Estudar as moléculas de DNA e

RNA

Características físicas e químicas dos

ácidos nucleicos, importantes para o
seu estudo
 Estabilidade da molécula de DNA

• Pontes de hidrogénio (entre as cadeias)

• Forças de Van der Walls (entre as bases empilhadas)

Emparelhamento de bases, devido à

complementaridade entre as bases
tem um papel importante nas
Técnicas de hibridação
(manipulação dos ácidos nucleicos)
 Medição da concentração da dos ácidos
nucleicos em solução

As propriedades de absorção da luz

podem ser usadas para:

- detecção
- quantificação
- teste de pureza
 Medição da concentração da dos ácidos
nucleicos em solução

As bases aromáticas são

menos acessíveis à luz UV
quando em DNAds

Bases aromáticas absorvem UV a 260 nm (cdo máximo). Pu>Py

 RNA absorve mais luz
logo
o valor de absorção para
uma dada e mesma concentração
de DNA e RNA,
é maior para o RNA

DO260 (DNA)= 1 µg/ml

50µ

DO260 (RNA)= 1 µg/ml

40µ
 Nucleic acids purity

- Pure dsDNA has A260/A280 = 1,8

> 1,8 RNA contamination

<1,8 Protein contamination

- Pure RNA has A260/A280 = 2

Renaturação da molécula de DNA

Denaturation Renaturation
 Desnaturação dos ácidos nucleicos
Tm- temperatura de fusão

Tm (melting temperature)- temperatura à qual metade da sequência de bases de determinada

molécula de DNA, está desnaturada.
Melting point ou temperatura de fusão dos ácidos nucleicos
% G/C em diferentes organismos
 Factores que afectam a
desnaturação/renaturação da dupla hélice

• % G/C
• Sequência do DNA (DNA repetitivo)
• % incompatibilidade de pb
• Dimensão da molécula
• Concentração do DNA
• Força iónica (Na+, neutraliza P-; logo quando a concentração
salina é mais baixa, a dupla hélice fica mais instável, logo maior a
restringência quando se realizam hibridações)
• Agentes desnaturantes (formamida, ureia, etc)
 Alguns agentes de desnaturação dos ácidos
nucleicos

• Temperatura (calor)- altera o estado tautomérico das

bases, ionizando-as e rompendo ligações por pontes de H

• Soluções alcalinas (NaOH)

Agentes químicos
• Formamida que destabilizam
pontes de H
• Ureia
 Acção de ácidos, bases e sais sobre a
molécula dos DNA

Bases:
-Alteram estado tautomérico das bases, rompendo as
interacções por ponte de H, desnaturando a dupla hélice,
ou estruturas secundárias dos ácidos nucleicos

Ácidos:
-Hidrolizam os ácidos nucleicos nos seus componentes:
bases, açúcares e fosfatos.
Soluções ácidas moderadas, clivam ligações glicosídicas,
glicosídicas
gerando locais apurínicos

Sais:
- Estabilizam os grupos fosfato com carga negativa
 (tautomeric forms)

keto enol
C=O C-OH

keto enol

amino imino
-NH2 =NH

amino imino
 Isolar DNA
(ex.)

Grande variedade de técnicas consoante o tipo de estrutura que envolve o DNA:

vírus, célula bacteriana, fungos e leveduras, células de eucariotas superiores (plantas e animais).

O álcool exclui as moléculas de água do DNA, precipitando-o

 Exemplo de um método de separação e purificação das
diferentes conformações da molécula de DNA

Protein and
membrane

Linear and nicked

circular DNA

Covalently closed
circular DNA

RNA
Ethidium bromide allows DNA visualization on
agarose gels
Visualização do DNA

Restrição do DNA
Electroforese em gel de agarose
DNA restriction
CÁTODO Ânodo
pólo ou eléctrodo negativo para onde se Pólo ou eléctrodo positivo para onde se
dirigem os catiões (iões de carga positiva) dirigem os aniões (iões de carga negativa)
Electroforese em gel de agarose
Restriction of a DNA fragment and migration
on agarose gel of resulting products
Marcadores de peso molecular
DNA migration on agarose gel: DNA fragments
dimension vs agarose concentration