Вы находитесь на странице: 1из 6

1

Занятие №6

Тема: Ферментативные свойства микроорганизмов

Цель: научится определять чистоту выделенной культуры, делать пересевы петлей, работать
стерильной пипеткой, учитывать результаты определения биохимических свойств бактерий на
средах «пестрого ряда» и биохимических панелях.
Основные вопросы, разбираемые на занятии:
1. Питание бактерий. Способы поступления питательных веществ в бактериальную клетку.
Активный и пассивный транспорт. Пермеазы.
2. Экзо – и эндоферменты.
3. Пластический и энергетический обмен. Амфиболизм.
4. Идентификация микроорганизмов и их внутривидовое типирование.
5. Способы изучения биохимических свойств бактерий: среды Гисса (пестрый ряд); система
индикаторных бумаг (СИБы); панели биохимической идентификации;
автоматизированные системы идентификации микроорганизмов.

Метаболизм бактериальных клеток - пути, по которым питательные вещества


попадают в бактериальные клетки (пассивная диффузия, облегченная диффузия, активный
транспорт).
Анаболизм: питательные вещества расщепляются и превращаются в сложные
структурные соединения из простых при этом расходуется энергия.
Катаболизм: энергетический обмен расщепление и окисление питательных веществ с
получением энергии и запасом ее в виде АТФ.
Амфиболизм: реакции метаболизма и катаболизма взаимосвязаны, их продукты
называются метаболитами. Переход одних реакций в другие называется амфиболизмом
(переход пластических продуктов в энергию или наоборот).
Экзоферменты: экзоферменты выделяются во внешнюю среду, подготавливают
питательные вещества для поступления в клетку, расщепляя макромолекулы питательных
субстратов до простых соединений, усваиваемых клеткой, в качестве источников энергии.
Некоторые экзоферменты (пенициллиназа) инактивируют антибиотики, выполняя
защитную функцию. Другие разрушают ткань и клетки, обусловливая широкое
распространение в инфицированных тканях микроорганизмов и их токсинов. Это
ферменты агрессии: гиалуронидаза, коллагеназа, дезоксирибонуклеаза, нейраминидаза,
лецитовителлаза. Их относят к факторам патогенности микроорганизма.
Эндоферменты: эндоферменты прочно связаны с клеткой, катализируют
внутриклеточный обмен. Катализируют метаболизм, проходящий внутри клетки. Это
окислительно-восстановительные ферменты, цитоплазматической мембраны,
участвующие в дыхании и делении клетки; ферменты, обеспечивающие питание клетки;
ферменты, связанные с делением и аутолизом клетки, обнаруживаются в клеточной
стенке.
Пермеазы: осуществляют активный транспорт питательных веществ в клетку.
Конститутивные ферменты: постоянно присутствуют в клетке (ферменты глюкозы,
дыхательные ферменты, необходимые для окислительно-восстановительных реакций).
Адаптивные ферменты: ферменты, концентрация которых зависит от присутствия в
окружающей среде того или иного субстрата. Это ферменты транспорта и катаболизма
лактозы.
2

Методы изучения биохимических свойств бактерий


1. Среды «пестрого ряда» (среда Гисса)
2. Индикаторные системы (индикаторные бумажные системы)
3. Панели биохимической идентификации
4. Системы автоматической идентификации

1. Среды «пестрого ряда» (среда Гисса)


Состав: пептонная вода + набор углеводов + индикатор (фуксин) + поплавок (для улавливания
газа). Метод позволяет выявить ферментативные свойства микроба. Принцип действия: при
ферментации углевода образующиеся кислые продукты меняют рН, при этом изменяется
окраска индикатора.
3
4

2. Индикаторные системы (индикаторные бумажные системы). Принцип метода: диски из


фильтровальной бумаги выдерживают в питательной среде (питательная среда + индикатор +
субстрат) высушены и упакованы во флаконы. В лаборатории после 18-24 часовой инкубации
учитывается изменение цвета диска.

3. Индикаторная панель.

Специфичные пластиковые панели, содержащие сухую питательную среду (питательная


среда + индикатор + субстрат). В лаборатории суспензия исследуемой культуры вносится в
5

лунки, затем инкубируется в течение 15-24 часов. Результат учитывается по изменению цвета
индикатора.

Определение биохимических свойств микроорганизмов

Основные биохимические свойства микроорганизмов:


сахаролитические (определение на средах Гисса), протеолитические (расщепление белка и
образование индола, сероводорода, мочевины и аммиака), окислительно-
восстановительные.
Протеолитические ферменты микробов – протеазы, катализирующие расщепление белка.
Для их выявления исследуемую культуру засевают в питательную среду, содержащую тот
или иной белок (желатин, свернутая лошадиная сыворотка, коагулированный яичный
белок, молоко и т.д.). При наличии протеолитических свойств питательная среда
разжижается.
Некоторые виды патогенных микробов с выраженной протеолитической активностью
обладают способностью расщеплять белок и пептон до продуктов глубокого распада:
индола, сероводорода, мочевины и аммиака. Определение индола: индол образуется при
расщеплении триптофана. После посева в пробирку вносят полоску индикаторной бумаги,
пропитанную раствором щавелевой кислоты, так, чтобы индикаторная бумага не касалась
питательной среды (прижимают пробкой); посев инкубируют 24-48 часов при
температуре 37 град. Образование индола определяют по окрашиванию нижнего конца
индикаторной бумажки в бледно-розовый цвет. Определение сероводорода (конечный
продукт расщепления аминокислот, содержащих серу – цистина, цистеина и метионина).
Петлю исследуемой культуры засевают в пробирку с МПБ. Тотчас после посева в
пробирку вносят пропитанную ацетатом свинца полоску индикаторной бумаги.
Образующийся в культуре сероводород вступает в соединение с бесцветным ацетатом
свинца и превращается в сульфат свинца, который придает индикаторной бумаге черно-
бурое окрашивание. Определение гидролиза мочевины: проводится на среде Гисса с
мочевиной и индикатором бромтимоловым синим. При наличии гидролиза происходит
защелачивание среды за счет образование аммиака, индикатор приобретает синий цвет.
Образование аммиака. Для определения способности к образованию аммиака проводят
посев в МПБ, и между его поверхностью и пробкой закрепляют полоску лакмусовой
бумаги. При положительном результате бумажка синеет.
Окислительно-восстановительные ферменты (связаны с дыхательной функцией
микроорганизма): тесты на каталазу и цитохромоксидазу.
Тест на каталазу. Каталаза— фермент, который катализирует разложение образующегося в
процессе биологического окисления токсичного пероксида водорода на воду и
молекулярный кислород. В пробирку вносят 4-5 капель 3% раствора перекиси водорода.
Стеклянной палочкой снимают с агара колонию и опускают в реактив. При
положительном результате появятся пузырьки газа.
6

Тест на цитохромоксидазу. Цитохром с-оксидаза (цитохромоксидаза), фермент класса


оксидоредуктаз. Функция цитохромоксидазы — восстановление кислорода с помощью
электронов цитохрома-с и транспорт протонов сквозь клеточную мембрану. Энергия,
полученная в этом процессе, используется для создания трансмембранного протонного
градиента. На чашку Петри с выросшей культурой наливают 1% раствор тетраметил-
парафенилендиамина гидрохлорида. Культура, обладающая оксидазой, окрашивается в
пурпурно-красный цвет.

Вам также может понравиться