Sobreexpresión Del Receptor Muscarínico Cardíaco En El

Síndrome De Muerte Súbita Infantil

Angelo Livolsi1,2, Nathalie Niederhoffer1,3, Nassim Dali-Youcef4,5, Caroline Rambaud6, Catherine
Olexa1,2, Walid Mokni1,7, Jean-Pierre Gies3, Pascal Bousquet1,7*
1 Laboratoire de Neurobiologie et Pharmacologie Cardiovasculaire, Université de Strasbourg, Strasbourg, France, 2 Pô le Pédiatrique Médico-Chirurgical, Hô pitaux
Universitaires de Strasbourg, Strasbourg, France, 3 Laboratoire de Biophotonique et Pharmacologie, CNRS UMR 7213, Université de Strasbourg, Illkirch, France, 4 Institut de
Géné tique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire de Strasbourg (IGBMC), INSERM/CNRS/Université de Strasbourg, Illkirch, France, 5 Laboratoire de Biochimie Géné rale et
Spé cialisé e, Hô pitaux Universitaires, Strasbourg, France, 6 Service d’Anatomie Pathologique et Médecine Lé gale, Hô pital Raymond Poincaré , Garches, France, 7 Centre
d’Investigation Clinique, Hô pitaux Universitaires/INSERM, Strasbourg, France

Resumen
Antecedentes: Síndrome de muerte súbita del lactante (SMSL) sigue siendo la principal causa de muerte entre los bebés de
menos de 1 año de edad. Expresión perturbada de algunos neurotransmisores y sus receptores ha demostrado en el sistema
nervioso central de víctimas SMS pero ninguna anomalía biológica del sistema cardíaco vago periférico ha demostrado hasta la
fecha. El presente estudio pretende buscar anomalías cardíacas vágales en las víctimas de SMS. Se investigaron el nivel cardíaco
de expresión de los receptores muscarínicos, así como la actividad enzimática acetilcolinesterasa.

Metodología Principal conclusiones: Muestras ventriculares izquierdas y muestras de sangre se obtuvieron de autopsias de SMS
y niños fallecido por causas no cardíacas. Experimentos realizados con [3 H] NMS, un ligando muscarínico selectivo, de enlace
en los preparativos de la membrana cardíaca mostró que la densidad de receptores muscarínicos cardiacas aumentó como se
muestra por un valor de más de doble B max Estados insulares en desarrollo (n = 9 SMS frente a 8 controles). En promedio,
aumentó considerablemente la actividad de la enzima acetilcolinesterasa eritrocitos (n = 9 SMS frente a 11 controles).

Conclusiones: En el presente estudio, se ha demostrado por primera vez la sobreexpresión de receptor muscarínico cardíaco
que se asocia con SMS. El aumento de la actividad enzimática acetilcolinesterasa aparece como un posible mecanismo
regulador.

Citation: Livolsi A, Niederhoffer N, Dali-Youcef N, Rambaud C, Olexa C, et al. (2010) Cardiac Muscarinic Receptor Overexpression in Sudden Infant Death
Syndrome. PLoS ONE 5(3): e9464. doi:10.1371/journal.pone.0009464
Editor: Rory Edward Morty, University of Giessen Lung Center, Germany
Received October 7, 2009; Accepted February 8, 2010; Published March 1, 2010
Copyright: 2010 Livolsi et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which
permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.
Funding: This study was funded by the French Ministery of Research. The funder had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish,
or preparation of the manuscript.
Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist.
* E-mail: Pascal.Bousquet@medecine.u-strasbg.fr

Introducción anomalías biológicas, se evaluó el nivel cardiaco expresión de

El síndrome de muerte súbita del lactante (SMSL) es poco
conocido e impredecible. Por definición, se refiere a la muerte de
un bebé de menos de 1 año de edad cuando el análisis postmortem
riguroso no revela una causa aparente. Sigue siendo la causa
principal de muerte entre los niños de edades comprendidas entre
1 mes y 1 año. En EE.UU., los pequeños Estados insulares
representaron el 8,9% de la mortalidad infantil, es decir, 7.313
casos en el período 1999-2001. En Alemania, en 2004, alrededor
del 13% de la mortalidad infantil, es decir, 394 casos, ocurrió de
repente e inesperadamente. Un estudio prospectivo italiano
incluyendo 34.442 recién nacidos mostró que el 0,70/00 murió a
causa de SMSL. Se ha demostrado que la expresión de diversos
neurotransmisores y sus receptores pueden ser alterados en el
sistema nervioso central de las víctimas de SMSL. Varias líneas
de evidencia apoyan la hipótesis de que la estimulación vagal
podría resultar de una sobreexpresión del receptor de serotonina
central. Exposición a la nicotina durante el embarazo ha sido
propuesta como el factor de riesgo más común para los SMSL.
Hasta la fecha, ninguna anormalidad biológica del sistema
periférico vago-cardiaca se ha demostrado. Buscando tales
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receptores muscarínicos y la acetilcolinesterasa eritrocitaria
(AChE), la actividad en muestras de tejido de niños que murieron
de SMSL en comparación con los bebés fallecidos por causas no
cardíacas (grupo control).
Materiales y Métodos
Tejidos humanos
En total 18 pequeños Estados insulares y 19 niños del grupo
control se incluyeron en este estudio. Muestras del ventrículo
izquierdo (50-100 mg) (9 SIDS, 8 controles) y muestras de sangre
(9 SIDS, 11 controles) se obtuvieron de los niños que murieron
cuando edades comprendidas entre 1 y 9 meses de edad. El SMSL
fue diagnosticada de acuerdo con la Academia Americana de
Pediatría definición: la muerte del bebé que permanece sin
explicación después de una investigación a fondo, incluyendo la
actuación de una autopsia completa, examen de la escena de la
muerte, y la revisión de la historia clínica. Los niños con
enfermedades cardíacas (historia clínica de enfermedad cardíaca
y/o anomalías del tejido cardíacas) no fueron diagnosticados como
SMSL y no se incluyeron en el grupo control. En el grupo control,
las causas de muerte fueron: asfixia (n = 5), infección (n = 7),
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deshidratación (n = 3), enfermedades metabólicas (n = 1), el densidad total de los receptores muscarínicos en el corazón de los
síndrome del bebé sacudido (n = 2) y sub--hematoma de la niños que murieron de SMSL fue más del doble de la encontrada
duramadre (n = 1). Los grupos fueron emparejados por sexo en las muestras de niños que murieron por otras causas
(controles: 7F/12M; SMSL: 7F/11M) y edad (controles: 4.±2.3 (171.0695.3 frente 74.5621.5 fmol mg-1 proteínas;. Fig. 1).
meses, los pequeños Estados insulares: 4.5±1.5 meses). Las
autopsias se llevaron a cabo en el Servicio d'Anatomie et
pathologique Me'decine Le'gale, Hospital Raymond Poincaré
(Garches, Francia). Todas las autopsias, exámenes de tejido
cardíaco y las colecciones de tejidos se realizaron por el mismo
patólogo (CR) entre 1997 y 2007. Los procedimientos se llevaron
a cabo de conformidad con la ley francesa (DGS/DH/225/2B de
1986, modificada en 1987) y las recomendaciones de la Autorité
Alta 'de Santa "en el manejo de SMSL. El consentimiento
informado de los padres para el examen post-mortem y la
colección de tejidos para fines de investigación se obtuvo en todos
los casos. Todas las muestras fueron analizadas siguiendo un
procedimiento ciego.
Experimentos de unión de radioligandos
Los métodos han sido adaptados de Gies et al. Todos los
experimentos de saturación unión se llevó a cabo en 25ºC en 0,5
ml de tampón Tris (50 mM, pH 7,4) que contiene 10-15 mg de Figura 1. Total de los receptores muscarínicos en los corazones
proteína. Las muestras fueron incubadas por 90 min. La de los niños control y SMSL. Total de la densidad de receptores
incubación fue detenido por filtración al vacío rápida sobre muscarínicos (Bmax; fmol mg-1 proteína) se obtuvieron a partir del
Whatman GF/C filtros de microfibra de vidrio (VWR análisis de Scatchard de los datos de saturación utilizando [ 3H]-
International SAS, Estrasburgo, Francia) presoaked con NMS como radioligando. Condiciones de unión fueron descritas
polyethylenimine 0,3% a fin de reducir la falta de unión específica como de Material y Métodos. Cada símbolo representa un valor
a los filtros. Los filtros se lavaron dos veces con 4 ml de tampón individual, barra rayada representa el valor más alto de control. *:
de incubación helada y se transfiere a 6 mL viales contando con 3 P = 0,0137 frente al control.
ml de cóctel de centelleo (Listo Proteínas + TM, Beckman Coulter doi: 10.1371/journal.pone.0009464.g001
France SA, Roissy Charles de Gaulle, Francia). La radiactividad
se contó luego en un espectrómetro de centelleo líquido (LS Cabe destacar que los valores de la densidad de receptores
6000SC; instrumentos Beckman) con una eficiencia del 45%. muscarínicos estaban por encima de control en 8 de 9 muestras de
Análisis de Scatchard de los datos de saturación (regresión lineal SMSL (Fig. 1). La constante de afinidad Kd fue similar en ambos
con Excel Software) se utilizó para obtener el máximo sitios grupos (0.37560.114 y 0.47660.308 nmol L-1 en los controles y los
específicos de unión (Bmax; fmol MG-1 proteína) y la constante de PEID, respectivamente). Promedio de la actividad eritrocitaria
afinidad (Kd; nmol L1). El contenido de proteína se midió según el AchE también fue significativamente mayor en las víctimas de
método de Bradford utilizando γ-globulina bovina como estándar. SMSL (5.861 frente a 4.661 unidades de hematíes Capítulos 21,
La densidad del total de los receptores muscarínicos se evaluó Fig. 2.). En los controles, la edad los niños fueron, la densidad de
mediante la tritiada no selectivo antagonista de los receptores los receptores muscarínicos cardíacos y mayor actividad de la
muscarínicos N-metilescopolamina ([3H] SMN; 81,0 Ci mmol-1) enzima acetilcolinesterasa (Fig. 3).
agregó en 12 concentraciones que van desde 40 hasta 2000 pmol
L-1. La unión no específica se determinó la presencia de 1 mmol
L-1 atropina.
AchE actividad enzimática
Actividad de la enzima acetilcolinesterasa se midió en los
eritrocitos de las muestras de sangre venosa total de lo recaudado
en la heparina de acuerdo con un ensayo colorimétrico enzimático
según lo descrito previamente.
Estadísticas
Todos los valores se expresan como media ± desviación
estándar (SD). T no pareada las pruebas se realizaron con la
prueba de Mann-Whitney. Los valores de p = 0.05 fueron
considerados estadísticamente significativos.
Resultados
Con el fin de evaluar posibles anormalidades del sistema
cardiaco vagal involucrados en SMSL, la densidad de los
receptores muscarínicos cardíacos y los niveles de actividad de la
AChE fueron evaluados en las muestras obtenidas de autopsias las
víctimas de SMSL en comparación con los valores medidos en los Figura 2. AchE actividad de la enzima en los eritrocitos de los
lactantes fallecidos por otras causas (excepto las causas cardiacas). niños control y SMSL. Actividad de la AChE enzima se ensayó
En el (grupo control) este último, la densidad de los receptores colorimetrically en hemolizados de eritrocitos. Cada símbolo
muscarínicos cardíacos varió desde 46,1 hasta 100,5 fmol mg-1 representa un valor individual, barra rayada representa el valor
proteína y actividad de la AChE varió desde 2,9 hasta 5,7 más alto de control. *: p = 0,0128 frente al control.
unidades ml-1 eritrocitos. En el grupo control, ambos parámetros doi: 10.1371/journal.pone.0009464.g002
fueron homogéneos cualquiera que sea la causa de la muerte. La

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Figura 3. Total de los receptores muscarínicos cardíacos y la actividad de la enzima acetilcolinesterasa eritrocitaria en función de la
edad en niños de control y SMSL. Total de la densidad de receptores muscarínicos (B max; fmol mg-1 proteína) se obtuvieron a partir del
análisis de Scatchard de los datos de saturación utilizando [ 3H]-NMS como radioligando. Actividad de la AChE enzima se ensayó por
espectrofotometría en hemolizados de eritrocitos. Cada símbolo representa un valor individual. (a) total de receptores muscarínicos
cardíacos y (b) actividad de la enzima acetilcolinesterasa eritrocitaria en los controles (símbolos abiertos) y SMSL (símbolos completa), el
valor entre paréntesis indica el único caso de SMSL que no se ajustaban a la AchE / correlación de edad.
doi: 10.1371/journal.pone.0009464.g003

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En contraste, la densidad de los receptores muscarínicos
cardíacos y actividad de la AChE se correlacionaron
negativamente con la edad en las víctimas de SMSL, y sólo uno de
los casos no se ajustaban a la AchE / correlación de edad (entre
paréntesis en la figura 3.)
Discusión
En este estudio, se estaban buscando posibles anomalías en la
parte intra-cardiaca del sistema vagal asociada con el SMSL.
Hasta la fecha, las alteraciones colinérgicas se han reportado sólo
en el sistema nervioso central de las víctimas de SIDS:
muscarínicos disminución de la unión se ha demostrado en el
núcleo arqueado, una disminución de la inmunorreactividad
acetiltransferasa de colina, un marcador específico de las neuronas
colinérgicas, se ha observado en el tronco cerebral y alteraciones
en la unión nicotínico se han observado en los núcleos del tronco
cerebral de los niños expuestos al tabaquismo materno durante el
embarazo. En los animales, una desregulación de la balanza hacia
la hiperactividad autonómica vagal se ha sugerido como una
posible consecuencia de la exposición a la nicotina durante el
embarazo que lleva a los pequeños Estados insulares. Sin
embargo, los efectores periféricos del sistema vagal son
exclusivamente los receptores muscarínicos y no neuronales
receptores nicotínicos colinérgicos no han sido detectados hasta
ahora en los corazones humanos. Por lo tanto, nos centramos
nuestras investigaciones sobre los receptores muscarínicos
solamente. Ahora mostramos periférica anomalías vagocardiacas
saber, la sobreexpresión de los receptores muscarínicos - en
víctimas de SMSL. La sobreexpresión de los receptores
muscarínicos cardíacos y aumento de la actividad AChE en
eritrocitos de los pequeños Estados insulares se han observado.
Todos los pequeños Estados insulares incluidos en el presente
estudio fueron diagnosticados según la Academia Americana de
Pediatría definición, a saber, la muerte clínicamente inexplicable
de un bebé de menos de 1 año de edad. Entre las 18 muestras, sólo
4 procedían de los bebés mayores de 6 meses, edad en la que los
factores sociales podrían contribuir. Sin embargo, todos estos
individuos exhibieron trastornos muscarínicos similar a los más
jóvenes, lo que sugiere que los factores sociales, en su caso, no
podría dar cuenta de los trastornos biológicos observados en las
víctimas de SMSL. El grupo control incluyó niños fallecidos por
causas diversas, entre las que se asfixia. Se puede argumentar que
la hipoxia puede modificar la expresión de los receptores
muscarínicos. Sin embargo, la actividad cardiaca densidad de
receptores muscarínicos y AchE de eritrocitos medido en estos
niños en particular no eran diferentes de los del grupo de control
conjunto. El modelo de triple riesgo propuesto por Filiano Kinney
y sugiere que los resultados de muerte súbita a partir de tres
factores que ocurren simultáneamente: una vulnerabilidad
subyacente, un estresante exógeno y estar en un período crítico de
desarrollo. Nuestros resultados sugieren que la sobreexpresión de
los receptores muscarínicos en el corazón puede representar un
aspecto de la vulnerabilidad. Dormir en posición ventral actuaría
entonces como el disparador mortales. Estudios adicionales
determinarán la evolución del desarrollo de la anormalidad de los
receptores muscarínicos se describe aquí. Un pico de los SMSL se
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Receptores Muscarínicos Y SMSL
ha observado entre 2 y 3 meses de edad, será de especial interés
para buscar si las anomalías cardíacas vágales que estamos
describiendo aquí son más pronunciados durante este período de la
vida. Nuestros datos pagar parte de una respuesta. La Figura 3
muestra la evolución opuesta de la densidad de receptores
muscarínicos cardíacos y actividad de la AChE con la edad en las
víctimas de los pequeños Estados insulares en comparación con
los controles, y sugiere que la mayor de las alteraciones en la
regulación vagal, la menor edad de la muerte. Por otra parte, las
diferencias entre los controles y los pequeños Estados insulares en
su mayoría se producen antes de la edad de 5-7 meses, y es bien
sabido que el 90% de muerte súbita se produce en los 6 meses
después del parto primera. A primera vista, el aumento de
actividad de la AChE parecer paradójico. Farmacológicamente,
regulación al alza AchE puede permitir que para oponerse al
aumento de la densidad de los receptores muscarínicos con el fin
de mantener el equilibrio simpático-vagal. Así, la anomalía
cardíaca primaria es más bien la sobreexpresión de los receptores
muscarínicos, mientras que la regulación positiva AchE es
posiblemente una consecuencia de este último. En consonancia
con este supuesto, no había prácticamente ningún solapamiento
entre los valores de Bmax individuales obtenidos a partir de
corazones pequeños Estados insulares en comparación con los
controles (1/9), mientras que hubo un solapamiento muy grande
para la actividad de la AChE (4/9). Sin embargo, puesto que las
muestras cardiaco y la sangre se obtuvieron de diferentes
conjuntos de los pequeños Estados insulares, la densidad de los
receptores muscarínicos cardíacos no podía estar relacionada con
actividad de la AChE. En las víctimas de los pequeños Estados
insulares, el mecanismo de compensación puede ser, no lo
suficientemente eficaz para restablecer el equilibrio autonómico
cardiaco y evitar la muerte.
En conclusión, hemos demostrado una sobreexpresión de los
receptores muscarínicos en el tejido cardiaco del SMSL. Queda
por demostrar si el número creciente de sitios de unión refleja las
diferencias funcionales y esté o no de una anormalidad asociada
con la actividad vagal excesiva podría contribuir a SMSL.
Además, el nivel de actividad de AChE fue por encima del nivel
de control en el SMSL. Sobreexpresión de los receptores
muscarínicos cardíacos pueden representar la vulnerabilidad
biológica de SMSL evocada por Malloy.
Agradecimientos
Los autores agradecen a D. Olichon para las mediciones de
actividad de la AChE. También reconocemos William Francis por
su apoyo editorial y la asistencia en la preparación de este
manuscrito.
Contribuciones Autor
Concebido y diseñado los experimentos: AL PP. Realizaron los
experimentos: NN NDY CO WM. Analizados los datos: AL NN
PB. Contribuido reactivos y materiales / herramientas de análisis:
CR JPG. Escribió el documento: AL NN PB.
Trad. Ext. Edison Lucio Ch.
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