Анализ белков по размерам молекул и молекулярной массе в системе

вертикального электрофореза в полиакриламидных гелях (SDS-PAGE)

Список используемых сокращений:

АА - акриламид,
ДСН - додецилсульфат натрия,
ДТТ - дитиотреитол,
МБА - метиленбисакриламид,
МЭ - 2-меркаптоэтанол,
ПСА - персульфат аммония,
ЭДТА - этилентдиаминтетрауксусная кислота,
ТЕМЕД- N,N,N`,N` - тетраметилэтилендиамин,
Трис - трис(оксиметил)-аминометан,
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

Растворы:
1. Маточный раствор мономеров (хранить при 4 С). 29,2г АА растворяют в 50 мл
дистиллированной воды ,добавляют 0,8 г МБА и растворяют при интенсивном
перемешивании после доведения объема дистиллированной водой до 100 мл.
2. 10 % ДСН (хранить при комнатной температуре, в холодильнике выпадает в
осадок). 10г ДСН растворяют при нагревании в 90мл дистиллированной воды и
доводят объем до 100 мл.
3. 1 % ПСА (приготавливается непосредственно перед применением, хранят не более
двух суток) 20мг ПСА помещают в пенициллиновый флакон и растворяют в 2 мл
дистиллированной воды, перемешивая пипетированием.
4. 0,1 М ЭДТА (хранить при 4 С). 2,92 г ЭДТА или 3,72 г динатриевой соли ЭДТА
(трилон Б) перемешивают на магнитной мешалке с 80 мл Н2О и титруют
концентрированным раствором NaOH до значения рН близкого к нейтральному, но
не выше рН7,5, по универсальной индикаторной бумаге (при этом раствор
полностью просветляется), затем доводят объем дистиллированной водой до 100
мл.
5. 1,5 М трис-HCl, рН 8,9 (хранить при 40 С). 18,17г триса растворяют в 80 мл воды и
титруют при перемешивании на магнитной мешалке от 3 до 6М раствором HCl до
рН 8,9, затем доводят дистиллированной водой до 100 мл.
6. 0,5 М трис-НCl, рН 6,7 (хранить при 40 С). 6,06 г триса растворяют в 80 мл воды и
титруют при перемешивании на магнитной мешалке от 3 до 6М раствором HCl до
рН6,7, затем доводят дистиллированной водой до 100 мл.
7. 50 % водный раствор глицерина (хранить при 40 С). 25мл глицерина доводят
дистиллированной водой до 50мл при перемешивании на мешалке.
8. Электродный буфер (running buffer).192 мМ трис-глициновый буфер рН 8,4.
28,8 г глицина растворяют в 900 мл дистиллированной воды, титруют сухим
трисом до рН 8,4 и доводят дистиллированной водой до 1л.
9. Раствор для солюбилизации образцов (sample buffer)
1 0,5М трис-HCl, рН 6,7 2мл
2 50 %-ный глицерин 3,2мл
3 0,1М ЭДТА 0,2мл
4 10%-ный ДСН 1,6мл
5 Дистиллированная вода 1мл
6 Бромфеноловый синий (лидирующий 0,5-1 мг (несколько
краситель) кристаллов на кончике
 скальпеля)
7 2-меркаптоэтанол (добавляют к аликвоте До 5%, то есть 50 мкл на
этого раствора перед приготовлением 950 мкл раствора для
образца!) солюбилизации
10. Фиксирующий раствор (fixing solution). Смешивают под тягой 60мл 96%-ного
этанола, 120мл дистиллированной воды и 20мл ледяной уксусной кислоты.
11. Окрашивающий раствор (staining solution). 250мг красителя Кумасси синего G-
250 растворяют в 20мл ледяной уксусной кислоты (под тягой) и доводят объем
раствора дистиллированной водой до 200мл. Полученный раствор фильтруют
через фильтр Шотта №1 или на воронке с бумажным складчатым фильтром.
Следует помнить, что другие красители, даже близкие по строению готовят по
другой рецептуре, например для Кумасси R-250 готовят раствор, включающий 40
% этанола или метанола и 7-10 % уксусной кислоты.
12. Отмывающий раствор (destaining solution). 7 % уксусная кислота.140мл ледяной
уксусной кислоты разбавляют в мерной колбе на 2 литра дисстиллированной водой
и доводят объем до метки.
Приготовление образцов для электрофореза
1) из белкового порошка:
взвешивают 2мг белка, помещают в пластиковую пробирку для микропроб с крышкой
(типа Eppendorf microtubes), добавляют 0,5мл буфера без ДСН, затем для
солюбилизации образца прибавляют 0,5мл солюбилизирующего буфера с ДСН и 25
мкл 2-меркаптоэтанола (прибавлять только под включенной тягой!), закрывают
крышкой и для солюбилизации помещают в кипящую водяную баню на 5мин, затем
центрифугируют при 5000g 20мин для удаления осадка.
2) из разбавленного белкового раствора (менее 2мг/мл):
к 1 объему разбавленного белкового раствора добавляют 9 объемов ацетона,
центрифугируют при 5000g 10мин, осадок подсушивают солюбилизируют, как в
случае 1).
3) из концентрированного белкового раствора (более 2мг/мл)
50мкл концентрированного белкового раствора помещают в пластиковую пробирку
для микропроб, разбавляют водой до конечной концентрации 2мг/мл, добавляют
равный объем буфера для солюбилизации образца, закрывают крышкой и помещают в
кипящую водяную баню на 5мин, затем центрифугируют, если необходимо.
Приготовление разделяющих гелей
Выбирают гель одной из концентраций мономеров, ориентируясь на предполагаемые
молекулярные массы анализируемых белков.
Для анализа препаратов высокомолекулярных мышечных белков используем 9 % гель.
Готовим 20 мл раствора для формирования геля.

Исходный компонент 6% гель 9 % гель 12 % гель

1. 1,5 М трис-HCl, рН8,9 5 мл 5 мл 5 мл
2. 30 % АА-МБА 4 мл 6 мл 8 мл
3. 0,1 М ЭДТА 0,4 мл 0,4 мл 0,4 мл
4. 50 % глицерин 2 мл 2 мл 2 мл
5. 10 % ДСН 0,2 мл 0,2 мл 0,2 мл
6. Довести объем водой до 19 мл до 19 мл до 19 мл
7. ТЕМЕД 10 мкл 10 мкл 10 мкл
8. 1% ПСА 1 мл 1 мл 1 мл
Залить в гелевую ячейку, прибавляя гель с правой стороны (например), затем по
каплям (но быстро) с левой стороны прибавить бутанол (100 мкл) для формирования
ровной верхней границы геля. Гель оставляют в покое для прохождения
полимеризации. Оптимальное время полимеризации 20-40 минут, что обеспечивает
равномерное формирование пористой структуры. После полимеризации бутанол
быстро смывают 5-8 сменами дистиллированной воды, воду удаляют перевернув
камеру, небольшой остаток оставляют, чтобы не сох верхний край геля.
Перед заливкой концентрирующего геля, скорость полимеризации которого должна
быть выше и процесс должен проходить за 10 мин, избыток воды лучше удалить
полоской фильтровальной бумаги, перевернув камеру на боковой торец (то есть на
900).
Приготовление концентрирующего геля (10 мл):

Исходный компонент 4,5 % гель

9. 0,5 М трис-HCl, рН6,7 2,5 мл
10. 30 % АА-МБА 1,5 мл
11. 0,1 М ЭДТА 0,2 мл
12. 50 % глицерин 1 мл
13. 10 % ДСН 0,1 мл
14. Довести объем водой до 9 мл
15. ТЕМЕД 10 мкл
16. 1% ПСА 1 мл

Приготовленный гель заливают сверху разделяющего, налив его до верхнего

края с формированием верхнего, выпуклого мениска, затем вставляют гребенку (часть
геля стечет вниз по стеклу, но это не проблема). Оставляют до полимеризации.
Гель фиксируют 30 мин-1 час в фиксирующем растворе на шейкере, затем
окрашивают 1 час в окрашивающем растворе на шейкере, далее отмывают краситель,
не связавшийся с белковыми зонами образцов, многократными инкубациями в
отмывающем растворе.