RAYMUNDO GUTIERREZ DIAZ

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CLONACION BACTERIANA DE GENOMAS COMPLETOS EN LEVADURA La clonacin del ADN es una tcnica que define la biologa molecular moderna. Recientemente, ha habido un creciente inters en la clonacin de fragmentos mucho ms grandes de ADN, incluyendo de genomas enteros, como por ejemplo el genoma mitocondrial del ratn, genoma del cloroplasto de maz y del arroz clonados de la levadura; incluyendo un gran numero de virus (herpes, baculovirus, coronovirus) y de bacterias (Haemophilus influenzae, Mycoplasma genitalium). La clonacin de genomas de M. genitalium y M. mycoides en la levadura indica que la clonacin del genoma completo podra ser valiosa en organismos intratables para la ingeniera gentica, usando mtodos genticos estandarizados en levadura. Por lo que el transplante del genoma, permitira la introduccin de un genoma modificando en la levadura su entorno celular original. La clonacin del genoma entero tambin facilita el estudio de los genomas de organismos que son difciles de cultivar. Adems, ayuda en la construccin y propagacin de genomas sintticos. Se mostr la clonacin de los genomas naturales de M. pneumoniae y M. genitalium, y describieron en detalle la clonacin de la M. genoma mycoides, en la levadura Saccharomyces cerevisiae, caracterizado por mtodos correctos para la transformacin y manipulacin del ADN. Una vez realizada la construccin de los vectores pmycYACTn y miniTn-PuroJCVI-1.7, el cultivo de las cepas de Mycoplasma (M. genitalium cepa MS5 y M. pneumoniae cepa M129-B170) y de las levaduras ( VL6-48N, VL6-48-54G) e insercin de dichos vectores; se aislaron los genomas intactos de micoplasma en agarosa usando el kit Bio-Rads CHEF Mammalian Genomic DNA de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las molculas de ADN grandes se han clonado de forma estable en la levadura con la adicin de un centrmero de levadura (CEN), el cual permite a las molculas estar separados de los cromosomas de levadura. Dichas molculas han sido clonados, tanto en la forma lineal mediante la adicin de los telmeros de los extremos, y tambin en forma circular. Dado que los genomas de bacterias son generalmente circular, es ms fcil para clonar en esta forma. Se tomaron tres enfoques diferentes para la clonacin de los genomas en levadura. El primer enfoque consiste en insertar un vector de la levadura en el genoma de la bacteria antes de la transformacin de la levadura. En el segundo enfoque, el genoma bacterial y un vector de levadura son cotransformados dentro de la levadura; en el tercero se utilizan piezas ensambladas de ADN, tanto naturales como sintticos, de esta manera se puede construir genomas para estudiar la funcin gnica y para crear fbricas de clulas microbianas. En este estudio se utilizaron estos enfoques de los cuales se clon el genoma de M. genitalium, M. mycoides subespecie capri y M. pneumoniae por separado en la levadura. Una fraccin significativa de levaduras transformadas mostr la presencia de genomas completos de micoplasma. Los datos de cinco experimentos mostraron que aproximadamente la mitad (rango: 35-61%) de los clones eran correctos por los dos mtodos de evaluacin utilizados. Se encontraron clones incompletos, que pudieron haber surgido de la recombinacin en la levadura durante el proceso de transformacin con un genoma de micoplasma completa.

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Se obtuvieron clones estables de tres genomas de micoplasmas en levadura, variando de tamao (0.6-1.1 Mb). La toxicidad genetica se reduce al minimo porque la regulacin de la expresin gnica en una eucariota (la levadura) es diferente a la de los procariotas. Por lo tanto, la mayora de los genes de micoplasma, si se llegaran a expresar, produciran protenas truncadas en la levadura, evitando en gran medida la posibilidad productos gnicos txicos. Por lo que la clonacin de todo el genoma bacteriano en levadura puede tener considerable utilidad para el estudio de organismos que son difciles de cultivar o que no se tienen las herramientas genticas bien desarrolladas, incluyendo ciertos agentes patgenos u otros organismos. El ciclo de la clonacin, la modificacin y el trasplante podra repetirse varias veces para desarrollar un organismo con las caractersticas deseadas. As es como esto podra mejorar nuestra comprensin de conjuntos de mnimos genes y la construccin de fbricas de clulas microbianas. Estos resultados confirman que los dos genomas diferentes micoplasma son reproducidos con exactitud en la levadura.