Вы находитесь на странице: 1из 6

Занятие №3

Тема: Морфология и физиология вирусов

Цель: получить общее представление о биологии вирусов: их месте среди живых


организмов, их своеобразной организации, структуре вирионов: изучить принципы
современной классификации вирусов, этапы взаимодействия вирусов с чувствительными
клетками, методы культивирования вирусов, показатели вирусной репродукции в клетках.
Быть знакомым с методами диагностики вирусных инфекций.
Основные особенности вирусов:
вирусы являются строгими внутриклеточными организмами. имеют доклеточный уровень
организации, имеют только одну нуклеиновую кислоту (ДНК или РНК), сложный тип
симметрии, обладают способностью к кристаллизации, имеют дизъюнктивный способ
размножения, отсутствием белоксинтезирующих систем и систем метаболизма энергии
Основные семейства, род, виды РНК-содержащих вирусов: пикорнавирусы: имеющие
одноцепочечную не фрагментированную позитивную РНК (вирус полиомиелита, вирус
гепатита А и др.); парамиксовирусы имеющие нефрагментированную негативную РНК и
транскриптазу; ортомиксовирусы имеющие одноцепочечную фрагментированную
негативную РНК и транскриптазу; реовирусы имеющие двухцепочечную
фрагментированную РНК и транскриптазу (ротавирусы); ретровирусы с двумя
идентичными нитями позитивной РНК и обратной транскриптазой)
1. Дельта с одноцепочечной кольцевой РНК и ему нужен помощник для размножения
- необходим вирус гепатита В. Это дефектный вирус.
2. пикорнавирусы: имеющие одноцепочечные, не фрагментирующие положительную
РНК (вирус полиомиелита, вирус гепатита А и т. Д.);
3. Парамиксовирусы, не имеющие фрагментирующей отрицательной РНК и
транскриптазы;
4. Ортомиксовирусы, имеющие одноцепочечную фрагментирующую отрицательную
РНК и транскриптазу;
5. Реовирусы, имеющие двухцепочечную фрагментирующую РНК и транскриптазу
(вирусы колеса);
6. Ретровирусы с двумя одинаковыми нитями положительной РНК.
7. Дельта-вирус с одноцепочечной кольцевой РНК и ему необходим помощник для
размножения - вирус гепатита B. Это дефектный вирус ДНК-содержащих вирусов
8. Папавовирусы – мелкие безоболочечные одноцепочечные ДНК-содержащие
вирусы.
9. Аденовирусы безоболочечные вирусы с линейной двунитевой ДНК.
10. Герпесвирусы, имеющие двухцепочечную линейную ДНК.
11. Гепадновирусы имеющие двухцепочечную кольцевую ДНК, ДНК- полимеразу и
концевой Е- антиген; вирусы оспы имеют двухцепочечную линейную ДНК ковалентно
замкнутыми концами ДНК.
Структура простых вирусов У просто устроенных вирусов нуклеиновая кислота
связана с белковой оболочкой, называемой капсидом. Капсид состоит из
повторяющихся капсомеров. Нуклеиновая кислота и капсид взаимодействуют друг с
другом и вместе называются нуклеокaпсидом.
У сложно устроенных вирусов капсид окружен липопротеиновой оболочкой –
суперкапсидом или пеплосом. Оболочка вируса является производной структурой от
мембран вирус-инфицированной клетки. На оболочке вируса расположены
гликопротеиновые шипы или суперкапсидные белки. Под оболочкой некоторых
вирусов находится М-белок.
Основные этапы репродукции вирусов в клетке:
1.Адсорбция вириона к чувствительной клетке. Эта стадия состоит из двух фаз:
неспецифическая, обусловленная ионным притяжением вириона к клетке. Вторая фаза
адсорбции вириона к клетке высоко специфическая. Белки вириона узнают на
поверхности клетки специфические клеточные рецепторы и взаимодействуют с ними.
2. Проникновение вирионов в клетку путем рецептор-зависимого эндоцитоза
(виропексиса) или слияния оболочки вируса с клеточной мембраной, или в результате
сочетания этих механизмов. Только вирусам, имеющим белки слияния характерен путь
слияния с оболочкой вируса (парамиксовирусы, ретровирусы, герпесвирусы).
3. Раздевание (депротеинизация) вириона. Первый этап раздевания вириона начинается в
процессе его проникновения в клетку путем слияния вирусных и клеточных мембран или
при выходе вириона из эндосомы в цитозоль. Для разных вирионов характерны свои
участки раздевания в клетке. Раздевается вирус полностью или до капсида, что защищает
его от клеточных протеаз.
4. Синтез вирусных компонентов: белков и нуклеиновых кислот, который разобщен в
пространстве и времени. Синтез осуществляется в разных частях клетки разобщенно -
дизъюнктивно. Вирусный геном кодирует в зараженной клетке синтез структурных и
неструктурных белков – обслуживающих внутриклеточную репродукцию вируса на
разных его этапах (ферменты синтеза ДНК или РНК-полимеразы, обеспечивающие
транскрипцию и репликацию вирусного генома, белки регуляторы, предшественники
вирусных белков и ферментов.
5. Репликация вирусных геномов - синтез нуклеиновых кислот приводит к накоплению в
клетке копий исходных вирусных геномов. Способ репликации НК зависит от типа НК
вируса, наличия полимераз и способности вируса индуцировать образования полимераз в
клетке. Механизм репликации отличается у вирусов, имеющих: 1) двунитиевую ДНК; 2)
однонитевую ДНК; 3) плюс-однонитевую РНК; 4) минус однонитевую РНК; 5)
двунитиевую РНК; 6) идентичные плюс-нитевые РНК (ретровирус).
6. Формирование вирусов. Вирионы формируются путем самосборки. составные части
транспортируются в места сборки- участки ядра или цитоплазмы клетки. Общие
принципы сборки вирусов: формирование вирусов с образованием промежуточных форм.
Сборка простых вирусов заключается во взаимодействии вирусных нуклеиновых кислот с
капсидными белками и в образовании нуклеокапсидов. У сложно устроенных вирусов
сначала формируются нуклеокапсиды, которые взаимодействуют с мембранами клеток,
включая в свой состав некоторые компоненты клетки хозяина, например, липиды и
углеводы.
7. Выход вирусов из клетки. Полный цикл репродукции завершается за 5-6 часов (вирус
гриппа) или суток (гепатовирус, вирус кори). Процесс репродукции вирусов
заканчивается выходом их из клетки, который происходит взрывным путем, почкованием
или экзоцитозом.
Методы культивирования вирусов
Типы культур клеток и тканей, используемых для культивирования вирусов, их
особенностей и методов получения их:
Клетки, полученные из различных органов и тканей человека, животных, птиц и других
биологических объектов, размножают вне организма на искусственных питательных
средах в специальной лабораторной посуде. Большое распространение получили
культуры клеток из эмбриональных и опухолевых клеток, обладающих, по сравнению с
нормальными клетками взрослого организма, более активной способностью к росту и
размножению.
При выращивании культур клеток необходимо выполнение ряда условий:
1) соблюдение правил асептики;
2) использование посуды из нейтрального стекла;
3) использование сложных по составу питательных сред;
4) добавление антибиотиков к питательной среде
5) соблюдение оптимальной температуры роста (36-38,5◦С) клеток.
В лабораторной практике чаще всего используются:
1) однослойные культуры клеток;
2) Суспензионные культуры клеток;
3) органные культуры;
4) первичные культуры (эмбриональные, опухолевые и нормальные клетки) которые
размножаются 5-10 пассажей;
5) перевиваемые или стабильные клетки, способные размножаться в условиях
лаборатории 10 лет;
6) полупереиваемые клетки, которые постепенно утрачивают свои свойства через 10-30
пассажей.
О репродукции вирусов в культуре тканей можно судить на основании цитопатогенного
действия (ЦПД) вирусов или цитопатического эффекта, образования внутриклеточных
включений, образование «бляшек», реакции гемадсорбции и гемагглютинации, “цветной”
реакции.

Микроскопия образцов с культурами чистых тканей и с культурами, содержащими ткани с


цитопатическим действием штамма вируса полиомиелита (вакцина). Учет результатов.

Нормальные клетки ЦПД


Методы определения в реакции нейтрализации вирусов на лабораторных животных,
иммуноферментного анализа и ПЦР-диагностики.
Методы определения вида и типа вирусов:
• Реакция нейтрализации (РН)
• Реакция гемагглютинации (РГА)
• Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)
• Метод иммунофлюоресценции (РИФ)
• Биологические модели для индикации и идентификации вирусов (мыши,
крысы, кролики, морские свинки)

Типы клеточных культур


Первичные Фибробласты эмбриона курицы,
фибробласты эмбриона человека, клетки
почки различных животных.
Первичные культуры получают из клеток
различных тканей путем их измельчения
и трипсинизации, используются
однократно.
Линии диплоидных клеток Пригодны к повторному
диспергированию и росту, как правило не
более 20 пассажей (теряют исходные
свойства).
Перевиваемые линии Способны к многократному
диспергированию и перевиванию, т.е. к
многократным пассажам. Наиболее
удобны в вирусологической работе линии
опухолевых клеток Hela, Hep.

Специальные питательные среды для культур клеток


Используются разнообразные синтетические вирусологические питательные среды
сложного состава, включающие большой набор различных факторов роста- среда 199,
раствор Хэнкса, гидролизат лактальбумина.
В среды добавляют стабилизаторы рН (Hepes), различные в видовом отношении
сыворотки крови (наиболее эффективной считают эмбриональную телячью сыворотку), L-
цистеин и L-глютамин.
В зависимости от функционального использования среды могут быть ростовые (с
большим содержанием сыворотки крови) — их используют для выращивания клеточных
культур до внесения вирусных проб,
и поддерживающие (с меньшим содержанием сыворотки или ее отсутствием) - для
содержания инфицированных вирусом клеточных культур.
Выявляемые проявления вирусной инфекции клеточных культур
1.Цитопатический эффект.
2.Выявление телец включений.
3. Выявление вирусов методом флюоресцирующих антител (МФА),
электронной микроскопией, авторадиографией.
4.Цветная проба. Обычный цвет используемых культуральных сред,
содержащих в качестве индикатора рН феноловый красный, при оптимальных
для клеток условиях культивирования (рН около 7,2)- красный. Размножение
клеток меняет рН и соответственно- цвет среды с красного на желтый за счет
смещения рН в кислую сторону. При размножении в клеточных культурах
вирусов происходит лизис клеток, изменения рН и цвета среды не происходит.
5.Выявление гемагглютинина вирусов- гемадсорбция, гемагглютинация.
6.Метод бляшек (бляшкообразования). В результате цитолитического действия
многих вирусов на клеточные культуры образуются зоны массовой гибели
клеток. Выявляют бляшки- вирусные “ клеточно- негативные” колонии.

Включения — скопление вирионов или отдельных их компонентов в


цитоплазме или ядре клеток, выявляемые под микроскопом при специальном
окрашивании. Вирус натуральной оспы образует цитоплазматические
включения - тельца Гварниери; вирусы герпеса и аденовирусы -
внутриядерные включения.

Бляшки, или “негативные” колонии — ограниченные участки разрушенных


вирусами клеток, культивируемых на питательной среде под агаровым
покрытием, видимые как светлые пятна на фоне окрашенных живых клеток.
Один вирион образует потомство в виде одной бляшки. “Негативные” колонии
разных вирусов отличаются по размеру, форме, поэтому метод бляшек
используют для дифференциации вирусов, а также для определения их
концентрации.

РГА (реакция гемагглютинации) основана на способности некоторых вирусов вызывать


агглютинацию (склеивание) эритроцитов за счет вирусных гликопротеиновых шипов –
гемагглютининов.

Реакция гемадсорбции — способность культур клеток, инфицированных вирусами,


адсорбировать на своей поверхности эритроциты.

Образцы, используемые при идентификации вирусных культур: спинномозговая


жидкость, кровь, мокрота.

Вам также может понравиться