esta reaccton, pero a velocidad mucho menor.

La=tabla 8~3 reune los principales coenzimas conocidos y los tipos de reacciones enzimaticas en las que participan. Cada o de los coenzimas catalog ados contiene, como parte de su ructura, una molecula de alguna de las oitemines: estas son sustancias orgamcas que, en cantidades mmimas (trazas), son vitales para la functon de todas las celulas, y deben figu~ rar en la dieta de algunas especies. Las vitaminas y sus formas coenzimaticas seran objeto de estudio en el capitulo 13 (pagina 341). Los coenzimas actuan, por 10 general, como trans-

TABLA 8,3. Coenzimas de reacciones de transferencia de grupos.

Coenzima

Entidad transferida

Nicotinamida-adenina~dinucle6tido Fosfato de nicotinamlda-adenina-dinu-

cleotido Flavin-mononucleotide Flavln-adentna-dmucleotldo Coenzima Q

Pirofosfato de tiamina Coenzima A

Lipoamida

Coenztmas cobamidicos Biocitina

Fosfato de plridoxal Ccenzimas tetrahidrofoltcos

Atomos de hidroqeno (electrones)

Atomos de hldroqeno (electrones} Atomos de hldrogeno (electrones} Atomos de hidrcqeno (electrones) Atomos de hidrcqeno (electrones) Aldehidos

Grupos acilo

Grupos acilo

Grupos alquilo

Dioxido de carbono

Grupos amino

Grupos metilo, metileno, formilo 0 formimino

191


portadores intermediarios de grupos funcionales, de atomos especificos 0 de electrones, los cuales son transferidos en la reacci6n enzimatica global. Cuando el coenzima se halla unido intimamente a la molecula del enzima recibe, normalmente, el nombre de grupo prostetico; por ejemplo, el grupo biocitlna de la acetil-Co.Aecarboxilasa, que se halla incorporado covalentemente en la cadena polipeptidica (pag. 351). Sin embargo. en algunos casos el coenzima esta unido debilmente y actua, esencialmente, como uno de los sustratos especificos de aquel enzima,

Cinetica quimica

Antes de proceder a examinar la catalisis enzimatica de las reacciones, deben esbozarse algunas relaciones y terminos empleados para la medici6n y expresi6n de las velocidades de las reacciones quimicas. Las reacciones quimicas pueden clasificarse basandose en el numero de molecules que en total deben reaccionar para for mar los productos de la reacci6n. Asi tendremos reacciones monomoleculeres, bimoleculeres y trimoleculetes, en las que reaccionan una. dos 0 tres moleculas, respectivamente.

Las reacciones quimicas pueden clasificarse tambien sobre una base cinetica, por el orden de reeccion. Tendremos, de este modo. reacciones de orden cero, de primer orden, de segundo orden y de tercer otden, segun como resulte influida la velocidad de reacci6n por la concentracion de los reaccionantes bajo un conjunto de condiciones determinado.

Las reacciones de primer orden son las que tienen lugar a una velocidad exactamente proporcional a la concentraci6n de un reaccionante (fig. 8-2). EI ejemplo mas sencillo es cuando la velocidad de la reacci6n

A~P

es exactamente proporcional a la concentraci6n de A. En este caso la velocidad de reacci6n en cualquier tiempo t viene dada por la ecuad6n de primer orden

-dIAl = k[A)

dt

en la que [A] es la concentraci6n molar de A y -d[A]idt es 1a velocidad a que disminuye la concentraci6n de A. La constante de proporcionalidad k recibe el nombre de constante de velocidad 0 velocidad de reacci6n especifica. Las constantes de velocidad de primer orden poseen las dimensiones del reciproco del tiempo habitualmente S~l.

La forma integrada de esta ecuacion, que es mas util para la realizacion de calculos cineticos, es

10 [1\0] = _l!_

g [A) 2,303

en la que [Aol es Ia concentraci6n de A al tiempo cero, y [A] es la concentraci6n al tiempo t.

En las reacciones de primer orden, el tiempo mitad (tI/2) de la reacci6n viene dado por

0,693 t1/2 =-k-

192

FIGURA 8~2

Representacion grafica del curso de una reeccion de primer arden, 81 tiempo media (tYz) es el necesexio para que se consuma le mitad de la cantidad inicial del reeccionente.

[A)

/ Pendiente de 1a tangente dIAl

=-Tt

t---

Capitulo 8 Enzimas: cinetica e inhibici6n

relacion que se deduce facilmente. Observese que en las reacciones de primer orden, el tiempo mitad es independiente de Ia concentracion inicial del sustrato.

Reacciones de segundo orden son aquellas cuya velocidad es proporcional al producto de Ia concentracion de dos reaccionantes 0 a la segunda potencia de uno de los reaccionantes. EI ejemplo mas sencillo es la reaccion

La velocidad de esta reaccion que puede ser designada como -(d[A]/dt), -(d[B]jdt) 0 +(d[P]/dt), es proporcional al producto de las concentraciones de A y de B, y viene dada por la ecuaci6n de velocidad de segundo orden

-dIAl = k[A][Bl dt

en la que k es la constante de velocidad de segundo orden. Si la reaccion tiene la forma

2A--P

y su velocidad es proporcional al producto de la concentracion de las dos moleculas reaccionantes, Ia ecuacion de velocidad de segundo 'orden es

-djtA1 = k[A][A] = k[A]2

Las constantes de velocidad de las reacciones de segundo orden tienen las dimensiones 1/ [concentracion X tiempo], 0 M-l S-I. La forma integrada de la expresion de segundo orden es

_ 2,303 [BoHA]

t - k([AoJ - [BoJJ log [Ao][B)

en donde [Ao] y [80] son las concentraciones iniciales y [A] y [B] las concentraciones en el tiempo t.

En las reacciones de segundo orden, cuyas concentraciones de los reaccionantes son iguales. el tiempo mitad es igual a l/Cok, en donde Co es la concentraclon inicial de los reaccio .. nantes y k la constante de velocidad de segundo orden.

Es importante observar que una reaccion de segundo orden, tal como

puede parecer. en ciertas condiciones, una reaccion de primer orden. Por ejemplo, si la concentraci6n de B es muy elevada, y la de A muy baja, esta reacci6n podria parecer como. de primer orden, ya que su velocidad seria casi proporcional a la concentraci6n de uno s610 de los reactivos: reacciones de seudoprimer orden 0 de primer orden aparente.

Las reacciones de tercer orden. que sonrelativamente esca .. sas, son aquellas cuya velocidad es proporcional al producto de tres terminos de concentracion. Algunas reacciones quimicas son independientes de la concentraci6n de cualquier reactive: son las llamadas reacciones de orden cera. Muchas

193


reacciones catalizadas son de orden cero con respecto a los reactantes. Cuando es. este el caso, la velocidad de reacci6n depende de la concentracion del catalizador 0 de alqun otro factor distinto a la concentracion de las especies moleculares que experimentan la reacci6n. Las velocidades de reacci6n no es preciso que sean necesariamente de primer orden puro 0 de segundo orden puro; en ciertas condiciones se observan con frecuencia ordenes de reaccion mixtos.

Energia libre de activacion y efectos de los catalizadores Una reaccion quimica, tal como A ~ P, tiene lugar porque cierta Iraccion de la poblacion de moleculas A, en cualquier instante dado, posee la suficiente energia como para alcanzar un estado activado, llamado estado de trensicion, en el que es muy elevada la probabilidad de que se establezca 0 se rompa un enlace. quimico para formar el producto P. Este estado de transicion reside en la cima de la barrera de energia que separa a los reaccionantes y a los productos (fig. 8.3). La velocidad de una reacci6n quimica dada es proporcional a la concentraci6n de estas especies caracteristicas del estado de transici6n. La energia libre de actiuacion AGt (el simbolo ;se emplea para representar el proceso de activacion] es la cantidad de energia necesaria para llevar todas las moleculas de 1 mol de sus tan cia a una temperatura determinada, al estado de transicion, en la cima de la barr era de activaci6n.

Hay dos metodos generales. mediante los cuales, puede acelerarse la velocidad de una reacci6n qui mica. Uno de ellos es la elevacion de la temperatura. ya que provoca un incre-

FIGURA 8~3

Diagrama de enerqie para una reacci6n quimice, no catalizada y cetelizede.

Estado

de transicion

Energia libre de actlvacion de la reaccion

Energia libre

de activacion de Ia reaccion directa (no catalizada)

r

- - Energia Iibre de activaci6n

de activaci6n de la reacci6n catalizada

inversa (catalizada)

---------A.--

Cambio global de : energia libre:

de la :

reaccion .

<,

Estado final

Curso de la reaccion--"

194

TABLA 8~4. Energia libre de activaci6n flG* calculada para Ia descomposici6n del per6xido de hidr6geno a 20 0c.

La catalasa acelera Ia velocidad de Ia reacci6n mas de 109 veces.

flG~

Condiciones kcal mol"!

Sin catalizar 18

Catalizada con platino coloidal 13

Catalizada por catalasa 7

FIGURA 8~4

Electo de la concenirecion del sustrato sabre 18 velcctded de una reeccion catalizada enzimeticemente.

Capitulo 8 Enzimas: cinetica e inhibicion

mento del movimiento termico y de la energia, aumenta el mimero de moleculas capaces de alcanzar el estado de transicion, y acelera, de este modo, la velocidad de las reacciones quimicas. En muchas reacciones la velocidad de reaccion se duplica, aproximadamente, por cada 10°C de aumento de la temperatura. La velocidad de una reacci6n quimica puede verse incrementada tambien por 1a adici6n de un catalizador; este se comb ina con los reaccionantes de modo transitorio y se produce un estado de transici6n de menor energia de activaci6n que el correspondiente a 1a reacci6n no catalizada. Asi los catalizadores aceleran las reacclones quimicas porque disminuyen la energia de activaci6n (fig. 8~3). Cuando se forman los productos de 1a reacci6n se regenera el catalizador libre. La tabla 8 ... 4 muestra 1a energia de activacion para la descomposici6n del peroxide de hidr6 ... geno, en ausencia 0 en presencia de un catalizador.

"

Cinetica de las reacciones catalizadas por los enzimas,

Ecuaci6n de Michaelis .. Menten

Los principios generales de la cinetica de las reacciones quimicas son aplicables a las reacciones catalizadas por los en ... zimas, pero estas muestran tambien un rasgo caracteristico, que no se observa en las reacciones no enzimaticas: la satu ... radon can el sustrato. En la figura 8...4 vemos el efecto de 1a concentraci6n del sustrato sobre la velocidad de la reacci6n catalizada por un enzima A ~ P. A una concentraci6n de sustrato baja, 1a velocidad inicial de la reacci6n Vo es casi proporcional a 1a concentraci6n del sustrato y 1a reacci6n, por tanto, es aproximadamente de primer orden con respecto al mismo. Sin embargo, a medida que la concentraci6n de sus ... trato aumenta, la velocidad inicial de la reacci6n disminuye y deja de ser aproximadamente proporcional a 1a concentra ... cion de sustrato; en esta zona el orden de reacci6n es mixto. Con un aumento posterior de la concentraci6n del sustrato, 1a velocidad de 1a reacci6n llega a ser esencialmente independiente de la concentraci6n de sustrato y se aproxima asint6 ... ticamente a una velocidad constante. En este intervalo de concentraciones de sustrato 1a reacci6n es esencia1mente de or ... den cero con respecto al sustrato, y se dice entonces que el enzima se halla saturado con su sustrato. Todos los enzimas muestran e1 efecto de saturaci6n, pero varian ampliamente con respecto a 1a concentraci6n de sustrato que se necesita para que se manifieste. E1 efecto de saturaci6n condu]o a algunos

Vmax

-------------------

t

Vo

[SustratoJ

195


de los primeros Investigadores, en particular a J. Brown y tambien a V. Henry, a formular lei hip6tesis de que el enzima y el sustrato reaccionan reversiblemente para formar un complejo, como etapa esencial en la reacci6n catalizada.

L. Michaelis y M. L. Menten desarrollaron en 1913 una teoria general acerca de la acci6n y cinetica de los enzimas, la cual, fue ampliada posteriormente por G. E. Briggs y J. B. S. Haldane. Esta teoria, que es fundamental para el analisis cuantitativo de todos los aspectos de la cinetica de los enzimas y de la inhibicion, se ha desarrollado plenamente para el caso sen cillo de una reacci6n en la que solo hay un sustrato. La teoria de Michaelis-Menten supone que el enzima E se combina en primer lugar con el sustrato S para formar el complejo enzima-sustrato ES; a continua cion este ultimo se escinde en una segunda etapa, para formar enzima libre y producto P:

(1)

k+,

ES~E+P

L,

(2)

Se supone que estas reacciones son reversibles: las constantes de velocidad para las reacciones directa e inversa poseen unsubindice positivo y otro negativo, respectivamente.

Deduciremos a continuacion la ecuacion de Michaelis-Menten. que expresa la relacion matematica entre la velocidad inicial de una reaccion catalizada por un enzima, la concentracion del sustrato y ciertas caracteristicas del enzima. La ecuacion de Michaelis-Menten es la ecuaci6n de velocidad para las reacciones catalizadas por enzimas que s610 actuan sobre un sustrato. En la deduccion, debida a Briggs y Haldane. [E] representa la concentracion del enzima libre 0 no combinado, [ES] la concentracion del complejo enzima-sustrato, y [ET] la concentracion total del enzima (suma de las formas libre ycombinada). La concentracion del sustrato se representa por [S], la cual se supone que es mucho mayor que [E], de modo que la cantidad de S unida a E en cualquier

, Instante, es despreciable si se com para con la concentracion total de S.

EI objeto de esta deduccion es definir una expresion general para vo, que es la velocidad inicial de una reaccion catalizada enzimaticamente, suponiendo que las reacciones de esta clase trans curren en dos etapas, tal como muestran las reacciones (1) y (2). La velocidad inicial es, por supuesto, igual a la velocidad de ruptura del complejo enzima-sustrato. ES, de acuerdo con la ecuacion (2); podemos escribir para ella Ia ecuacion de velocidad de primer orden.

(3)

Sin embargo, ya que ni h,l., ni [ES ]. pueden determinarse directamente, debemos encontrar otra ex presion para Vo en fund6n de otras variables' que puedan medirse con mas Iacilidad. Para ello escribiremos en primer lugar la ecuacion de velocidad de segundo orden para Ia formaci6n de ES a partir de E y de S [vease la reaccion (1)]:

d~S] = k+l ([ET] - [ES)) [S]

(4)

196

FIGURA 8.5

Trenscurso de fa [otmecion de un complejo enzima-sustteto en [unclon del tiempo

e iniciecion del estado estecionerio, tal como se deduce de fa resolucion por computador de los datos obtenidos en un experimento real con un enzima tipico,

La porcion sombreada del grafico superior es La que eperece ampliada en fa grafjca inferior.

Capitulo 8 Bnzimas: cinetica e inhibicion

en la que k., es Ia constante de velocidad de segundo orden. Aunque ES puede Formarse tambien a partir de E y de P por inversion de la reacci6n (2), la velocidad de la reacci6n inversa puede despreciarse, ya que estamos considerando que da reacci6n se inicia en el sentido directo, cuando [S] es muy elevado y [P] es cero, 0 proximo a este valor.

A continuaci6n escribiremos la ecuaci6n de velocidad para la descomposicion de ES por suma de dos reacciones: en prj .. mer Iuqar, Ia reacci6n que rinde el producto (reacci6n directa] y despues la reacci6n que produce E + S [Ia inversa de la ecuaci6n (1)]. Tendremos entonces:

-dIES]

dt = LI[ES] + kdES]

(5)

Cuando Ia velocidad de formaci6n de ES es iguaI a su velocidad de desepericion, es decir, cuando el sistema ha alcanzado el estado estacionario, que se define como aquel en que la concentracion de ES permanece constante, entonces

(6)

Tiempo

Tlempo

197


La figura 8~5 muestra la variaci6n a 10 largo del tiempo de los diversos participantes.

Reordenando la ecuaci6n (6), obtenemos

[SH[Er] ~ IES]) [ES]

(7)

La constante global KM• que sustituye al termino (k-l + k+2)/k+1• se llama constante de Michaelis~Menten.

A partir de esta ecuacion puede obtenerse la concentraci6n del complejo ES en el estado estacionario, despejando dicho termino:

[ES] = [ErH S] KM + IS]

(8)

Ya hemos visto (anteriormente) que la velocidad inicial de reaccion, vo, de una reacci6n enzimatica es

Vo = k+2 [ES]

(3)

Podemos sustituir, ahora, el termino [ES], que figura en la ecuaci6n (3), por su valor en la ecuaci6n (8):

v = k [ErHS]

o +2 KM + [S]

(9)

Cuando la concentraci6n del sustrato es tan elevada que practicamente todo el enzima del sistema esta presente en forma de complejo ES, es decir, cuando el enzima se halla satllrado, se alcanzara la velocidad inicial maxima, V max. dada por

(10)

en la que [ET] es la concentraci6n total del enzima. Sustituyendo k+2 [ET] por su valor deducido de la ecuaci6n (10). se obtiene

Vmax [S] vO=KM+[S]

(11)

Esta es la ecuacion de Michaelis-Menten: es la ecuaci6n de la velocidad para una reacci6n de un solo sustrato, catalizada enzimaticamente. Relaciona la velocidad inicial, la velocidad maxima y la concentraci6n inicial del sustrato a traves de la constante de Michaelis-Menten. Es importante observar que aunque la ecuaci6n de Michaelrs-Menten petece no contener ninqun termino para la concentraci6n del enzima, en realidad esta se halla contenida en el termino V max. que hemos visto que es igual a k+2 [ET].

De-Ia-eeuaeien- de Michaelis-Menten se deriva una relaci6n numerica importante en eI caso especial en que la velocidad inicial de la reacci6n sea exactamente la mitad de la velocidad maxima; es decir, cuando Vo = Y2 V max (fig. 8~4).

V max V max IS]

2 KM + [S]

Al dividir por V max, se obtiene

1 _ [S]

2 - Kw + [S]

198

TABLA 8~5. K,., de algunos enzimas.

K,.,(mM)

Bnzima y sustrato

25

Catalasa H202

Hexoquinasa Glucosa Fructosa

Outmctripslna N~Benzoiltirosinamida N-Formiltirosinamida N - Acetiltirosinamida Gliciltirosinamida

Anhidrasa carbonica HCOJ-

Glutamato-deshidroqenasa Glutamato o-Cetoqlutarato

NH4+

NADo•

NADred

Aspartato a~amino transferasa Aspartato

e-Oxcqlutarato

Oxalacetato

Glutamato

0,15 1.5

2,5 12.0 32 122

9.0

0.12 2.0 57 0.D25 0.D18

0.9 0.1 0,04 4.0

TABLA 8~6. Efecto de la estructura del sustrato sobre la

V mix para la n-ammoacidooxidasa (los datos se refieren a la n-alantna = 100).

Sustrato

V mix relativa

n-Ttrcsma n-Prolina u-Metlonina n-Alanlna u-Valina n-Hlstidina Glicocola

297 231 125 100

55 9.7 0,0

Capitulo 8 Bnzimas: cinetice e inhibicion

Reordenando, se transforma en

KM + [S] = 2[S] KM= [S]

Vemos asi que la constente de Mlcheelis-Menten KM es igual a le concentraci6n de sustrato en fa que fa velocidadinicial de fa reeccion es la mited de le oelocided maxima. Las dimensiones de KM para una reaccion de un solo sustrato son moles por litro, y la constante es independiente de la concentracion del enzima.

Puede obtenerse con facilidad, una aproximaci6n a1 valor de KM a partir de una serie de experimentos sencillos en los que la velocidad inicial de la reacci6n se mide a diferentes concentraciones iniciales de sustrato con una concentraci6n de enzima constante. EI valor aproximado de KM se obtiene gra~ ficamente al representar la velocidad inicial frente a la concentracion inicial del sustrato (fig. 8-4): se obtiene una hiperbole rectangular. A concentraciones de sustrato muy bajas, la velocidad inicial, Vo. es casi proporcional la [S]; es decir, la reacci6n muestra esencialmente un comportamiento de primer orden. A concentraciones de sustrato muy elevadas la veloci .... dad de la reacci6n se aproxima asintoticamente a la V max v es esencialmente de orden cero; 0 sea, casi independiente de la concentraci6n del sustrato. Unos cuantos enzimas, como la catalasa. parecen no mostrar saturaci6n par el sustrato; ello es debido a que la velocidad de descomposici6n del complejo ES para for mar product os es tan rapida que no puede convertirse facilmente en limitante del proceso.

La tabla 8~5 refine los valores de KM para varios enzimas.

Observese que KM no es un valor fijo, sino que puede variar con la estructura del sustrato, con el pH y con la temperatura. Para los enzimas que poseen mas de un sustrato, cada~de. ellos exhibe una KM caracteristica. En condiciones intracelu~ lares, los enzimas no se hallan necesariamente saturados por sus sustratos. Recordemos que la velocidad maxima. V max' que es igual a k+z [ET], varia ampliamente de un enzima a otro para una concentraci6n de enzima determinada. La V max varia tam bien con la estructura del sustrato (tabla 8-6). con el pH y con la temperatura.

La con stante de Michaelis de un enzima constituye una caracteristica util e importante, que es fundamental no solo para la descripcion matematica de la cinetica enzimatica, sino tambien para la determinacion cuantitativa de la actividad en .. zimatica en los tejidos y la purificacion del enzima. Ademas, la concentracion de sustrato que proporciona la mitad de la velocidad maxima, facilita una indicacion util para el analisis de algunos mecanismos de requlacion enzimatica (pag. 242). Un notable ejemplo de .investiqacion medica reciente pone de manifiesto la utili dad de KM en un nuevo aspecto. Algunos tipos de leucemia humana y animal (forma de cancer en la que los qlobulos blancos sanguineos proliferan anormalmente) pueden suprimirse por admirustracion intravenosa del enzima asparaginasa, que cataliza la reaccion

Asparagina + HiO ~ aspartato . + NH4+

Este descubrimiento condujo a la conclusion de que la aspa .. ragina presente en 1a sangre es un principio nutritivo esencial

199


para el crecimiento de los leucocitos malignos; la asparaqinasa intravenosa produce la hidrolisis de la asparagina en aspartato, el cual, no satisface las necesidades de aquellas. Durante la busqueda de Fuentes de asparaginasa adecuadas para el tratamiento de Ia leucemia se hizo el desconcertante descubrimiento de que no todas las asparaqinasas son eficaces en la supresion de la leucemia experimental. Al final se encontro la razon: las asparaginasas de diferentes Fuentes. animales, veqetales 0 bacterianas, difieren en gran medida en el valor de KM respecto a la asparagina. Como la concentracion de asparagina en la sangre es muy baja, la adrninistracion de una asparaginasa de otra especie solo sera terapeuricamente efectiva si su valor de KM es 10 suficientemente bajo como para hidrolizar la asparagina rapidamente, dada la pequefia concentracion con que esta presente en la sangre.

El comportamiento cinetico de la mayor parte de los enzimas es mas complejo que el sencillo e idealiaado de la reaccion de un solo sustrato que acabamos de estudiar. En primer lugar, nuestra formulaci6n ha supuesto que en la reaction con un solo sustrato, se forma tinicamente un solo complejo enzimasustrato , pero ahora parece probable que en muchas de las reacciones con un sustrato puedan intervenir dos 0 tres complejos intermedios, tal como indica la secuencia

E + S -- ES ~ EZ ;:::=! EP ;;:::::::==: E + P

en la que EZ es el complejo del estado de transici6n, y EP un complejo enztma-producto. Ademas, solamente una minoria de las reacciones enzirnaticas son de un solo sustrato; en la mayor parte de ellas intervienen dos 0 mas sustratos, y pueden haber dos 0 mas productos. EI analisis cinetico de las reacciones enzimaticas en las que intervienen varios reaccionantes y productos es complejo; no obstante. la relacion de Michaelis-Menten continua siendo el punto de partida para el analisis de la cinetica de todas las reacciones enzimaticas.

Constante de Michaelis, KM• y constante del sustrato, Ks Tal como hemos sefialado anteriormente, la constante de Michaelis es una magnitud determinada experimentalmente y definida operativamente: es la concentracion del sustrato a la cual Ia velocidad de la reaccion es la mitad de la velocidad maxima. En el caso ideal utilizado en la deduccicn anterior, equivale a

(7)

pero en algunas reacciones enzimaticas k-l es muy grande en comparacion con k+2. en cuyo caso esta ultima puede pasar a ser despreciable, y la ecuacion (7) se simplifica a

K L1 M=-k +1

en que KM es aproximadamente igual a la constante de disocia cion del complejo enzima-sustrato Ks, que tambien se designa como constante del sustrato:

K = [E][S]

S [ES]

200

FIGURA 8-6

Representacion (Lineweeoer-Burk}, doble teciproce.

-1 KII{

FIGURA 8-7

Representadon de Eedte-Hoistee.

Capitulo 8 Enzimas: cinetic« e inhibicion

Desqraciadamente, KM Y Ks son considerados con Irecuencia y equivocadamente, como sinonimos. No deberia cons iderarse a KM como constante de disociacion del complejo E5. a menos que se disponga de informacion especifica que confirme que el valor de k+2 es muy pequefio comparado con el de k-1•

Transformaciones de la ecuacion de Michaelis ... Menten

La ecuacion de Michaelis-Menten [ecuacion (11)] puede transformarse algebraicamente en otras formas que son mas titiles para la expresion de los datos experimentales. Una de las trans formaciones mas corrientes se obtiene, sencillamente, to ... mando los reciprocos de ambos miembros de la ecuacion de Michaelis-Menten (11):

1 _ KM + [S] VO - Vmax [8]

Reordenando, tendremos

1

que se reduce a

(12)

La ecuacion (12) es la ecuacion de Lineweaver·Burk. Cuando 1/ Vo se representa frente a 1/ [5]. se obtiene una linea recta. La pendiente de 1a recta es KM/V max. y la interseccion sobre el eje l/vo es I/V max: la interseccion sobre el eje 1/[5] es -l/KM (fig. 8-6). Tal revresentacion doble-reciproca tiene 1a ventaja de que permite una determinacion mucho mas exacta del valor de V max. ya que en la representacion sencilla de Vo frente a [5] solo se obtiene su valor aproximado (observese la figura 8-4). puesto que es un valor limite a una concentracion del sustrato infinita. La representacion doble reciproca puede proporcionar tambien informacion valiosa acerca de la inhibicion enzimatica, como veremos mas adelante (pag. 205).

Otra transfcrmacion uti! de la ecuacion de Michaelis-Menten se obtiene multiplicando ambos miembros de la ecuacion (12) por V max. y reordenando para dar la ecuacion

La representacion de Vo frente a vol [S]. llamada representa~ cion de Eadl'e~Hofstee (fig. 8-7). no solamente da los valores de V max y de KM en forma muy sencilla, sino que tambien amplia las desviaciones del caracter lineal que pueden no aparecer en una representacion doble reciproca.

Efecto del pH sobre la actividad enzimatica

La mayoria de los enzimas poseen un pH caracteristico al eual su actividad es maxima: por encima 0 por debajo de ese pH la actividad disminuye. Aunque los perfiles de las curvas de actividad en Iuncion del pH de muchos enzimas son acam ..

201

i
<II
.~ Coltnesterasa
...
<II
~
.... Tripsina
'"C:I
'"
-:g
£
u
<
6 8 6 8 10
pH pH PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

FIGURA 8-8

Curves de ectioided en [uncion del pH de algunos enzimss.

Pepsina

2

4

6

pH

Papaina

(sustrato = benzoUargininamida)

6

4

8

pH

panados, pueden variar considerablemente de forma (fig. 8-8). La relacion entre el pH y la actividad de cualquier enzima depende del comportamiento acido-base del enzima y del sus .. trato, asi como de otros muchos factores que son por 10 ge .. neral dificiles de analizar cuantitativamente. La forma de la curva de actividad-phI varia con la concentracion del sustrato, ya que e1 valor de KM de muchos enzimas varia con el pH. Las mencionadas curvas son mucho mas significativas si el enzima se mantiene saturado con el sustrato en todos los valores de pH a los que se experimenta. En muchos estudios de cinetica enzimatica, el pH se mantiene constante al, 0 muy proximo al, pH optimo.

EI pH optimo de un enzima no es necesariamente identico al pH de su entorno intracelular normal, el cual puede ha .. llarse a su vez en 1a pendiente ascendente 0 descendente de, su curva de pH-actividad. Este hecho sugiere que la relaci6n pH-actividad de un enzima puede constituir un factor en el control intracelular de su actividad.

Efecto de la temperatura sobre las reacciones enzimaticas

Al igual que ocurre con la mayoria d~ reacciones quimicas, la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas se incre .. menta en general con la temperatura, dentro del intervalo en que el enzima es estable y permanece totalmente activo. La velocidad de muchas reacciones enzimaticas se duplica, apro .. ximadamente, por cada 10°C de aumento de la temperatura (QIO :::::: 2,0). Sin embargo, el coeficiente de temperatura QIO, varia algo de un enzima a otro sequn la energia de activaci6n

202

PIGURA 8-9

Efecto de fa temperatura sobre fa actividad de un enzima. Los enzimas varian con respecto a su estabilidad termice,

La porcion descendenie de la curve se debe a le desneiurelizecion termica.

11 100 "tI

s tl

to

.g

o

.§

i

20

40

T,OC

Capitulo 8 Enzimas: cinetica e inhibicion

60

de la reaeci6n catalizada: es decir, de la altura de la barrera de energia para pasar al estado de transici6n (fig. 8-3).

Aunque las reaeciones eatalizadas por los enzimas perecen, con Frecuencia, poseer una temperatura. 6ptima (fig. 8-9), el pico que se observa al representar la actividad catalitica Irente a la temperatura se produce porque los enzimas, al ser proteinas, se desnaturalizan por la aeci6n del calor y se inactivan cuando la elevaci6n de temperatura sobrepasa un cierto punto. La aparente temperatura «6ptima» es, por tanto, la resultante de dos procesos: 1) el incremento habitual de la velocidad de reaeci6n con la temperatura, y 2) el incremento en la velocidad de desnaturalizaci6n termica del enzima al sobrepasar una temperatura critica, Aunque la mayoria de enzimas se inactivan a temperaturas comprendidas entre 55 y 60°C, al .. gunos de ellos son completamente est abies y eonservan su actividad a temperatures muy superiores: por ejemplo, los enzimas de diversas especies de bacterias termofilicas que habit an en las termas de agua y siguen siendo actives a temperaturas superiores a los 85°C.

Algunos enzimas, como la ribonucleasa, pierden actividad por calefacci6n, pero la recuperan rapidamente por enfriamien .. to, 10 eual indica que su cadena polipeptidica desplegada vuel .. ve rapidamente a adoptar su conformaci6n nativa (pag. 64).

Inhibicion de los enzimas

A partir del estudio de los inhibidores de los enzimas se ha obtenido informaci6n de import an cia sobre el mecanismo y los caminos de la catalisis enzimatica, la especificidad de sustrato de los enzimas, la naturaleza de los grupos funcionales en el centro activo y la participaci6n de ciertos grupos funcionales en el mantenimiento de la conformaci6n activa de la molecula del enzima. .Ademas, la inhibici6n de algunos enzimas por metabolites especificos constituye un elemento importante en la regulaci6n del metabolismo intermediario.

Los tres tip os principales de inhibici6n reversible de los enzimas, competitiva, acompetitiva y no competitive. pueden distinguirse experimentalmente por los efectos que produce el inhibidor sobre Ia cinetica de reacci6n del enzima, la cual puede analizarse mediante la ecuacion basica de velocidad propuesta por Michaelis-Menten. Para la validez del analisis cinetico, el inhibidor debe combinarse rapida y reoersiblemente con el enzima 0 con el complejo enzima-sustrato. Los inhibidores que reaccionan con el enzima lentamente y/o irreversiblemente se estudian en otro lugar (paqs. 207 y 226).

I nhibicion competitioe

La caracteristica de la inhihici6n competitiva es que el inhibidor puede combinarse con eI enzima libre de tal modo que compite con el sustrato normal para unirse aI centro activo. Un inhibidor competitivo reaeciona reversiblemente con el enzima para formar un complejo enZlima-inhibidor (EI) analoqo al complejo enzima-sustrato:

E + I ;:::::::= E I

203

PARTE 1 COMPONENTBS MOLECULARBS DB LAS CELULAS

La molecula del inhlbidor no resulta quimicamente alterada por el enzima. Siguiendo el formalismo de Michaelis-Menten, podemos definir la constante del inhibidor KI, como la constante de disociacion del complejo enztma-inhibidor:

K = [El[!] I [EI]

La constante del inhibidor, KI• es comparable por tanto a Ks. constante de disociacion del complejo enzima-sustrato,

La inhihicion competitiva se reconoce experimentalmente con Iacilidad, debido a que el porcentaje de inhibicion para una concentracion de inhibidor constante disminuye al incrementarse la concentracion del sustrato. En el analisis cinetico cuantitativo, el efecto de la variacion de la concentracion del sustrato [S] sobre la velocidad inicial vo, viene determinada para una concentracion constante del inhibidor. Este experimento se repite de nuevo con una concentracion de inhibidor diferente. A menudo se efectuan varias series de tales experi ... mentes, cada uno con una concentracion de inhibidor diferen ... te; a continuacion, se trazan representaciones de l/vo frente a 1/[S], para cada una de las concentraciones del inhibidor. Estas representaciones se caracterizan por proporcionar una familia de lineas rectas cuyo punto de interseccion com un se halla sobre el eje de l/vo (fig. 8~1O). La presencia de un inhibidor competitivo incrementa, por tanto, la KM aparente del enzima por el sustrato; es decir, provoca que se precisen concentraciones de sustrato superiores para que se alcance la velocidacL maxima. El valor de la KM aparente del sustrato sera mayor que la verdadera KM al aumentar el valor de la interseccion sobre el eje I/[S]. Como la pendiente de la representacion de la reaccion no inhibida es KMIV max (fig. 8~10; tabla 8J7). y la pendiente de la recta para la reaccion inhibida es KMIV max (1 + [I]IKd, se observa que ha experimentado un incremento, expresado por el factor 1 + [Il/K1• A partir de esta relacion puede calcularse el valor de Kr• Por otra parte, un inhibidor competitive se caracteriza por no afectar al valor de V max, indicando con ello que no interfiere con la velocidad . de ruptura del complejo enzima-sustrato.

EI ejemplo clasico de inhibicion competitiva 10 constituye la inhibici6n de Ia succinato-deshidroqenasa por el malonato (pagina 469), y por otros aniones dicarboxilato (fig. 8~ 11 ). La

:Til 8LA 8-7. Resumen de los efectos de los inhibidores sobre las representaciones de Lineweaver-Bur k, l/Vo frente a 1/ [S] .

Pendiente

Intersecci6n sobre le ordenede

Sin inhibidor

KM Vmax

1 Vm.tx

Competitivo

1

Vma"

Acompetitivo

KM Vmax

No competitivo (los valores de ambas K, son identicos]

204


FIGURA 8-10

Representaciones doble-reciproces que muestran los efectos de le inhibicton competitive, ecompetitioa y no competitive de los enzimas.

Inhibicion competitiva

Pendiente

de Ia reacci6n inhlbida

=(1 + ill) ~

KI Vmh

t

[II

Pendiente = VK~

max

Intersecciones -1

1 [SI

Pendiente

de la reacci6n inhibida

= KM

Vm'x

i

[I]

Acompetitiva

.!..

Vo

Sin Inhibidor Pendiente = K M Vmax

Intersecciones = V 1 (1 + ~1)

~max I

Intersecciones 1 + [I] Kr

1 [S1

Pendiente

Inhibici6n no competitiva de la reacci6n inhibida

= ~ (1 + .!!!..)

Vmax x,

t

[I]

1 Vo

Sin Inhlbldor

P d· KM en lente=-V '

max

Intersecclones ee _1_ (1 + ill)

V".,'x KI

-1 KM

1 [SI

205


succinato-deshidroqenasa forma parte del grupo de enzimas responsables de las reacciones del cicIo de los acidos tricarboxi- 1icos (pag. 469). Cataliza 1a eliminacion de dos atomos de hidroqeno de los dos atom os de carbono metilenicos del succinato [la naturaleza del aceptor del hidroqeno carece de importancia en esta discusion}. El malonato, inhibidor competitive, se parece al succinato en que posee dos grupos carboxilo ionizados a pH 7, pero difiere de el, en que no es deshidroqenado por la succinato-deshidroqenasa. Si se afiade suficiente malonato para inhibir la deshidroqenacion de una concentracion determinada de succinate, en un 50 %, por ejemplo el incremento de la concentracion de succinato reducira el porcentaje de inhibicion que produce e1 malonato.

Ademas del malonato, pueden actuar como inhibidores competitivos de la succinato-deshidroqenasa los aniones de otros acidos dibasicos que poseen 1a distancia adecuada entre los dos grupos anionicos: por ejemplo, e1 anion pirofosfato. Todo ello conduce a la conclusion de que el centro catalitico de la succinato-deshidroqenasa posee dos grupos con carga posit iva, separados adecuadamente, que son capaces de atraer a los dos grupos carboxilato del sustrato con carga negativa. El centro catalitico muestra, por tanto, que es complementario con respecto a 1a estructura del sustrato.

A partir de la relacion entre la estructura molecular de un inhibidor competitivo y de su afinidad por el enzima, expresada porIa KI, se puede obtener informacion valiosa acerca de 1a estructura y Ia geometria del centro activo. Constituye un metodo import ante para abordar el trazado de mapas de los cen-

tros activos del enzima. <,

lnhibicion ecompetitioe

En este tipo de Inhibicion, cuya desiqnacion no es muy adecuada, el Inhibidor no se combina con el enzima libre ni afecta a su reaccion con el sustrato normal; sin embargo, el inhibidor se combina con el complejo enzima-sustrato para formar un complejo inactivo enzima-sustrato-inhibidor, el cual no experimenta su transformacion posterior en el producto habitual de la reaccion:

ES+ I ~ ESI

La constante del inhibidor es, por tanto:

K = [ES][I]

I [ESI]

Estas relaciones demuestran que el grado de inhibiclon puede aumentar cuando la concentracion de sustrato se ve aumentada. La inhibicion acompetitiva puede reconocerse con gran facilidad en las representaciones de 1/ Vo frente a 1/ [S] para concentraciones constantes del inhibidor, Tal como muestran la figura 8~10 y la tabla 8-7, 10 caracteristico de la inhibicion acompetitiva es que la pendiente de las rectas permanece constante al aumentar la concentracion del inhibidor, pero la V max decrece. La inhibicion acompetitiva es poco frecuente en las' reacciones de un solo sustrato, pero es corriente en las reacciones de dos sustratos,

206

FIGURA 8-11

Inhibicion competitiva de fa succinetodeshidrogenasa.

Reaccion de la succineio-deshidtoqensse.

cooI

CH2

I Succinato

CH2

I COO-

+

Aceptor de hldroqeno

J r Succtnato deshidrogenasa

cooI

CH

II Fumarato

HC

I coo-

+

Aceptor de hidr6geno reducido

Algunos inhibidores competitivos de la succineto-deshidroqensse. Obseroese ' que todos contienen dos grupos snionicos cuyo espaciado se petece al existenie en el succineto,

cooI

CH2

I coo-

Malonato

cooI coo-

Oxalato

cooI

CH2

I c=o

I coo-

Oxalacetato

0-

I O=p-O-

I

o

I o=p-o-

I

0-

Pirofosfato

FIGURA 8-12

Quelato del tetracetato de etilendiamina con su cation metelico divelente (Me2+). La pardon sombreada representa el plano

de los enlaces coordinados.

o

/1

. C

-0---- -,

I 0 ~

I ~ CH1

'--C--CH I

'\

Capitulo 8 Bnzimas: cinetice e inhibiciot»

Inhibioi6n no competitive

Un inhibidor no competitivo puede combinarse con el enzima libre 0 bien con el complejo enzima-sustrato, interfiriendo con la acci6n de ambos. Los inhibidores no competitivos se unen a un centro del enzima distinto del centro activo. a menudo para deformar al enzima, de modo que no pueda formarse el complejo ES a su velocidad normal y que una vez formado no se descomponga a su velocidad habitual para liberar los productos de reacci6n. Sus efectos no se anulan al aumentar la concentraci6n del sustrato. En la inhibici6n no competitiva la reacci6n con el inhibidor produce dos formas inactivas, EI y ESI:

E + I ;;:::::= E I

ES + I ;;:::::= ESI

para las que existen dos constantes del inhlbidor:

KP - [E][!]

I - [EI]

I0.S[ _ [ES][I] I - [ESI]

que pueden ser iguales 0 diferentes. La inhibici6n no competitiva se reconoce tambien con gran facilidad en las representaciones de 1/ Vo frente a 1/ [S]. en presencia de diferentes concentraciones ~l inhibidor, que se mantienen constantes (fig. 8~10; tabla 8.::r7). Las representaciones difieren en pendiente pero no comparten un punto de intersecci6n comiin sobre el eje l/v(). El valor de la intersecci6n sobre dicho eje es mayor para el enzima inhibido que para el no inhibido, 10 que indica que la V max decrece en presencia del Inhibidor y no puede restablecerse su valor a pesar de que la concentraci6n del sustrato pueda ser elevada.

El tipo mas corriente de inhibici6n no competitiva es producida por los reactivos que pueden combinarse reversiblemente con alqun grupo funcional del enzima (situado fuera del centro activo) que sea esencial para mantener la conformaci6n tridimensional cataliticamente activa de la molecula del enzima. Algunos enzimas (aunque no todos ellos) que poseen un grupo - SH esencial, son inhibidos no competitivamente por los iones de metales pesados (pag. 88), sugiriendo que tales grupos - SH deben permanecer intactos para que el enzima conserve su conformaci6n act iva normal.

Algunos enzimas que precisan de iones metalicos para su actividad son inhibidos no cornpetitivamente por agentes capaces de unirse al metal esencial. Por ejemplo, el agente quelante tetra~acetato de etilendiamina (EDTA) se une reversiblemente al Mg2+ y a otros cationes divalentes, inhibiendo as! de modo no competitivo a algunos enzimas que precisan de tales iones para su actividad (fig. 8~12).

Inhibici6n irreversible: modificaci6n del enzima

En la inhibici6n reversible de los enzimas, discutida anteriormente. el inhibidor interviene en un equilibrio Iacilmente reversible. que se establece con rapidez, con el enzima 0 con el complejo enzima-sustrato, y que puede analizarse mediante

207


la formulacion de Michaelis-Menten. Sin embargo, algunos enzimas experimentan inactivacion irreversible cuando se tratan con agentes capaces de unirse covalentemente y que modifican de modo permanente a un grupo funcional, necesario para la catalisis, con 10 que se inactiva la molecula del enzima. Este tipo de inhibicion no puede ser tratada por los principios de Michaelis-Menten. que suponen la Iormacion reversible de los complejos EI 0 ESI. Con frecuencia, la inhi ... bicion reversible se manifiesta lentamente en comparacion con la cinetica de la reaccion normal del enzima, de modo que al principio la Inhibicion es incompleta, pero aumenta continuamente con el tiempo debido a que se produce la modificacion quimica de una fraccion creciente de las moleculas del enzima.

La inactivaclon irreversible de los enzimas por modificacion covalente se estudiara con mas detalle en el capitulo 9 (paqi .. na 226), ya que ha proporcionado informacion importante sobre la identidad de los grupos funcionales cataliticos del centro activo.

Cinetica de las reacciones enzimaticas con dos 0 mas sustratos

Muchos enzimas catalizan reacciones con dos sustratos que se influyen mutuamente; estas reacciones muestran una cinetica mucho mas compleja que las reacciones sencillas de un solo sustrato consideradas anteriormente. Entre los enzimas que catalizan reacciones bisustrato se halla la numerosa clase de las transferasas. que catalizan la transferencia de un grupo funcional especifico desde un sustrato al otro (tabla 8-1).

EI analisis cinetico de las reacciones de dos sustratos, simbolizado por la ecuacion

E A+B~P+Q

es mas complicado que el de las reacciones con un solo sustrato puesto que pueden existir varios complejos enzima-sustrato, tales como los complejos binarios EA, EB. EP y EQ y los complejos ternarios EAB. EPQ, EAQ y EPB. La determinacion de KM y de V max en los sistemas bisustrato es seme[ante al sistema uti liz ado para las reacciones con un solo sustrato. La concentracion de un sustrato, por ejemplo B. se mantiene constante normalmente a nivel saturante, mientras que la concentracion del sustrato A se cambia para determinar su efecto sobre la velocidad inicial de la reaccion y se obtiene· asi la constante de Michaelis-Menten para el sustrato A; es decir, Ktt. Para obtener el valor de la citada constante, se emplean tres 0 mas concentraciones constantes del sustrato B. A continuacion se invierte el dispositivo experimental; la con ... centracion del sustrato A se mantiene constante a nivel saturante, y se determina el efecto que produce sobre la velocidad inicial de la reaccion la variacion de la concentracion del sustrato B: se obtiene de este modo el valor de KM para el sustrato B: es decir, K~. Los valores de K~ y K~ se obtienen muy facilmente mediante las representaciones doble-reciprocas, Las reacciones bisustrato se reducen, por tanto. al caso de la reaccion de un solo sustrato cuando uno de los sustratos se mantiene constante a una concentracion saturante. La tabla 8-5 muestra los valoresde KM para los dos sustratos y dos productos de la aspartato aminotransferasa (vease pag. 575).

208

Capitulo 8 Bnzimas: cinetice e inhibicion

La mayoria de las reacciones de dos sustratos pueden inc1uirse en una de las dos clases siguientes: reacciones de desplazamiento simple y reacciones de doble desplazamiento, las cuales pueden generalmente distinguirse por analisis cinetico, tal como se resume en la figura 8~ 13. Sin embargo, el analisis cinetico no es infalible, y con frecuencia deben emplearse otros enfoques experimentales para el diagn6stico de la ruta de reacci6n. En los parrafos siguientes examinaremos las caracteristicas de los casos ideales.

Reacciones de desplezemiento simple

En este tipo: de reacciones, los dos sustratos A y B, deben hallarse presentes simultaneamente sobre el centro activo del enzima para formar un complejo ternario EAB con objeto de que tenga lugar la reacci6n. Las reacciones de desplazamiento simple se producen de dos formas, al azar y ordenadas; ambas difieren en la secuencia con que ambos sustratos se unen al enzima. En las reacciones bisustrato al azar, cualquiera de los dos sustratos puede unirse al enzima en primer lugar, indicando con ello, que el complejo ternario EAB (llamado tambien complejo central) puede formarse por dos caminos diferentes

E + A ;:::::: EA EA + B ;:::::: EAB

(13)

o

E + B ;:::::: EB EB + A ;:::::: EAB

(14)

Muchas de las fosfotransferasas catalizan reacciones de desplazamiento simple a1 azar. Constituye un ejemplo la reacci6n catalizada por la creatina~quinasa (paq. 776).

ATP + creatina e=e ADP + fosfocreatina

En esta reaccion tanto el A TP como la creatina se unen al centro activo, en cualquier secuencia, formando un complejo ternario. Despues de la transferencia del grupo fosfato, desde el ATP ligado a la creatina ligada, ambos productos abandon an el centro activo, en una u otra secuencia.

En las reacciones de desplazamiento simple orden ado, existe una secuencia de reacci6n obliqetorie, de modo que un sustrato especifico, el primer sustrato 0 sustrato conductor, es el que se fija en primer lugar, antes de que pueda unirse el segundo sustrato tambien llamado sustrato acompafiante. Las reacciones siguientes muestran la secuencia

E + A ;:::::: EA EA + B ;:::::: EAB

(15) (16)

en la que A es el sustrato conductor. Muchas deshidrogenasas que utilizan el dinucleotide de nicotinamida y adenina (NAD+) como coenzima para aceptar electrones de sus sustratos (pagina 491), catalizan reacciones bisustrato ordenadas. Por

209


FIGURA 8~13

Resumen de las cerectetistiees de las reacciones bisustrato del tipo A + B ;: P + Q. Con [recuencie pueden distinguirse los di[erentes tipos de eeecciones bisustreto POt la netureleze de las representeciones doble reciproces

de l/vo [rente a 1/[S] con el otto sustrato que se meniiene constente a una concenrracion [ija. Los desplazamientos simples al azar hebituelmente proporcionan un conjunto de linens rectes que se corten, pero a veces son mas complejos y sus representaciones no tiguran equi, Los desplazamientos simples y ordenados POt 10 general dan representaciones conoerqentes como [igura ebeio, mientras que los desplazamientos dobles dan linees paralelas en las tepresentaciones doble teciptoces,

+K~::)

\ Incremento de la

: 1 concentracion de B

Reacciones de desplazamiento sencillo

AL AZAR: Tanto el sustrato A como el B pueden combinarse con el enzima libre E para dar un complejo binario. La adici6n del otro sustrato se produce sequidamente, y rlnde el complejo terciario EAB.

Tal como puede verse aqui, la liberaci6n de los productos P y Q se verifica en una secuencia al azar, pero este puede no ser necesariamente el caso.

A j-B-1..."..----+. E ( Y P

EA EB EP

B (t Ad, EAB _ EPQ (hQ

ORDENADO: EI enzima libre E debe comblnarse en primer lugar con el sustrato conductor A para formar un complejo binario, La adici6n del siguiente sustrato B produce entonces el complejo ternario EAB.

Se indica 1a liberaci6n ordenada de los productos aunque no es obligatoria por necesidad.

A~E--yQ

EA EQ

B~EAB-EPQLp

La ecuacion general de velocidad para las reacciones ordenadas, en las que A es el sustrato conductor

Vmax

Vo = M K.I} K/i K.I}

[A][B] + [A] +1BI+ 1

que despejada en forma de pendiente-interseccion [doble-reciproca) con respecto a A

.i , _1 (K/i + KG' K1} )(_1 ) + _1 (1 + Kl} )

Vo Vrnh [B] [A] Vrnax [B]

Las representaclones de l/vo frente a U[A]. a diversas concentraciones del sustrato B que se mantiene constante (suponiendo que no existan acciones mutuas entre' los centros de union de A y de B)

1

Vo

-1 K~

1 [A]

210

Reacciones de lloble desplazamiento [pinq-ponq}

EI sustrato A se comb ina con el enzlma E para formar el complejo EA. del cual se libera el producto P. abandonando al enzima E* substituido covalentemente, EI sustrato B se comb ina entonces con E. para dar

el complejo E* B. que se descompone produciendo el producto Q y el enzima libre E.

La ecuaci6n general de velocidad es

que en forma de pendiente-Interseccion

.i , Kj} (_1) + (1 + KlJ )(_1 )

Vo Vmax [A] [B] Vrnax

Las representaciones de l/vo frente a U [A]. para diversas concentraciones del sustrato constante B.

j Incremento de la concentraci6n de B

Inter- =_1_ (1 + ~)

secclones Vmax [B]

1 [A]


ejernplo, la malato~deshidrogenasa, (pag. 471), que cataliza la reaccion

Malato + NAD+ ;::::= oxalacetato + NADH + H+ (17)

debe unirse, en primer, lugar al NAD+ y rinde el complejo E~NAD+; el malato se combina con este ultimo, con 10 que se forma el complejo ternario E-NAD+-malato.

Las reacciones bisustrato al azar pueden distinguirse de las ordenadas experimental mente. La reacci6n es de tipo ordenada si es inhibida globalmente por el ultimo producto de la reaccion y este compite solemente con el primer sustrato (sustrato conductor). Por ejemplo, la reacci6n de la malato deshidrogenasa (17), que es ordenada, resulta inhibida por un exceso de NADH, que compite con el primer sustrato conductor normal, el NAD+, en su uni6n al enzima: sin embargo, el NADH no compite con el malato.

En ciertas condiciones, el complejo ternario de algunas reacciones bisustrato ordenadas, se halla en concentraciones infimas, de suerte que los productos de la reacci6n perecen provenir directamente de la reaccion entre el complejo binario EA (formado por el enzima y el sustrato conductor) y el segundo sustrato B, sin que aparentemente se forme un complejo EAB. La Iactato-deshidroqenasa dependiente del NAD y la alcohol-deshidrogenasa en determinadas condiciones experimentales presentan este tipo de comportamiento, que fue descubierto y analiza do por primera vez por H. Theorell y B. Chance (paq. 495).

Reacciones (ping-pong) de doble desplazamiento

En las reacciones bisustrato de este tipo, un sustrato debe hallarse unido al enzima y debe liberarse un producto, antes de que tenga lugar la entrada del segundo sustrato y la partida del segundo producto. En estas reacciones el primer sustrato reacciona con el enzima y origina una forma modificada del mismo, habitualmente por transferencia de un grupo funcional. En la segunda etapa este grupo funcional se transfiere desde el enzima al segundo sustrato. Constituye un ejemplo de reacci6n de doble desplazamiento la catalizada por la aspartato-amino-transferasa. tambien llamada aspartato-transaminasa, que cataliza la reacci6n

Aspartato + a-oxoglutarato :;;= oxalacetato + glutamato

EI aspartato, sustrato conductor, es el primero que se combina con el enzima. El grupo amino del aspartate se transfiere des", pues al fosfato de piridoxal (pag. 350), que es el grupo prostetico del enzima al que se halla intimamente unido. A continuacion, el oxalacetato, primer producto de la reacci6n, abandona el centro activo en el que es sustituido por el segundo sustrato, elo-oxoqlutarato, al cual el enzima transfiere el grupo amino para formar glutamato. el cual entonces, abandona el centro activo. A estas reacciones bisustrato que se verifican en dos etapas, se las ha designado con el descriptive apelativo de reacciones ping-pong (fig. 8-13).

Variadones de equilibrio en las reacciones bisustreto

Las reacciones bisustrato de desplazamiento, simple a doble, pueden distinguirse con frecuencia par su comportamiento cinetico caracteristico, tal como se indic6 anteriormente

211


en la figura 8~ 13: sin embargo, el analisis cinetico, por si solo, no conduce siempre a conclusiones infalibles. Existe otro criterio importante que, a veces, permite distinguirlas. Lo aclararemos comparando dos reacciones enzimaticas que muestran un parecido formal: la reacci6n catalizada por 1a secerose-loslorilese. de doble desplazamiento, y la de la mal~ tosa~[ostorilasa. que es de desplazamiento simple.

La fosforilasa de la sacarosa cataliza la reacci6n

Sacarosa + Pi ~ a~D~glucesa~l~fosfato + ,e~o~fructosa

en 1a que el disacarido sacarosa, que contiene a~o~glucosa y ,8~o~fructesa (paq. 267) experimenta una escisi6n fosforolitica reversible y produce a~o~glucosa~l~fosfato y n-Iructosa libre. EI mismo enzima, actuando en la direccion inversa, participa en la biosintesis de la sacarosa. EI estudio detallado de este enzima muestra que puede catalizar una reaccion de intercambio en 1a que el fosfato inorqanico libre se cambia con e1 grupe fosfato de glucesa-l-fosfato cuando no estan presentes ni la sacarosa ni 1a fructosa, sin que se produzca ninguna ·variaci6n neta del fosfato 0 de glucosa-I-fosfato. EI curse de esta reaccion de variacion de equilibrio, puede seguirse si se inicia con un fosfato inorqanico marcado con el isotope radiactivo 32p (indicado en color) y una glucesa-I-Iosfato sin marcar:

Fosfato + a~D~glucosa~ I-fosfato :;:

fosfato + a~D-glucosa~l~ fosfato

La qlucosa-Lfosfato va quedando marcada con el isotope a medida que transcurre el intercambie. De modo analogo, la Iosforilasa de 1a sacarosa cataliza tambien una reacci6n de variaci6n del equilibrio entre una Iructosa marcada isotopicamente (en color) y la porcion de fructosa de 1a sacarosa no marcada, en ausencia de fosfato 0' de glucesa-l-fesfate:

Fructosa-]- glucesa~fructosa ~ fructosa + glucosa- fructesa

(Sacarosa)

[Sacarosa]

A partir de estos y otros hechos, se ha deducido que 1a reacci6n catalizada per la fosforilasa de 1a sacarosa es una reacci6n de dob1e desplazamiento que se produce en dos etapas distintas y en 1a que interviene un intermediario covalente enzima-qlucosa, Estas etapasson las siguientes:

E + sacarosa ~ E-glucesa + n-Iructosa

E-glucosa + Pi ~ E + a-o-g1ucesa-I-fosfato

La variaci6n de equilibrio de la fructesa libre marcada con la porci6n de fructosa de la sacarosa, se alcanza con la primera reaccion, que puede tener 1ugar con independencia de la segunda, y el intercambio de Iosfato isotopico con el grupe I-Iosfato de 1a a~o-glucosa-l-fesfate, ocurre en 1a segunda reaccion, que puede transcurrir con independencia de 1a primera. Esta fermulaci6n de la reacci6n de la fesferilaci6n de la sacarosa se funda en 1a demostraci6n directa de 1a formaci6n por e1 enzima de un intermediario covalente enzimaglucesa.

La reaccion de la meltose-josjorilese, ejemplo de desplazamiento simple, ofrece un contraste notable:

Maltosa + Pi ~ n-qlucosa + ,e-o-glucesa-l-fesfato

212


La maltosa que es un disacarido constituido por dos moleculas de n-glucosa, experimenta una ruptura fosforolitica que muestra semejanza formal con la reaccion de la fosforilasa de Ia sacarosa. Sin embargo, la fosforilasa de la maltosa no cataliza eI cambio isotopico entre el fosfato y la ~~D~glucosa I-fosfato en ausencia de maltosa y de n-qlucosa, ni tampoco cataliza un intercambio entre la n-qlucosa isotopica libre y un res to de glucosa de la maltosa en ausencia de fosfato y de qlucosa-Lfosfato. Ademas, no se ha puesto de manifiesto la existencia de ninqun intermediario no covalente enzimaazucar, en la accion de la fosforilasa de la maltosa. A partir de esta y de otras evidencias, se ha llegado a la conclusion de que la reaccion de la maltosa-Iosforilasa es una reaccion de desplazamiento simple en la que tanto la maltosa como el fosfato, deben hallarse presentes, simultaneamente, en el centro activo. Cuando tanto las experiencias cineticas como las de variacion de equilibrio estan en concordancia, puede Iormularse una decision segura acerca de si una reaccion enzimatica es de desplazamiento simple 0 doble.

Determinacion cuantitativa de la actividad enzimatica

La cantidad de un enzima en una disolucion determinada 0 en un extracto de tejido, puede determinarse cuantitativamente en relacion al efecto catalitico que produce. Para este objeto es necesario saber:

1. La estequiometria global de la reaccion catalizada.

2. Si el enzima precisa de la adicion de cofactores, tales como los iones metalicos 0 coenzimas.

3. Su dependencia de las concentraciones de sustrato 0 de los cofactores; es decir, el valor de KM para el sustrato y para el cofactor.

4. Su pH optimo.

5. Una zona de temperatura en que sea estable y muestre actividad elevada.

6. Un procedimiento analitico sencillo para determinar la desaparicion del sustrato 0 la aparicion de los productos de la reaccion,

Siempre que sea posible, los enzimas se ensayan empleando sistemas en que el pH es optimo y la concentracion del sustrato se halla por encima del nivel de saturacion, de tal modo que la velocidad inicial de la reaccion es de orden cero respecto al sustrato. En estas condiciones, la velocidad inicial de la reaccion solamente es proporcional a la concentracion del enzima. En el caso de enzimas que necesitan el concurso de cofactores, tales como iones metalicos 0 coenzimas, estos deben afiadirse tam bien en concentraciones que sean superiores a la de saturacion, de modo que el verdadero factor limitante de la velocidad en el sistema sea la concentracion del enzima. Generalmente, la medida de la velocidad de formacion del producto de la reaccion es mas segura que la medida de la desaparicion del sustrato, ya que este debe estar, con frecuencia, en concentraciones bastante elevadas para garantizar la cinetica de orden cero.

La determinacion cuantitativa de la actividad enzimatica se efectua del modo mas rapido y conveniente cuando el sus-

213


trato 0 el producto son coloreados 0 absorben luz en la region del ultravioleta, ya que la velocidad de aparicion 0 de desaparicion de un producto 0 de un sustrato que absorbe la Iuz puede seguirse con un espectrofotometro, y permite efectuar un registro continuo del curso de la reaccion si se emplea un registrador provisto de una banda de papel movil, No deberan hallarse presentes otros componentes que absorban 0 dispersen la luz, pero en caso contrario, deberan prepararse los correspondientes blancos para efectuar la adecuada sustraccion. Por ejemplo, tenemos la medida de la actividad del enzima lactato~deshidrogenasa, que transfiere electrones desde el Iactato a la forma oxidada del dinucleotide de nicotinamida y de adenina (NAD+) (tabla 8~3; vease tambien paqina 493) y rinde piruvato, el coenzlma reducido NADH, y un proton:

Lactato + NAD+ ~ piruvato + NADH + H+

La forma reducida del coenzima, NADH, absorbe luz en el ultravioleta a 340 nm (pag. 492). mientras que la forma oxidada NAD+, ellactato y el piruvato no 10 hacen. EI progreso de la reaccion, en el sentido directo, puede seguirse midiendo el incremento de absorcion de la luz del sistema a 340 nm en un espectrofotometro 10 cual es mucho mas sencillo que la determinacion quimica de cualquiera de los sustratos 0 de los productos.

Las determinaciones opticas son tan sencillas y comodas, que se emplean a menudo para seguir la variacion de una reaccion enzimatica con el tiempo, en la que ni eI sustrato(s) ni el producto(s). exhibe ninqun maximo de absorcion de Iuz caracteristico; para ello, se ha acoplado la reaccion con otra reaccion enzimatica, en la que pueda medirse con facilidad, alqun cambio optico, Tenemos como ejemplo la reaccion entre el fosfoenolpiruvato y el ADP que proporciona piruvato y ATP por transferencia de un grupo fosfato. catalizado por la piruvato~qttinasa:

Fosfoenolpiruvato + ADP ~ piruvato + ATP

Aunque los sustratos y los productos de tal reaccion no absorben la luz en la zona de 300 a 400 nm, esta es Iacil de medir si se afiade al sistema un exceso del enzima lactatodeshidrogenasa y de NADH para dar las siguientes reacciones acopladas, cuyo intermediario cormin es el piruvato:

Fosfoenolpiruvato + ADP ~ piruvato + ATP Piruvato + NADH + H+.~ lactato + NAD+

En presencia de excesos de Iactato-deshidroqenasa y de NADH, la formacion de piruvato en la primera reaccion va seguido por la rapida reduccion del piruvato a lactato en la segunda. Por cada molecula de piruvato que se forma y se reduce, se oxida una molecula de NADH a NAD+, 10 cual produce una disminucion de la absorcion de la luz a 340 nm, maximo de absorcion del NADH. En estaexperiencia aco,.. plada el enzima cuya actividad se mide constituye el componente limitante de la velocidad por ajuste adecuado del sistema reaccional.

214

TABLA 8~8. Actividad molecular t de alqunosceaztmaa en el intervalo

de 20 a 38 -c,

Enzima

Actividad moleculart

Anhidrasa carbonica C 1l5-3~cetosteroide~isomerasa Catalasa

,a-Amilasa

,a-Galactosidasa Fosfoglucomutasa Succinato-deshldroqenasa

36 000 000 17100 000 5600000 1100 000 12500

1240 1 150

t La actividad molecular de un enzima es el mimero de molecules de sustrato transformadas por una sola molecule del enzima por minuto en condiciones optimas.


Unidades de actividad enzimatica

La unidad de actividad enzimatica empleada mas corrientemente se define como la cantidad de enzima que oriqina: 1a transformacion de I,D p.mol (10-6 mol) de sustrato por minuto a 25 "C, en condiciones optimas de medida. La actividad espe~ cifica es el mimero de unidades del enzima por miligramo de proteina. Constituye una medida de la pureza del enzima, que aumenta durante el proceso de su purificacion, y llega a ser maxima y con stante cuando este se halla en est ado puro. La activ,idad molecular 0 molar, que antiguamente se llamaba niimere de recembio, es el numero de moleculas de sustrato transformadas por minuto por una sola molecula de enzima (0 por un solo centro activo}, cuando el enzima es el factor limitante de la velocidad (tabla 8~8). La actividad molar de un enzima con un centro activo unico puede calcularse a partir del valor de su V max y de su peso molecular. El enzima anhidrasa carbonica posee la actividad molar mas elevada de cualquiera de los enzimas conocidos, 36000000 mirr'! por molecula.

La Comision de Enzimas (vease Bibltoqrafia] ha recomendado una nueva unidad internacional para la actividad enzi ... matica el catal (abreviadamente cat), que se define como 1a cantidad de actividad enzimatica que transforma 1 mol S-1 de sustrato. La nueva unidad se hall a en correlaci6n con las dimensiones de las constantes de velocidad en la cinetica quimica, las cuales se basan en el segundo, en lugar del minuto. Las actividades pueden expresarse tambien en microcatales (,ucat), nanocatales (neat) 0 picocatales (pcat). Una unidad enzimatica antigua (vease mas atras) es, por tanto, igual a 1/60 }.teat 0 bien a 16,67 neat. En la nueva convencion la ectivided especifica se expresa en catales por kilogramo de proteina, equivalents a microcatales por miliqramo de proteina, y 1a activ'idad molar en catales por mol de enzima.

Purificaci6n de los ensimas

La aplicaci6n de metodos de determinacion cuantitativa, como los descritos anteriormente, a la determinacion de la magnitud de la actividad cat ali tic a presente en las diferentes fracciones proteicas obtenidas de las celulas 0 de los tejidos por los metodos que se describleron detalladamente en el capitulo 7 (pag. 161), permite purificar los enzimas y obtenerlos, al final. en forma homoqenea, Los metodos de abordar la purificacion y los procedimientos que se utilizan para ello fueron aclarados (paq. 177) mediante algunos datos reales obtenidos durante la purificaci6n del enzima acetilcolinesterasa. Debe tenerse presente que un extracto crudo de celulas bacterianas, o de un tejido animal. 0 vegetal, puede contener centenares de proteinas diferentes, siendo la mayor parte de ellas enzimas cuya solubilidad y propiedades acido-base no difieren mucho. Por ello, la purificacicn de un determinado enzima a partir de un extracto de esta naturaleza precisa de la eleccion empirica de una secuencia de procedimientos de separacion que aprovechen las diferencias de propiedades entre el enzima que se desea aislar y todas las demas proteinas presentes.

215


Complejos enzima-suatrato

y compuestos covalentes enzima-sustrato

Como hemos visto, la evidencia cinetica da a entender claramente que todos los enzimas se combinan de modo transitorio con sus sustratos para formar complejos enzima-sustrato durante su ciclo catalitico. Pero debido a la inestabilidad de los complejos enzima-sustrato que, por definicion, se descomponen rapidamente, podria esperarse que hubiese dificultad en obtener pruebas de su Iormacion. No obstante, la evidencia de que se forman tales complejos se ha conseguido mediante medidas fisicas y quimicas. El problema puede abordarse mediante la observacion espectroscopica de las variaciones espectrales pasajeras que se producen cuando se mezcla el sustrato con el enzima. La cata.lasa y la peroxidasa son hemo-enzimas que poseen espectros de absorcion caracteristicos debido a sus grupos prosteticos hemo, y muestran eambios transitorios en sus espectros euando se mezclan con su sustrato, el peroxide de hidroqeno, 10 eual es el reflejo de la Iorrnacion y la descomposicion de sus complejos enzima-sustrato, De modo analoqo, algunos enzimas, al mezclarse con sus sustratos, experimentan cambios de rotacion optica a ciertas longitudes de onda (pagina 154). los cuales se interpretan como manifestaciones de los cambios de conformacion del enzima que acompaiia a la pro~ duccion del complejo enzima-sustrato.

Es especialmente convincente la demostracion "de la existencia de complejos enzirna-sustrato bastanteestables. como cuando algunos enzimas reaccionan con un sustrato perezoso, es decir, uno que forme con facilidad un complejo no covalente enzima-sustrato. pero que se deseomponga muy lentamente en comparacion con el sustrato bioloqico normal. La existencia de tales complejos enzima-sustrato perezosos se ha observado en la lisozima (pag. 239), en la n-aminoacido-oxidasa y en otros varios enzimas. De heche, un complejo perezoso enzima-sustrato de la lisozima ha sido cristalizado y sometido al analisis por rayos X, proporcionando algunos rasgos reveladores acerca de la estructura del centro activo (pag. 238). Tambien es posible demostrar la formacion de complejos estables de algunos enzimas, con inhibidores competitivos, cuya estructura se parece a la del sustrato y que se unen al mismo centro del enzima sobre el que 10 hace el sustrato. La formacion de complejos enzima-sustrato puede observarse tam bien directamente en algunas reacciones con dos sustratos, cuando se afiade uno de ellos en ausencia del otro. Por ejemplo, la alcohol-deshidroqenasa forma un complejo con el dinucleotide de nicotinamida y de adenina oxidado en ausencia de etanol, que es el otrosustrato.

Es probable que todos los enzimas formen complejos enzimasustrato reversibles no covalentes del tipo de Michaelis-Menten, cuya descomposicion constituye la etapa limitante de la velocidad cuando la concentracion del sustrato es la saturante. Ademas. algunos enzimas forman como intermediarios compuestos covalentes enzima-sustrato, sobre todo los que catali zan reacciones de doble desplazamiento. Un ejemplo clasico 10 constituye elenzima fmctosa~difostato~aldolasa (pag. 435). que cataliza la reaccion reversible

1 ,6~difosfato de fructosa ~

fosfato de dihidroxiacetona + 3~fosfato de gliceraldehido

216

FIGURA 8~14

Reduccion del compuesto enzime-substreto entre fa [ructosa-diiosjeto-eldolese y el fosfato de dihidroxiecetone.

Capitulo 8 Enzimas: cinetice e inhibiclon

Enz

I

NH2

+ o

II

HOCH,-C-CH20PO:,H,

HP 1~H~

Enzlma con un grupo e-amino del resto de lisina esencial

Fosfato de dihidroxiacetona (substrato)

Enz

I N

II

Compuesto enzlma-substratc (base de Schiff)

HOCH2-C-CH20P03Hz 1 Hidruro de boro

Enz

I NH

I

Compuesto enzlma-substrato reducldo

HOCH2-CH-CHzOP03Hz 1 Hidrolisis

e~N.g1iceril.lisina libre

La adicion de borohidruro sodico, poderoso reductor a una mezcla de aldolasa y de fosfato de dihidroxiacetona marcado origina la formacion de un compuesto covalente, marcado isotopicamente, a fosfato aldolasa-dihidroxiacetona. que es cataliticamente inactivo. Por hidrolisis completa de este compuesto con un acido, se encuentra en el hidrolizado un derivado estable e-N-glicerilo de un solo resto de lisina (£i~ gura 8~ 14). Este derivado no se forma en ausencia del reductor. De la estructura del compuesto marcado se dedujo que la aldolasa se combina de modo covalente, aunque reversible. con el fosfato de dihidroxiacetona formando una base de Schiff inestable (pag. 436) entre el grupo e -amino de un resto de lisina situado en el centro activo del enzima y el grupo carbonilo del sustrato. EI tratamiento con borohldruro reduce a este intermediario, que es muy Iabil, a un derivado covalente pero inactivo. De esta manera se han aislado con exito compuestos enzima-sustrato covalentes y muy Iabiles, de varios enzimas que actuan sobre sustratos con grupos funcionales amino 0 carbonilo, transformandolos en sus formas reducidas y eatables.

En aIgunas reacciones bisustrato de doble desplazamiento, puede aislarse un compuesto enzima-sustrato si el otro sustrato esta ausente del sistema. Por ejemplo, cuando la fosforilasa de Ia sacarosa actua sobre la sacarosa en ausencia de fosfato, se forma un compuesto enzima-qlucosa (pag. 212).

217


Enzimas y sustratos en las celulas vivas

Los enzimas pueden actuar en las celulas vivas en condiciones muy diferentes de las que 10 hacen en los sistemas experimen ... tales, tales como las experiencias cineticas in vitro descritas en este capitulo. St una celula hepatica contiene 1000 enzimas diferentes y su peso molecular medic es de alrededor de 140 000, la concentracion media en que cada enzima se hallara en el citoplasma sera menor que 10-6 M (1,0 .pM). Algunos enzimas, sobre to do los que catalizan las reacciones en las rutas centrales, pueden existir en concentraciones muy supe ... riores: por ejemplo, la hexoquinasa, que cataliza la £os£orila ... ci6n de la glucosa por el ATP, est a presente en el musculo en cantidad que excede a 10-4 M (100 pM). Por otra parte, algunos enzimas, como por ejemplo los que catalizan la biosintesis de los coenzimas estan presentes, probablemente, en concentraciones tan bajas como 10-.8 M (0,01 ,pM).

Se han efectuado tambien medidas de la concentraci6n cito ... plasmica de divers os metabolitos que actuan como sustratos. La mayoria se hallan presentes en una concentraci6n total comprendida entre 5 y 500p,M. En muchos casos, por no decir la mayoria, laconcentraci6n del sustrato en las celulas intact as es insuficiente para saturar aI enzima: de hecho, en algunos de ellos, la concentraci6n del sustrato, no es mucho mayor que la concentraci6n del enzima. Esta claro que los enzimas, en la celula intacta, no exhiben necesariamente el comportamiento cinetico clasico de Michaelis ... Menten, que supone que la concentraci6n del enzima es despreciablemente pequefia comparada con la concentraci6n del sustrato. El ana ... lis is cuantitativo de la cinetica de los enzimas en la celula intacta constituye un campo de la enzimologia apenas iniciado y reviste la maxima importancia para la comprensi6n de la regulacion biol6gica de la actividad enzimatica (cap. 9, pagi ... na 240).

Resumen

Los enzimas se clasifican basandose en la reaccion que catalizan. Algunos enzimas son proteinas simples; otros son proteinas conjugadas y contienen grupos prostetlcos constituidos por iones metallcos, por coenzimas, 0 por ambos. Los coenzimas y los grupos prosteticos actuan como transportadores intermediarios de grupos funcionales especlficos, de atomos 0 de electrones. Muchos coenzimas contienen una molecule de una vitamina determinada, nutriente orqanico del que solo se precisan vestigios para la funclon celular normal.

En las reacciones catalizadas por enzimas, un incremento de Ia concentra cion del sustrato aumenta la velocldad de reaccion hasta que se alcanza un punto en que dicha velocidad se hace independiente de la concentracion del sustrato. En este punto el enzima se hall a saturado y la reaccion es de orden cero con respecto al sustrato. Para cada enzima hay una concentracion de sustrato caracteristica (KM' la constante de Mlchaelts-Menten) a la que la velocidad de reaccion es la mitad de la velocidad maxima. La relacion cuantitatdva entre la velocidad inicial de la reacclon, la concentracion del sustrato KM y la velocidad maxima de un enzima vienen dadas por la ecuacion de Michaelfs-Menten. Su deduccion se basa en la suposlcion de que se forma un complejo enzima-sustrato que es reversible, como etapa esencial de la catallsls, Los enzlmas exhiben tambien un pH optima y un intervalo de temperatura en el que son estahIes y activos.

Los Inhfbidores competitivos de los enzimas son aquellos que reaccionan reversiblemente con el enzima libre en competencia con el sustrato para formar un complejo enztma-inhibidor: su accion puede invertirse por incremento de la concentracion del sustrato, Los inhibidores acompetitivos

218


no reaccionan con el enzima libre, pero se combinan reversiblemente con el complejo enzima-sustrato, impidiendo la Iormacion de los productos, Los inhlbidores no competitivos reaccionan reversiblemente tanto con el enzima libre como con el complejo enzima-sustrato. Los inhibidores irreversibles producen una modificacion qui mica permanente de alqun grupo funcional esencial en la molecula del enzlma. Las experiencias cineticas se utillzan para distinguir entre los diversos tipos de inhibici6n reversible de los enzimas: las representaciones doble reciprocas son especialmente utiles para el analisls de estos datos cinettcos.

En las reacciones bisustrato de desplazamiento simple al azar, el enzima forma un complejo ternario con ambos sustratos, los cuales pueden adicionarse en cualquier orden. En las reacciones de desplazamiento simple ordenadas, existe una secuencia obligatoria en la adicion de los sustratos para formar el complejo ternario. En las reacciones de doble des. plazamiento, 0 plnq-ponq, un sustrato reacciona con el enzima y su correspondiente producto se libera antes de que se combine el otro sustrato.

Las experlenclas con enzimas se efectuan normalmente midiendo la velocidad inicial de la reaccion bajo condiciones en las que el enzima este saturado can el sustrato y el pH es optimo. La existencla de complejos enzima-sustratos y de compuestos covalentes se ha deducido de estudios cinetlcos, de experiencias de captacion, y de mediciones espectrofotometricas.

Bibliografia

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219

Enzimas

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