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Método del Ácido Dinitrosalicílico (DNS)


Pasos para preparar DNS:
‡ Disolver 1.6 g de NaOH en H2O destilada.
‡ Adicionar 30 g de tartrato de Na y K
‡ Adicionar 1 g de DNS
‡ Aforar a 100 mL con H2O destilada
‡ Almacenar en frascos ámbar a 4 ºC
Se debe mantener un stock de glucosa 4 mg / mL y almacenarlo a 4 ºC. A partir
de la solución de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva patrón
con la siguientes concentraciones (g/L): 0.25, 0.5, 1, 2 y 4.
Procedimiento:
‡ Tomar 0.5 mL de cada dilución y agregar 0.5 mL de reactivo DNS.
‡ Preparar una muestra blanco por dilución de 0.5 mL de H2O destilada a 0.5 mL
del reactivo de DNS.
‡ Agitar todas las muestras.
‡ Colocar a ebullir las muestras en baño maría por 5 minutos.
‡ Enfriar con hielo.
‡ Adicionar 5 mL de H2O destilada.
‡ Agitar y dejar en reposo 15 min.
‡ Leer a 540 nm.
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‡ Realizar la curva Absorbancia versus concentración. Debe tener un coeficiente
de correlación de 0.991 a 0.999.

Método de Lowry
Para obtener la curva estándar de Albúmina se preparan 5 soluciones patrones de
Albúmina en NaCl al 0.9% (P/V) de las siguientes concentraciones: 15.2, 80, 200,
300 y 400 ȝg/mL. Si la concentración de Proteína es menor de 500 ȝg/mL se lee
la absorbancia a 750 nm, si está entre 1000 y 2000 ȝg/mL se lee a 550 nm. Se
prepara un blanco que no lleva Albúmina y en su reemplazo se adicionan 0.5 mL
de solución salina (NaCl) al 0.9% (P/V). Se aplica el mismo procedimiento que a
las demás muestras.
Procedimiento:
‡ Servir en tubos de ensayo 0.5 mL de las soluciones patrón de albúmina, las
muestras problema y NaCl al 0.9% como blanco. Deben estar marcados para
conservar el orden de concentraciones para la curva.
‡ Adicionar a cada tubo 0.5 mL de NaOH 2N y llevar al baño María precalentado
a 100°C por un tiempo de 10 minutos.
‡ Dejar enfriar hasta que alcance la temperatura ambiente.
‡ Agregar a cada tubo 5 mL de la solución complejante, mezclar y dejar reposar
por 10 minutos.
‡ Adicionar 0.5 mL del reactivo de Folin-Ciocalteu 1:1, vortexiar durante 20
segundos.
‡ Reposar en un cuarto oscuro durante 30 minutos.
Leer la absorbancia a 750 nm y con las soluciones patrón construir la gráfica
Absorbancia vs. Concentración de albúmina sérica de bovina (BSA); con esta se
puede determinar la concentración de las muestras problema interpolando el valor