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PHYSIQUE CELLULAIRE

Introduction à la Neurobiologie
-3-
L’amont du potentiel d’action: « l’input » neuronal

Jean-Pierre HENRY
18 Mars 2010
Résumé du cours précédent

• Le potentiel d’action est l’élément électrique de base:


– Il est « quantique »
– Il se propage sans affaiblissement
• Il est engendré à partir du potentiel de repos par
dépolarisation
• Cette dépolarisation induit une ouverture des canaux
Na+, suivie d’une ouverture de canaux K+, permettant
la régénération du potentiel de repos
• Ces canaux ont été purifiés et leur structure résolue à
l’échelle atomique
• Ils forment la famille des canaux dépendants du
potentiel (voltage-dependent), comprenant plus de
140 membres
Comment est « physiologiquement »
engendré un potentiel d’action?

Origine de la modulation du potentiel de repos


Comment est « physiologiquement »
engendré un potentiel d’action?
• Il y a modulation du potentiel de repos de l’extrémité
dendritique (potentiel synaptique)
• Cette modulation se fait sous l’influence d’un élément
« amont » qui représente « l’input »
• Cet amont peut être la terminaison axonale d’un
neurone: le neurone amont est présynaptique, l’aval
postsynaptique
• Cet amont peut aussi être un organe sensoriel
Les deux types « d’input »

Input sensoriel

Input synaptique
La transmission synaptique

La synapse chimique
La synapse chimique

• La terminaison axonale du neurone amont


libère une molécule:
neuromédiateur/neurotransmetteur
• L’espace entre les deux neurones (fente
synaptique) est petit: ≈ 50 nm
• La molécule se lie à un récepteur sur la
membrane du neurone aval (dendrite, corps
cellulaire)
• Le récepteur induit un changement du
potentiel de repos:
– Dépolarisation: synapse excitatrice
– Hyperpolarisation: synapse inhibitrice
Définition d’un neurotransmetteur

• C’est un composé présent dans le neurone pré


synaptique et synthétisé par lui
• Il est libéré au cours de la transmission
• Appliqué sur le neurone post synaptique à une
concentration équivalente, il produit les mêmes effets
que la stimulation électrique du neurone pré
synaptique
• Il existe des mécanismes physiologiques permettant
de l’extraire rapidement de le fente synaptique
Principaux neurotransmetteurs du
cerveau des mammifères
Neurotransmetteur Famille chimique Présence hors du
cerveau
Acétylcholine (Ach) Jonction
neuromusculaire
Dopamine (DA) Catécholamine

Noradrénaline (NA) Catécholamine Système sympathique

Sérotonine (5-HT) Indolamine Plaquettes


acide γ- Acide aminé
aminobutyrique
(GABA)
glycine Acide aminé Ubiquitaire

Acide glutamique Acide aminé Ubiquitaire


Neurotransmetteurs et communication cellulaire

• Certaines molécules ne fonctionnent que


comme neurotransmetteurs (Ach)
• Les acides aminés (Gly et Glu) sont des
composants des protéines
• Certaines monoamines (NA, Adrénaline)
fonctionnent comme des hormones: elles
sont libérées comme des neurotransmetteurs,
mais dans le flux sanguin, et les cellules
cibles, portant les mêmes récepteurs sont
eloignées
Peptides neuroactifs

Pour ces composés, les 4 critères ne sont généralement pas remplis; ils
peuvent co-libérés avec les neurotransmetteurs classiques
Les récepteurs ionotropes

« Ligand-gated channels »
Le récepteur de l’ACh de la jonction
neuromusculaire

• La fibre nerveuse est équivalente


à un neurone: elle a un potentiel
de repos (- 90 mV) et elle est
excitable
• On stimule le motoneurone et on
enregistre la différence de
potentiel au niveau de la
terminaison synaptique
Potentiel d’action dans la fibre musculaire

• La stimulation du nerf produit dans le muscle une


dépolarisation: Excitatory Post Synaptic Potential,
EPSP), jusqu’à - 20 mV
• Cette dépolarisation induit un potentiel d’action
(spike)
• Le curare inhibe le récepteur et l’EPSP n’atteint plus
le seuil
Nature des conductances ouvertes à une
synapse excitatrice

• On excite le corps cellulaire


du neurone amont
• On mesure le courant entrant
dans le neurone cible à
potentiel imposé (voltage-
clamp)
• On mesure aussi le potentiel
à courant imposé (current-
clamp)
Nature des conductances ouvertes à une
synapse excitatrice
• Pre: potentiel d’action du
neurone amont
• Le neurone est à son potentiel
de repos: - 55mV
• La stimulation produit à - 55 mV
un courant entrant (C2) et donc
une dépolarisation (C1)
• La dépolarisation n’amène pas
la cellule au potentiel d’équilibre
du Na+ 55 mV
• Le courant est nul à 0 mV
• Le récepteur est associé avec
une conductance cationique,
passant Na+ et K+
Le canal ionique associé avec le
récepteur à l’Ach, étude en patch-clamp

• L’étude est faite en conformation


cell-attached; la cellule est une
cellule musculaire (grenouille)
• L’enregistrement est fait à - 92
mV en présence de 100 nM
d’ACH
• On voit un canal osciller entre
deux états, ouvert (courant
entrant) et fermé
• La conductance élémentaire est
de 30 pS
Dépendance vis à vis du potentiel

• Le potentiel est varié depuis


+ 70 mV jusqu’à - 70 mV
• Comme la conductance
macroscopique, le courant
est nul à 0 mV
• On peut montrer que Na+ et
K+ ont des perméabilités
équivalentes
• Le canal est imperméable
aux anions
Canal unique et conductance macroscopique

• On soumet la cellule à un
pulse bref d’Ach (flèches),
comme c’est le cas dans
une stimulation du
motoneurone
• Les différents récepteurs
s’ouvrent de manière
synchrone (canal 1 à 6)
• Leur fermeture est aléatoire
• La somme des canaux
ouverts reproduit le courant
entrant macroscopique
Résumé
Synapse inhibitrice: les récepteurs au
GABA et à la glycine

• Le dispositif expérimental est celui décrit


pour la synapse excitatrice
• Une électrode est introduite dans la
cellule amont; elle permet de dépolariser
celle-ci et de créer un potentiel d’action
• Dans la cellule cible, on a 2 électrodes et
un montage current-clamp
• Au potentiel de repos (-55 mV), la
stimulation hyperpolarise légérement
• Le potentiel d’inversion (-60 mV) est le
potentiel de Nernst de Cl-
• Le ligand (GABA ou glycine) ouvre
une conductance Cl-
Comparaison des récepteurs ACh et GABA

• Le récepteur activé par


l’ACh (2 µM) de cellule
musculaire a son potentiel
d’inversion à 0 mV
• Le récepteur activé par le
GABA (5 µM) de neurone
de l’hippocampe de rat
s’inverse à - 60 mV
Principaux récepteurs ionotropes
Conclusions sur les récepteurs ionotropes

• Il existe des canaux ioniques activés par des ligands


(neurotransmetteurs) comme il existe des canaux
ioniques activés par le potentiel
• Dans le système nerveux central, les principaux
neurotransmetteurs excitateurs sont l’Ach et surtout
le Glutamate
• Les neurotransmetteurs inhibiteurs sont la glycine et
surtout le GABA
Données moléculaires sur les récepteurs
ionotropes

1. Le(s) récepteur(s) de l’Ach


2. Le(s) récepteur du Glutamate
Un système modèle: l’organe électrique
de la torpille

• L’organe électrique est équivalent à un muscle; ses cellules (électrocytes)


sont empilées et innervées sur une face
• A la stimulation nerveuse, décharges des cellules en série (50-100 V, 10 A)
Purification du récepteur de l’Ach de
torpille
• La purification a été faite à partir de
la face innervée de l’organe
électrique
• Protéine membranaire difficile à
purifiée
• Test: liaison de l’α-bungarotoxine,
un peptide du venin de serpents
• Première purification d’un récepteur
dans le laboratoire de Jean-Pierre
Changeux (1970)
• Premier clonage Shosaku Numa
(1983)
Organisation générale du récepteur AChR

• Le récepteur est un
hétéropentamère (α2βγδ)
• Les sous-unités sont
homologues et il existe
des homopentamères
• Chaque sous-unité a 4
segments trans-
membranaires
• Il y a 2 sites de liaison de
l’Ach, entre des sous-
unités
• Le canal est au centre
(Karlin A (2002) Nature Rev Neurosc,3, 103)
Sélectivité de l’AChR
• La cristallisation 3D et la résolution
atomique n’ont toujours pas été
réussies
• Des protéines bactériennes
voisines ont été cristallisées
• Les meilleures structures (4 Ä) ont
été obtenues par cristallisation 2D
et microscopie électronique
• Dans cette représentation, le rouge
indique les charges négatives et le
bleu les positives
• Cette distribution électrostatique
explique la sélectivité cationique

(Unwin N (2005) J Mol Biol,346, 967)


Mécanisme de l’ouverture: le AChR, une
protéine allostérique
• Allostérie: théorie proposée en
1964 par Monod, Wyman et
Changeux pour expliquer
l’action sur une enzyme d’une
molécule étrangère (ni
substrat, ni produit)
• La protéine est un oligomère
• Elle existe en différentes
conformations
• Le ligand allostérique I fait
passer la protéine d’une
conformation à une autre
Mécanisme de l’ouverture: le AChR, une
protéine allostérique

• Structure modélisée d’un


AChR homopentamérique
• 5 sites de liaison identiques
entre les parties extra-
cellulaires des sous-unités
• A- une sous-unité; B-partie
extra-cellulaire (2 sous-
unités); C- protéine entière
de face; D- de profil,
extérieur en haut

(Taly et al (2009) Nature Drug Discov Rev,8, 733)


Mécanisme de l’ouverture: le AChR, une
protéine allostérique

• Le AChR est une protéine avec 2 conformations (ouverte et


fermée)
• Les agonistes (Ach, Nicotine) stabilisent la conformation ouverte
• Les molécules qui stabilisent la conformation fermée
(bungarotoxine) sans entrer dans le canal sont des antagonistes
• Le curare bloque directement le canal
Les récepteurs ionotropes du glutamate

Propriétés et structure
Propriétés des GluR

• Les GluR sont les principaux récepteurs des synapses


activatrices du cerveau
• Activés, ils laissent passer les cations (Na+,K+,Ca2+)
• Trop de glutamate tue: l’excitotoxicité (ischémie cérébrale): une
entrée massive de Ca2+ par les GluR induit une mort cellulaire
• Le patch-clamp a montré l’existence de 3 familles de GluR,
chacune caractérisée par sa pharmacologie (ligands non
physiologiques ouvrant le canal par liaison au site du Glu) et sa
cinétique
• Les 3 familles comportent plusieurs membres
• Les GluR sont des tétramères (homo ou hétéro); toutes les
sous-unités sont apparentées (gènes différents, mais
homologues); environ (5 à 600 acides aminés)
Le « scoop »: structure atomique de GluR

(Sobolevsky et al (Dec2009) Nature,462, 745)


Structure GluR: 4 sous-unités identiques
• Le GluR cristallisé est un homo-
tétramère
• Chaque sous-unité est composée
de 3 domaines
• Le domaine transmembranaire
(TMD) est dans la membrane et
son assemblage forme le canal
ionique
• Dans l’espace extra-cellulaire se
trouve d’abord le domaine liant le
ligand (glutamate) LBD
• Puis le domaine amino-terminal
(ATD)
La liaison du ligand module l’activité du canal

• Le domaine de liaison du ligand (LBD) comporte une poche


(clamshell) accueuillant le ligand
• En présence du ligand, il y a un changement de conformation
qui ouvre le canal
(Madden DR, 2002, Nature Rev Neurosc, 3, 91)
L’ouverture du canal

• La protéine est un
tétramère; les sous-unités
sont assemblées par des
interactions au niveau des
domaines ATD et LBD
• La liaison du glutamate sur
le domaine LBD est
transmise au domaine TM
(canal)
• Protéine allostérique

(Jin R et al (2009) EMBO J,28, 1812°


Le canal de GluR est semblable à un canal K+

• On a superposé la
structure du canal de GluR
(fermé) en bleu sur celle
d’un canal K+ fermé dont a
enlevé le filtre de sélectivité
(en gris)
• En a, vue en coupe dans la
membrane, en b, vue
depuis le milieu extra-
cellulaire, en c, hélices
internes
GluR, une organisation originale des sous-unités

• Les 4 sous-unités sont


associées en 2 dimères
• En a, vue en coupe
• En b, vue en face au niveau
ATD: on a un dimère A-B et
un autre C-D
• En c, au niveau LBD, on a
maintenant des dimères A-D
et B-C
• En d, au niveau du canal,
symétrie d’ordre 4
Transmission du changement de
conformation depuis LBD jusqu’à TM

• On voit en coupe 2 domaines LBD et les TM correspondants


• Les hélices (cylindres) de LBD en violet correspondent à la
conformation fermée du canal; en vert, déplacement induit par
le glutamate: on tire sur les hélices M3, ce qui ouvre le canal
Les récepteurs métabotropes

La notion de second messager


la signalisation
Notions générales

• Nous n’avons pas parlé des récepteurs à certains


neurotransmetteurs (monoamines, peptides)
• Pour la majorité, les récepteurs correspondants ne
sont pas associés directement avec des canaux
• Pendant leur activation (liaison du ligand), ces
récepteurs changent de conformation
• Ce changement est perçu par une protéine
intracellulaire (protéine G), qui le transmet à une
protéine effectrice
• Celle-ci va affecter (souvent indirectement) un canal
ionique, qui va modifier le potentiel synaptique local
Exemple de cascade de signalisation
• Le récepteur de la sérotonine
est activé par son ligand
• Il transmet son activation à la
protéine G sur la face
intérieure de la membrane
• A son tour, celle-ci active une
enzyme, l’adénylate cyclase
• Son produit, l’AMP cyclique,
active une protéine kinase
• Cette dernière phosphoryle
un canal K+
• Le canal se ferme et induit
une dépolarisation

Kinase: enzyme qui introduit un groupe phosphate dans une protéine


Caractérisation biochimique des récepteurs
métabotropes et des protéines G
• Ces récepteurs sont des
protéines traversant la
membrane 7 fois
• C’est une très grande famille
(plus de 700 membres), cible
de la majorité des drogues
• Elle n’est pas limitée au
système nerveux
• Les protéines G sont
faiblement liées à la
membrane
• Il en existe plusieurs dizaines
• Elles sont trimériques
• La sous-unité α lie le GTP ou
(Alberts et al, Molec Biol Cell) le GDP
Effet de l’activation du récepteur

• L’activation du récepteur
entraîne un changement de
conformation
• La protéine G diffuse sur la
membrane: sa rencontre
avec le récepteur induit un
changement de conformation
• Celui-ci permet la liaison du
GTP, qui induit une
dissociation des sous-unités
• la sous-unité α liée au GTP
peut activer d’autres
protéines
Vue plus générale de la signalisation:
l’horreur de la biologie

• Un même récepteur peut


activer différentes
protéines G, qui peuvent
avoir des effets différents
• Il faut arrêter l’activation du
système: phosphorylation
du récepteur, hydrolyse du
GTP par la sous-unité α
elle-même

(Rosenbaum et al (2009) Nature,459, 356)


Nouveaux « scoops »: structures de
récepteurs à 7 hélices

• Structure du récepteur β1-adrénergique de dinde


• Passage de l’organisation postulée à la structure
3D atomique
• Depuis 2007, trois structures ont été décrites qui
s’ajoutent à la rhodopsine
(Warne et al (2008) Nature, 454, 486)
Les changements de conformation liés à
l’activation

• Changement de
position des hélices
trans-membranaires TM
6 et 7 lors de l’activation
du récepteur β2-
adrénergique
• Le ligand est figuré en
vert clair; la forme
activée est en gris

(Bokoch et al (2010) Nature, 463, 108)


Activation « sensorielle »

Récepteurs olfactifs
Récepteurs visuels
Récepteurs olfactifs

• Sur les neurones, il y a


de multiples récepteurs
à 7 hélices
• Leur activation par un
odorant active une
protéine G, puis une
AMP-cyclase
• L’AMPc formé ouvre un
canal cationique
• L’entrée de Na+ permet
la dépolarisation et le
potentiel d’action
Récepteur visuel
(d’après S Picaud, INSERM U592, Institut de la vision)

• Les récepteurs visuels (bâtonnet et cônes) tapissent


le fond de l’œil
• De manière surprenante, les neurones sensoriels
sont devant les récepteurs
• Les récepteurs et les neurones sensoriels forment 3
couches bien identifiables
Organisation des récepteurs

Segment externe: disques

Segment interne:
mitochondries Lys296

Noyau

Terminaison
synaptique

• Les récepteurs (bâtonnets) sont photosensibles sur le


segment externe: augmentation de la surface, disques
• La membrane des disques à une protéine majoritaire, la
rhodopsine, de la famille des récepteurs à 7 hélices
• Un pigment, le rétinaldehyde, est lié à la lysine 296
Effet de la lumière sur les récepteurs

• Le précurseur du
rétinaldéhyde est la vitamine
1 7 11 15

2 6 8
9
10 12
13
14
CH 2OH • Le rétinaldéhyde est lié par
3
une base de Schiff sur une
4
5
All-trans-retinol (vitamin A) lysine
1 7 11 15
• A l’obscurité, il est sous la
2 9 13
CHO forme 11-cis
6 8 10 12 14

3
5
• A la lumière, il s’isomérise
4 All-trans-retinaldehyde en trans
1 7 11
• Ce changement induit un
2 6 8
9
10
12 changement de
3
5
13 conformation de la protéine
14
4
15
• La structure atomique des 2
11-cis-retinaldehyde CHO
conformations a été résolue
récemment
Surprise: pas de potentiel d’action dans
les récepteurs
• L’illumination du récepteur ne
produit pas un potentiel d’action
dans les cellules réceptrices
• Ces cellules sont « dépolarisées »
à l’obscurité (- 30 mV)
• A la lumière, elles se polarisent à
- 70 mV
• Ce n’est que deux cellules plus
loin (neurones ganglionnaires) qu’
apparaît un potentiel d’action
• Ce potentiel d’action transmet
l’information au cerveau
La cascade de signalisation visuelle

• La rhodopsine activée
active une protéine G, la
transducine
• La sous-unité α, liée au
GTP, active une
phosphodiestérase qui
clive le GMP cyclique
• Le cGMP est requis par un
canal cationique; son
hydrolyse ferme le canal
• Cette fermeture polarise la
cellule
Le comportement paradoxal des
récepteurs rétiniens

• A l’obscurité, la rhodopsine
inactive conduit à une
ouverture de canaux Na+ et à
une libération forte de
neurotransmetteur
• La lumière ferme ces canaux
et hyperpolarise la cellule
• La libération de
neurotransmetteur est
inhibée
Les récepteurs visuels, un exemple « bizarre »

• L’entrée du signal ne produit pas un signal positif,


mais l’inhibition d’un signal positif
• C’est une solution coûteuse: la dépolarisation à
l’obscurité tend à diminuer le gradient ionique, d’où
une dépense énergétique (ATP, oxygène)
• La transduction visuelle est lente
• La cascade amplifie énormément le signal:
– Une rhodopsine activée peut activer plusieurs transducines
(protéine G)
– Une phosphodiestérase hydrolyse de nombreux cGMP
La cascade est un amplificateur

Une molécule de rhodopsine


absorbe un photon 105 molécules de cGMP sont
hydrolysées

500 molécules de transducine


sont activées
250 canaux Na+ sont fermés

500 molécules de phosphodiestérase sont


activées
106 ions Na+/s ne rentrent pas
dans la cellule

La membrane s’hyperpolarise de 1 mV
(d’après Alberts, Molec Biol Cell)
Pour terminer: une idée folle

• A partir d’une algue verte,


une protéine, « channel
rhodopsine-2 » a été isolée
• C’est un canal cationique
associé avec le cis-rétinal
• L’illumination ouvre le canal
• Pourquoi ne pas exprimer
cette protéine dans les
neurones ganglionnaires,
capables de potentiel
d’action?
Expression de channel rhodopsin-2 dans
des rétines sans récepteurs

• La protéine est couplée à la GFP: les cellules vertes


expriment ChR2; l’expérience est faite sur des rétines de
souris sans récepteurs
• On mesure le courant et le potentiel dans ces cellules, à
différentes illuminations
• Des potentiels d’actions sont visibles (fig E)
(Bi et al (2006) Neuron, 50, 23)
Message final

• Les potentiels d’actions sont engendrés après une


modification du potentiel de repos synaptique
• Celle-ci peut être produite par une entrée sensorielle
ou un neurotransmetteur
• Les récepteurs aux neurotransmetteurs peuvent
ouvrir directement un canal ionique ou être couplés
par des seconds messagers
• Dans ce second cas, le couplage est plus lent, mais il
permet des effets beaucoup plus diversifiés
• Il peut aussi y avoir une amplification importante

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