1.

INTRODUCCIÓN

A continuación voy a detallar las pruebas que he realizado para resolver las
cuestiones que se planteaban en el examen práctico de microbiología que empezé el
martes día 1 de Junio de 2010.
Este primer día, se destinó a la petición de medios para realizar las pruebas
pertinentes y a elaborar la programación que llevaría a cabo en los días sucesivos.
El examen consta de tres ejercicios. El primero consistía en hacer un análisis
microbilógico de una bebida (en este caso mosto) de la cual teníamos que investigar
la posible presencia de coliformes totales y recuento de enterococos fecales. EL
segundo ejercicio consistía en hacer pruebas bioquímicas así como aislamiento por
agotamiento ene estría y tinción de Gram a nuestra cepa personal. Mi cepa es la
101, E. Coli. Por último, un análisis de superficie, donde haríamos recuento de
hongos y levaduras en manos y unñas propias.

2.PROCEDIMIENTOS

2.1. INVESTIGACIÓN COLIFORMES (NMP)

Estas bacterias tienen una relación directa con la contaminación de aguas par
materias fecales debido a que suelen habitar en el intestino de mamíferos.
La técnica utilizada para la prueba presuntiva de coliformes es el método de
los tubos múltiples (número más probable, NMP).
En mi caso no utilicé esta técnica, decidí hacerla mediante el PNT 007.2
aunque el procedimiento a seguir debía ser el método de tubos multiples.

Fundamento: Determinación del numero de coliformes mediante siembra de

distintos volúmenes del líquido (mosto) a analizar en series de tubos. Estos deben
contener caldo lactosado, que es el medio específico para la investigación de
coliformes. Inoculamos este medio con con el mosto e incubamos a las temperaturas
adecuadas. El procedimiento comprende las pruebas: presuntiva, de confirmación de
coliformes totales y de confirmación de coliformes fecales.
En nuestro caso solo haremos la presuntiva. En este procedimiento una reacción
negativa excluye la presencia del colifomes y una reacción positiva indica su posible
presencia.

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Procedimiento: Se disponen en una gradilla una serie de tubos de caldo lactosado,
en este caso 3 tres tubos. Cada tubo contiene en su interior una campana de
Durham. Mediante micropipetas estériles se siembran los tubos cada uno con
1mL del líquido problema de dilución requerida. Rotulamos los tubos con la
concentración: 10‐1, 10‐2 y 10‐3.
Incubamos a 37°C durante 48 horas.

Lectura resultados:
Tubos positivos → enturbiamiento y gas
Tubos negativos → no gas en 48 horas

Esto sería lo adecuado para esta prueba. Lo que yo he hecho en el examen ha

sido sembrar 1 mL de mosto en una placa Petri esteril y echar encima unos 15 mL de
EMB. Después de incubar a 37ºC durante 24 h, no ha habido crecimiento. Esto me
indica que no hay presencia de enterobacterias en el mosto, pero no excluye la
presencia de coliformes.

Este es el resultado de la placa sembrada

2.2. RECUENTO DE ENTEROCOCOS FECALES

Los enterococos son bacterias cocáceas, Gram positivas, aerobias o

anaerobias facultativas, catalasa negativas, que fermentan la glucosa con
producción de ácido a 37ºC en un tiempo máximo de 48 horas.
El grupo incluye las especies Enterococcus faecalis, E. faecium, E. avium
y E. gallinarum, y algunas otras relacionadas, todas ellas pertenecientes al grupo
serológico D de lancefield.
Su habitat natural es el intestino de animales de sangre caliente. De ellos, E.
faecalis y E. faecium son los más comunes en el hombre.

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 Pueden crecer en presencia de azida sódica hasta el 0,04 % y a temperaturas
que van desde los 10 a los 45ºC.
Por ello, en su determinación se utilizan medios selectivos de cultivo con
agentes inhibidores e incubación a temperatura adecuada

Procedimiento: Se tienen preparados tres series de tres tubos cada una

conteniendo cada tubo unos 10 mL de caldo de cultivo Rothe. Se inoculan 3 series de
3 tubos a partir de las diluciones seriadas preparadas con el mosto.
Los tubos inoculados se incuban a 37ºC durante 48 horas con lectura a las 24 horas.

Lectura de resultados:
Se consideran positivos → los tubos que presentan turbidez y, normalmente,
sedimento blanco en el fondo del tubo. La turbidez indica crecimiento de
enterococo y ese tubo es considerado positivo. El mismo significado tiene el
sedimento blanco.
Se consideran negativos → los tubos con ausencia de turbidez y sedimento.

En mi caso había decidido relizar también un PNT pero no correspondía con el

adecuado para el recuento de enterococos por lo que no realizé esta parte del
examen.

2.3. AISLAMIENTO POR AGOTAMIENTO EN ESTRÍA

Es el método más frecuentemente utilizado para el aislamiento en

Microbiología.
El medio utilizado será AN, medio de cultivo apropiado para el crecimiento
de mi cepa personal E. Coli.

Procedimiento: Comenzaremos flamenado el asa en el mechero para esterilizarla.

A continucación, enfriar el asa en la proximidad de la llama y tomar una porción de
la muestra con un asa redonda. Después transferimos el inóculo a un área pequeña
de la superficie de la placa, lo extendemos formando estrías muy juntas sobre
la superficie de una porción pequeña de la placa. Flameamos el asa de nuevo y
enfriamos. Ahora rozamos una vez con el asa de siembra las estrías sembradas la
primera vez y realizamos sobre una porción virgen de la placa una segunda tanda
de estrías que no toque la primera. Ya por último flamemos una vez más el asa
y realizamos la misma operación para sembrar el la superficie de placa que nos
queda sin sembrar. Flameamos el asa y tapamos la placa Petri. Esta se incubará a la

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temperatura adecuada en posición invertida.

Lectura de resultados: Al finalizar las 24 h a 37ºC es resultado ha sido el

siguiente:

Como se puede apreciar en la imagen hay colonias aisladas de E.Coli.

2.4. INDOL

Se usa para identificar bacterias capaces de producir indol a partir del

triptófano (son bacterias que producen la enzima triptonasa). El aminoácido
triptófano puede ser convertido por las bacterias que contienen la enzima
triptonasa, a indol, amonio y ácido pirúvico.

Procedimiento: La bacteria se inocula en el caldo de triptona y este se incuba

durante 24 horas a 37ºC. Transcurrido el tiempo de incubación, la presencia de
indol se detecta añadiendo el reactivo de Kovacs. Al añadir unas gotas de reactivo
de Kovacs (color amarillo) este queda sobre la superficie del caldo de triptona
formando una especie de anillo.

Lectura de resultados:
Positivo → si este anillo es de color rojo‐morado
Negativo → si este anillo es del color amarillo que inicialmente tiene el reactivo de
Kovacs

En mi caso el anillo se convirtío al color rojo-morado como se puede observar

en la imagen:

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 Indol luego de añadir reactivo de Kovacs

Indol antes de añadir el reactivo de Kovacs

2.5. ROJO DE METILO

Este test es usado para determinar si un microorganismo es capaz de

producir ácidos en cantidad suficiente para bajar el pH a valores inferiores a 4.4,
lo que se comprueba con el viraje del indicador de pH, el rojo de metilo, añadido al
final de la incubación. Si esto ocurre, significa que el microorganismo en estudio es
capaz de fermentar glucosa

Procedimiento: Sembrar con asa el medio RMVP con el microorganismo objeto de

estudio e incubar a 37ºC 48‐72 horas. Después de la incubación se añaden unas 5
gotas del rojo de metilo al medio.

Lectura de resultados:
Resultado positivo → se observa un viraje a rojo.
Resultado negativo → se observa una coloración amarilla.

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 En mi caso escogí mal el medio ya que consulté la información en un lugar
inadecuado, por lo tanto, no realizé esta parte del examen.

2.6. CITRATO

Se utiliza para determinar la capacidad de un microorganismo para usar

citrato como única fuente de carbono. Esta reacción es llevada a cabo por la encima
citrasa.
El test del citrato se lleva a cabo utilizando el "agar citrato de Simmons”

Procedimiento: Se siembra con asa en un tubo con "agar citrato de Simmons". Se

incuban los tubos durante 24 horas a 37ºC y se hace la lectura del test. El agar
citrato de Simmons es inicialmente de color verde, si el microorganismo es capaz de
crecer en este medio y utilizar el citrato se produciran productos alcalinos. El azul
de bromotimol por encima de pH 7,6 produce un viraje del medio a azul.

Lectura de resultados:
Positivo → cambio de color del medio a azul
Negativo → ausencia de cambio de color

En mi caso no se ha producido ningún cambio de color, el medio permanece

con su color característico verde esmeralda, como se puede observar en la imagen.

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2.7. KIA

El agar hierro de Kligler y el agar hierro triple azúcar son dos medios sólidos
diferenciales que se preparan en tubo inclinado y que se utilizan principalmente
para la diferenciación de enterobacterias.
En el mismo tubo se determinan simultaneamente:
- La fermentación y utilización de los hidratos de carbono.
- La producción de ácido sulfhídrico (H2S).
- La producción de gas.

Procedimiento: Se flamea el asa y se deja enfriar. Entonces se toma la muestra

y se siembra, introduciendo el asa, por picadura, en el centro del tubo y hasta el
fondo del mismo. Realizar además, una estría recta, al salir sobre la superficie
inclinada del medio. Incubar los tubos a 37 ºC durante 18-24 horas.

Lectura de resultados: en mi caso, los resultados han sido los siguientes;

Ácidez → positiva
Producción gas → negativa
H2S → negativa

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2.8. MANITOL Y MOVILIDAD

La prueba del manitol es utilizada para determinar si los microorganismos son

capaces de liberando productos ácidos que serán detectados gracias al indicador
rojo de fenol que cambiará a color amarillo.
La prueba de la movilidad sirve para determinar si un organismo es móvil o
inmóvil. Las bacterias tienen movilidad por medio de sus flagelos que se encuentran
principalmente entre los bacilos aunque existen algunas formas de cocos móviles.
El medio manitol movilidad permite la realización de esta prueba gracias a ser
semisólido ya que presenta solamente 3,5 g/l de agar.

Procedimiento: siembra en picadura de los microorganismos en el medio Manitol

Movilidad, que se prepara en tubo con agar recto. Incubar a 37oC durante 24 horas

Lectura de resultados:
Manitol + → el medio cambia a color amarillo.
Manitol - → no hay cambio en la coloración.

Movilidad + → se observa crecimiento más allá de la picadura inicial.

Movilidad - → el crecimiento se limita a la zona de la picadura.

En mi caso tanto movilidad como manitol son positivos.

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2.9. ANÁLISIS DE SUPERFICIE

Este ejercicio consistía en el recuento de hongos y levaduras en uñas y

manos propias.
El método utilizados será el Método del Hisopo.

Procedimiento para la toma de muestra: Consiste en frotar con un hisopo estéril

previamente humedecido en una solución diluyente (líquido de Ringer), el área
determinada en el muestreo.

Procedimiento: Humedecemos el hisopo en el líquido de Ringer y presionamos

ligeramente en la pared del tubo con un movimiento de rotación para quitar el
exceso de solución. Con el hisopo inclinado en un ángulo de frotamos la superficie
delimitada cada una en dirección opuesta a la anterior y sembar en la placa.

En mi caso he utilizado el como medio de cultivo AN aunque no era el indicado

para la detección de levaduras y mohos, si no, para recuento de bacterias. Tras el
tiempo de incubación este ha sido el resultado de mi placa.

Vanesa Gómez Rodríguez LAB A Coruña, 2 de Junio de 2011

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