ISOENZIMAS

CONCEPTO DE ISOENZIMAS
Las isoenzimas (isozimas) son distintas formas moleculares de una enzima. Catalizan la misma
reacción, pero sus propiedades cinéticas (Vmax y Km), físico-químicas e inmunológicas son diferentes.
Generalmente están constituidas por mezclas de diferentes clases de cadenas polipeptídicas
íntimamente asociadas.
Una forma de regulación metabólica muy importante que tienen los organismos es a través de la
utilización de las isoenzimas. La distribución de las mismas puede variar de un tejido a otro, por
ejemplo la piruvato kinasa de mamífero, que cataliza el tercer paso limitante en la glucólisis, tiene dos
isoformas: la hepática (L) y la muscular (M). Las propiedades catalíticas de la isoforma L son
reguladas negativamente por la acción de distintas hormonas, como por ejemplo el glucagón, mientras
que la forma M no lo es, así cuando el requerimiento de glucosa por el resto del organismo es grande,
la glucólisis en el hígado se detiene rápidamente. En algunos casos hay simultáneamente isoenzimas
diferentes dentro de una misma célula, por ejemplo las malato-deshidrogenasas de mitocondria y de
citosol. En otros casos se cambia de una isoenzima a otra con el paso del tiempo, así algunas enzimas
de la glucólisis en el feto son diferentes de las mismas enzimas en el adulto. Es interesante destacar que
en células de ciertos tumores cancerosos aparecen de nuevo formas fetales de determinadas enzimas.
El estudio de las isoenzimas ha tomado mucho auge en los últimos tiempos, debido a que el
aumento de algunas de ellas en sangre periférica (LDH, creatinfosfoquinasa y fosfatasa alcalina) ha
sido aplicado al diagnóstico y pronóstico de ciertas enfermedades

ISOENZIMAS DE LA LACTATO DESHIDROGENASA

Nombre sistémico: L-lactato:NAD+ oxidoreductasa (código: 1.1.1.27)

La LDH cataliza la siguiente reacción:

Piruvato + NADH + H+ L-lactato + NAD+

En determinadas condiciones de concentraciones y tiempo la cantidad de piruvato transformado

en lactato es directamente proporcional a la actividad de LDH.
La enzima no tiene especificidad estricta por el sustrato pues puede actuar sobre otros α-ceto o
α-hidroxiácidos estructuralmente similares al pirúvico (por ejemplo sobre el α-cetobutírico). Tampoco
es estricta su especificidad por la coenzima, pues puede utilizar también el NADPH, aunque las
velocidades de reacción son mucho menores.
A pH 7,3 - 7,8 el equilibrio de la reacción está desplazado hacia el lactato, pero a pH más
alcalino (pH 8,5 - 10,0) el equilibrio se desplaza hacia el piruvato; entonces, la reacción puede ocurrir
en cualquiera de los dos sentidos, dependiendo del pH y de la concentración de los sustratos que se
encuentren presentes.
La LDH es una enzima que abunda en hígado, músculo esquelético y eritrocitos; también se
encuentra en menor cantidad en corazón, riñón y aún menos en páncreas y pulmón.
Existen dos genes que codifican dos polipéptidos diferentes: M (Muscle, músculo) y H (Heart,
corazón). Estos monómeros se combinan formando los tetrámeros activos (PM 134.000). Se han

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podido separar por electroforesis nativa en geles de poliacrilamida 5 isoenzimas de LDH las cuales
están conformadas como se muestra en el siguiente esquema:

% de la LDH total (suero normal)

H-H
H-H ó H4 LDH1 23,4 ± 3

H-H
H-M ó H3M LDH2 44,0 ± 4

H-H
M-M ó H2M2 LDH3 25,0 ± 1,5

H-M
M-M ó HM3 LDH4 6,0 ± 2

M-M
M-M ó M4 LDH5 2,0 ± 1

Como las isoenzimas LDH1 y LDH5 tienen una conformación proteica diferente, cada una presenta
propiedades distintas. Tienen diferente estabilidad a la desnaturalización por temperatura (LDH1 es
estable a 65oC por 30 min y LDH5 es lábil al calor y al frío) y diferente resistencia a varios agentes
químicos inhibidores. También difieren en su movilidad electroforética: LDH1 es de migración rápida y
LDH5 es la más lenta, mientras que LDH2, LDH3 y LDH4 tienen migraciones intermedias, como se
muestra en la Figura 1.

Lugar de siembra

Suero Normal

LDH 1 LDH2 LDH3 LDH4 LDH5

(+) (-)

Figura 1: Perfil electroforético realizado en condiciones nativas revelado por actividad enzimática.

Las isoenzimas de la LDH tienen diferente afinidad por los sustratos (especialmente por el piruvato) y
coenzimas. Por ejemplo la LDH1 tiene un Km elevado para el piruvato, la Vmax a la cual lo reduce es
baja y además resulta inhibida por un exceso de éste, mientras que LDH5 tiene un Km muy bajo para el
mismo sustrato y la Vmax a la cual lo reduce es elevada. Las otras isoenzimas tienen propiedades
intermedias entre las LDH1 y LDH5 y se parecerán más a una o a otra dependiendo de que tengan
mayor proporción de monómero H o M. Estas características cinéticas son muy importantes pues se
relacionan con la función metabólica que estas isoenzimas cumplen en los diferentes tejidos. Es de
interés el hecho de que la proporción de las diversas isoenzimas de LDH varíe de un tejido a otro, y por
lo tanto los perfiles electroforéticos de las isoenzimas de la LDH de distintas fuentes son diferentes. En
los órganos con alto consumo de oxígeno y pequeña resistencia a la anoxia (músculo cardíaco y

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cerebro) y en eritrocitos, predominan las isoenzimas LDH1 y LDH2, mientras que en otros órganos con
mayor reserva de glucógeno (hígado y músculo esquelético), hay preponderancia de las LDH4 y LDH5,
indicando su adaptación a un determinado tipo de metabolismo energético (Figura 2).
En mamíferos en estado de reposo, el tipo de sustancia y la proporción que utiliza cada órgano
como fuente de combustible es variable. Tanto el cerebro como los eritrocitos dependen
exclusivamente de la glucosa sanguínea, mientras que el corazón obtiene el 70% de su energía a partir
de los ácidos grasos y el 30% restante la aportan cuerpos cetónicos, glucosa sanguínea y también el
lactato (participación de las LDH1 y LDH2). El músculo esquelético y el hígado obtienen el 90% de su
energía a partir de los ácidos grasos, por mecanismos enzimáticos independientes de las LDHs.
Durante una actividad física intensa, el cerebro consume aproximadamente la misma cantidad
de glucosa y oxígeno que en estado de reposo mientras que el requerimiento energético del músculo
esquelético y el corazón aumenta
M ú s c u l o e s q u e l é t i c o
considerablemente. En los dos
A c e t i l - C o A
primeros minutos de esta actividad el G l u c ó g e n o C i c l o d e l o s á c i d o s
t r i c a r b o x í l i c o s
miocardio obtiene esa energía a partir A D PA T P
G l u c o s a P i r u v a t o
de glucosa tanto sanguínea como de N A D H
DN A D H
+
N A C a d e n a r e s p i r a t o
+
sus propias reservas de glucógeno, y N A D
L D 5 H
L a c t a t o O H O
aunque el consumo de oxígeno 2 2

aumenta unas cuatro veces, un 50%

G l u c ó g e n o
del piruvato formado se convierte en H í g a d o
G l u c o s a
lactato (participación de la LDH1 y A D P

LDH2), Este cambio metabólico A T P

N A D P H i r u v a t o
C I C L O D E C O R I
temporal le permite al corazón N A+ D

obtener la energía necesaria hasta L D5 H

L a c t a t o
que adapte su metabolismo para
lograr un incremento en el consumo
de ácidos grasos. El músculo
F i g u r a 2
esquelético utiliza (en los primeros
segundos) la energía almacenada como creatinafosfato hasta que se activa la degradación del
glucógeno muscular para aportar glucosa como fuente de energía. Aunque en este tejido durante una
actividad intensa el consumo de oxígeno aumenta unas veinte veces, gran parte del piruvato formado se
convierte en lactato (participación de la LDH5 y LDH4). Este cambio metabólico le permite a este
órgano obtener energía extra utilizando la glucólisis anaeróbica. El pasaje de piruvato a lactato es una
vía de recuperación de NAD+ para que la glucólisis continúe. La mayor parte del lactato formado en
esta etapa es recuperado lentamente y reconvertido a glucosa en el hígado mediante un proceso que
requiere el aporte de energía (ver Figura 2). Aquí la oxidación de lactato a piruvato (participación de la
LDH5 y LDH4) es favorecida por la baja relación NADH/NAD+ y la casi inexistencia de piruvato
intracelular. El corazón también puede consumir parte del lactato producido por el músculo
esquelético, favorecido por la cinética de sus isoenzimas.
La LDH se localiza en el citoplasma de las células de los distintos órganos y por lo tanto cuando
se produce un daño celular es fácilmente liberada al medio, desde donde pasa al plasma, alterando la
cantidad y relación de las isoenzimas de LDH presentes en la sangre. La mayor parte de la LDH del
suero normal proviene de la degradación fisiológica de los eritrocitos y plaquetas.

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 Las determinaciones de las isoenzimas de LDH ayudan al diagnóstico y pronóstico de algunas
patologías. Así por ejemplo, analizando las isoenzimas por electroforesis es posible diferenciar una
hepatopatía de un infarto de miocardio, cosa que no puede hacerse midiendo LDH total por su
inespecificidad diagnóstica. En un suero normal hay una relación:
LDH1 (25%)
—————— ≈ 0,5
LDH2 (50%)
mientras que en un infarto de miocardio, en las primeras 24 horas, la relación LDH1/LDH2 se va
acercando a la unidad por aumento de la LDH1, sin que la actividad de LDH total aumente
significativamente. Luego, cuando el enfermo evoluciona satisfactoriamente, esta relación tiende a
volver a la normalidad. Un aumento en el valor de esa relación durante la convalecencia, indica un
reinfarto.
La aparición o el aumento de LDH5 en el suero está indicando un compromiso hepático, o un
daño en el músculo esquelético. En los infartos pulmonares está elevada la LDH3 dando valores
similares a la LDH2, con disminución de LDH1.

PARTE EXPERIMENTAL

 OBJETIVOS DEL PRÁCTICO

En extractos de diferentes tejidos de rata, se medirá la actividad de LDH total por métodos
espectrofotométricos. Se determinarán además las proteínas de las muestras para expresar las
actividades como actividades específicas de cada extracto.

 OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS DE TEJIDOS

Los extractos de los diferentes órganos de rata (hígado, corazón, cerebro, músculo esquelético,
riñón y pulmón) serán preparados en buffer Tris-HCl 80 mM (pH 8), utilizando una relación de
volumen del buffer/peso del tejido de 10/1. El tejido será homogeneizado a alta velocidad en frío, y
luego la suspensión será centrifugada a 8.500 X g durante 10 minutos a 4oC. El sobrenadante,
enriquecido en la fracción citosólica de la célula, será alicuotado y guardado a -20oC hasta el momento
de su utilización.

 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS DE LOS EXTRACTOS DE TEJIDO

Para la determinación de las proteínas se utilizará la técnica de Bradford, un método colorimétrico
de valoración cuantitativa de las proteínas. A la muestra se añade un reactivo que forma un complejo
coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas,
según la ley de Lambert-Beer. Este es un método rápido, sensible, relativamente barato y específico.
Fundamento:
Se basa en el uso de un colorante, el Coomassie Blue Brilliant G-250, que en medio ácido reacciona
con las proteínas dando un color azulado.

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 Mediante estudios de espectrofotometría, se pudo comprobar que el colorante presenta tres especies
activas que poseen distintos espectros de absorción. Estas especies son dependientes del pH y se
interrrelacionan mediante el siguiente equilibrio:

Anión Neutro Catión

(595 nm) (650 nm) (470 nm)
Azul Verde Rojo

O sea que a medida que se va protonando la forma aniónica, generando las formas neutra y
catiónica, cambia el espectro de absorción del colorante.
La especie que posee capacidad de unirse a las proteínas es la aniónica, por lo tanto el equilibrio
mostrado arriba se desplaza hacia la izquierda a medida que se va formando el complejo anión-
proteína.
Especificidad:
La especificidad del método ha sido demostrada por la ausencia de respuesta a una amplia gama de
compuestos incluyendo aquellos con nitrógeno en sus moléculas.
Compuestos como el ácido policitidílico, poliadenílico, poliguanílico, adenina, cafeína, etc. dieron
menos de 0,01 unidades de absorbancia (U.A.)
También se ensayaron aminoácidos libres como ser arginina, lisina, triptofano, alanina, glicina y
ácido aspártico, nodando ninguno de ellos color significativo (0,006 U.A.)
Los requerimientos estructurales que permiten la unión del colorante a las proteínas están todavía
siendo estudiados, pero las últimas evidencias muestran que una proteína debe tener un peso molecular
alto (por lo menos tres veces el del colorante), y grupos funcionales básicos y aromáticos. Al igual que
para todos los otros métodos de dosaje de proteínas, excepto el de Kjeldalh, ésta es la principal
desventaja.
Como interferente se pueden citar al SDS y ciertos flavonoides.
Curva Patrón (Standard)
Reactivos:
1) Solución patrón: se preparara una solución de albúmina 0,1 mg/ml
2) Reactivo para desarrollar color:
Coomassie Blue Brilliant G-250.....................60 mg
Ácido perclórico 3%........................................1 Litro
Se disuelve el CBBG-250 en 50 ml de etanol y se lleva a 1 litro con ácido perclórico al 3%, se deja
reposar 2 horas por lo menos y se ajusta la absorbancia hasta 1,3-1,5 a 495 nm con agua
Protocolo

Tubo Albúmina H2O Reactivo Abs 595 nm

B - 1,0 ml 1 ml
1 0,1 ml 0,9 ml “
2 0,2 ml 0,8 ml “
3 0,3 ml 0,7 ml “
4 0,4 ml 0,6 ml “
5 0,5 ml 0,5 ml “
muestra 0,1 ml 0,9 ml “

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Se calcula la concentración final en mg/ml de las soluciones patrones preparadas y se mide absorbancia
a 595 nm de las mismas. Se grafica la curva de calibración.
Se calcula la concentración de proteínas presentes en los extractos mediante la siguiente fórmula:

Abs750nm Vreaccion 1  mg 
concentración _ proteína = × × =
m Valicuota dil  ml 

donde “m” es la pendiente de la recta y “dil” la dilución del extracto de órgano empleada.

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LDH TOTAL

La actividad de la enzima será determinada de dos maneras:

a) Siguiendo la oxidación del cofactor NADH (cambio de absorbancia a 340 nm).
b) Siguiendo la reducción de una sal de tetrazolio, acoplada a la reacción enzimática (cambio de
absorbancia a 570 nm).

a) -Determinación de la actividad LDH en base a la oxidación del NADH

Fundamento:
Se basa en la diferencia entre los espectros de
absorción del NAD+ ó NADP+ (oxidados) y el NADH Abs.
+
NAD
ó NADPH (reducidos). Como se muestra en la Figura
3, la forma reducida absorbe entre 320 y 380 nm, con
un máximo a 340 nm, mientras que la forma oxidada
no absorbe en esta zona. Se mide la variación de NADH

absorbancia a 340 nm o a 366 nm (dependiendo del

espectrofotómetro con que se cuente) durante el curso 250 300 350 400

Longitud de onda (nm)

de la reacción enzimática. Habrá un incremento de la
Figura 3
absorbancia si la reacción transcurre en el sentido:
NAD+——› NADH
o una disminución si transcurre en el sentido:
NADH ——› NAD+
En el práctico se medirá la actividad de la LDH en el sentido de la formación de NAD +
(disminución de la absorbancia a 340 ó 366 nm).

Reactivos:
Se utilizará un equipo de reactivos que incluye:
- Buffer fosfato 50 mM (pH 7,5), conteniendo piruvato 0,6 mM.
- Un vial conteniendo NADH desecado
Reactivo de trabajo: Disolver el contenido del vial en 3 ml del buffer (estable 24 h a 4oC)

Técnica:
En un tubo de lectura de espectrofotómetro colocar:
1 ml de reactivo de trabajo
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Termostatizar en un baño a la temperatura en que se medirá la reacción (puede ser 25 oC, 30oC ó 37oC,
dependiendo del baño termostatizado disponible). Luego agregar:
30 µl muestra
Mezclar y disparar el cronómetro, leer inmediatamente la absorbancia de partida (aproximadamente 1
si se lee a 340 nm ó 0,3 si se lee a 366 nm - esto está dado por la cantidad de NADH) y medir luego la
absorbancia cada 30 segundos durante 4 minutos. Graficar absorbancia en función del tiempo. En el
rango de la curva en que la disminución de la absorbancia es directamente proporcional al tiempo
[velocidad inicial (vo)], determinar la disminución de absorbancia/minuto (∆A).

Advertencias:
1) Después de cierto tiempo, la cinética de la reacción ya no es lineal, por eso la lectura de la
absorbancia debe ser efectuada lo más rápidamente posible después de la adición de la muestra, y
seguirse durante 3 - 4 min. como máximo.
2) Si la velocidad de descenso de la absorbancia es mayor de 0,10 por minuto, diluir la muestra 1/5 o
1/10 con solución fisiológica y repetir el ensayo, para poder trabajar en la zona lineal de la reacción
(vo). Hay que recordar que el valor obtenido en estos casos deberá ser multiplicado por 5 o por 10
según la dilución que se haya realizado, para informar el valor correcto de la actividad enzimática.

b) - Determinación de la actividad LDH en base a la reducción de una sal de tetrazolio acoplada a

la reacción enzimática

Fundamento:
La reacción se mide en el sentido de la oxidación del ácido láctico y reducción del NAD+. El
NADH formado reduce a la sal de tetrazolio (MTT) a un formazán coloreado soluble que absorbe a 570
nm. El transporte de electrones desde el NADH al MTT es mediado por el PMS (phenazine
metasulphate):

LDH
Lactato + NAD+ ——————› Piruvato + NADH + H+
NADH + PMSox ——————› NAD+ + PMSred
PMSred + MTTox ——————› PMSox + MTTred (violeta de formazán)

En condiciones adecuadas (vo) la formación del formazán coloreado será directamente

proporcional a la actividad de LDH. Se lee la absorbancia del formazán a 570 nm en función del
tiempo.

Reactivos:
Buffer Tris-HCl (80 mM - pH 8):
9,69 g de Tris, se disuelven en 300 ml de agua destilada, se ajusta el pH con ácido clorhidrico 1 N y se
completa a 1 litro con agua destilada.
Solución de L-lactato (10 mM):

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144 mg de L-lactato se disuelven en 15 ml de agua destilada
Solución de NAD+:
1 mg de NAD+ se disuelve en 1 ml de buffer (guardar refrigerado).
MTT (Dimetiltiazolyl difenyltetrazolium):
9 mg de MTT se disuelven en 15 ml de agua destilada (guardar al abrigo de la luz).
PMS (Phenazine metasulphate):
18 mg de PMS se disuelven en 15 ml de agua destilada (guardar al abrigo de la luz).

Técnica :
En dos tubos de lectura de espectrofotómetro rotulados como blanco (B) y muestra (M) colocar:
Reactivos Blanco Muestra
1- Buffer Tris 0,66ml 0,63 ml
2- NAD+ 0,033 ml 0,033 ml
3 - Muestra --- 0,03 ml
4 - MTT 0,1 ml 0,1 ml
5 - PMS 0,1 ml 0,1 ml
Preincubar a 30oC durante unos 5 minutos y luego agregar
6 - L-lactato 0,1 ml 0,1 ml
Cada minuto se lee la absorbancia a 570 nm, contra el blanco, manteniendo los tubos incubados a
30oC. Las lecturas se realizan hasta que la reacción deje de estar en v o. El blanco varía con el pH,
temperatura y tiempo de incubación. Se calcula luego la variación media de absorbancia/min (∆A) en
el rango de vo.

 CALCULO DE LOS RESULTADOS

Generalmente a la actividad de una enzima se la expresa en Unidades Intenacionales (UI) y se la refiere
a la cantidad de muestra que la contiene. Una UI es la cantidad de enzima capaz de transformar un
micromol (µmol) de sustrato por minuto.
Con los valores de ∆A medidos a cada intervalo de tiempo y el coeficiente de extinción molar (ε) de
cada una de las sustancias utilizadas en el práctico se calculan los moles de sustrato transformados por
minuto:

∆A ∆c ∆c ∆A  mol 
= .ε.l → = =
t t t t.ε.l  
 L. min 

ε para NADH y NADPH es 6,23 . 103 L . mol-1 . cm-1 a 340 nm

ε del MTT es 1,7 . 103 L . mol-1 . cm-1
l = trayecto óptico de la cubeta en cm, =1

Luego se calcula la actividad enzimática de los extractos en UI. Para ello hay que transformar moles a
µmoles y considerar la alícuota de muestra tomada y el volumen final de la mezcla de reacción, de lo
cual resulta lo siguiente:

∆c Vreaccion  µmol  UI 

actividad _ enzimática = × × 106 =  =
t Valicuota  L. min   L 

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La actividad enzimática así calculada corresponde a la de la muestra procesada, que por lo general es
una dilución de extracto del órgano. Entonces, para calcular la actividad del extracto se debe
multiplicar el valor obtenido por la inversa de la dilución usada.

Finalmente se calculará la actividad específica de las isoenzimas de cada órgano teniendo en cuenta el
valor de proteínas medido en cada extracto mediante el método de Bradford. Debido a que la unidad de
volumen que se usó para el cálculo de la concentración de proteína es diferente a la usada para el
cálculo de la actividad enzimática, se debe incluir un factor de corrección (10-3)

actividad_ enzim ática − 3  µ m oles   UI 

actividad_ específica= × 10 =   = 
concentrac
ión_ proteína  m in.m g _ proteína  m g _ proteína

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