TINCIONES HEMATOLOGICAS

Para poder diferenciar los componentes de un extendido de sangre es necesario teirlos. Los colorantes ms comnmente usados para las tinciones hematolgicas son los derivados de la anilina: colorantes de romanowsky. La tincin de tipo romanowsky es muy importante en el laboratorio de hematologa porque con ella puede obtenerse una gran cantidad de informacin a partir de un frotis sanguneo bien teido. Consiste en: Azul de metileno y sus productos de oxidacin (azul b) Eosina Y La accin combinada de estos colorantes produce el efecto romanowsky. Las propiedades de tincin de las tinciones de romanowsky dependen de: Del enlace de los colorantes a las estructuras qumicas De las interacciones del azul b y la eosina Y Ejemplos de tinciones efecto romanowsky: Wright Wright giemsa Leishman May grumwald Jenner May grunwald-giemsa Segn su composicin qumica se distinguen tres grupos de colorantes: Los cidos como la eosina; Los bsicos, como el azul de metileno y Los neutros, combinaciones de uno cido y uno bsico que dan tinciones policromas. Los colorantes cidos y bsicos se encuentran como sales y su caracterstica cida o bsica la da su fraccin cromognica (generadora de color) al tener carga positiva o negativa. En un colorante cido, la fraccin cromognica posee carga negativa (colorante aninico). En un colorante bsico, la fraccin cromognica posee carga positiva (colorante catinico). Durante la coloracin las fracciones cromognicas se ligan a componentes tisulares de carga contraria.

Metacromasia: una coloracin es metacromtica cuando tie selectivamente determinadas estructuras de otro color distinto al colorante. (azul de metileno, azul de toluidina, tionina) Policromtica: Tambin hay combinaciones de colorantes que dan lugar a tinciones polcromas. Panptica: Una coloracin es panptica cuando se utilizan sucesivamente sustancias colorantes neutras. Pancrmica: cuando se aplican todas las sustancias colorantes neutras juntas. Vitales: son aquellas que se efectan sobre clulas que estn vivas, mediante la introduccin de un colorante en la circulacin de un organismo vivo. Supravital: una tincion supravital es aquella que se realiza sobre clulas o tejidos vivos, pero que estn aislados del organismo del que proceden. Las tinciones no vitales se realizan sobre clulas muertas. La coloracin de clulas muertas requiere un proceso previo de fijacin, que tiene por objeto el mantener inalterada su estructura y el adherirlas firmemente a la superficie del portaobjetos. La fijacin puede realizarse mediante calor, aunque habitualmente se realiza con etanol o metanol. El mecanismo por el cual determinados componentes de la estructura celular se tien por ciertos colorantes y no por otros depende de: Diferencias en la estructura qumica. Diferencias de afinidad. Las sustancias basfilas reciben este nombre porque muestran afinidad por los colorantes bsicos (o alcalinos). Las sustancias acidfilas tienen afinidad por los colorantes cidos. Los colorantes son sensibles a la concentracin inica de protones (ph) Las distintas estructuras celulares se teirn con el colorante de ph antagnico As: Los colorantes cidos teirn las estructuras bsicas (hemoglobina, grnulos de los eosinfilos llamados as por su atraccin a la eosina.). Los colorantes bsicos teirn las estructuras cidas (adn, arn citoplasmtico) denominadas estructuras basfilas. Las estructuras neutrfilas son aquellas que tienen afinidad por ambos colorantes. Colorante cido Colorante bsico

Fraccin cromognica (-) (aninico)

Fraccin cromognica(+) (catinico)

Eosina

Azul de metileno

Para sustancias cidofilas (+)

Para sustancias basfilas (-)

Grupos bsicos (hemoglobina, granulacin eosinfilos)

Grupos cidos (ncleo, citoplasma, ribosomas)

Desarrollan color rojo

Desarrollan color azul

TINCIN DE WRIGHT. Metdica Extracto de las tcnicas de tincin hematolgica de la casa Panreac. Fundamento El colorante utilizado es una solucin de eosina y una mezcla de azul de metileno (del 50 al 75%) y azur B (del 10 al 25%) junto con otros derivados del alcohol metlico. Dada la presencia de metanol en la composicin del colorante, no es necesario un paso previo de fijacin antes de la coloracin. Slo si se van a guardar las extensiones sin teir de un da para otro precederemos a su fijacin para evitar el deterioro del frotis. Material necesario Microscopio ptico. Cristalizador. Puentes de tincin. Pipetas Pasteur con chupete. Frasco lavador. Guantes. 3

Tubos de ensayo.

Reactivos Solucin de eosina-azul de metileno segn Wright. Solucin tampn pH 7,2. Aceite de inmersin.

Muestra Sangre capilar fresca o venosa anticoagulada. Los anticoagulantes ms adecuados son la heparina y el EDTA. Tcnica Realizar un frotis sanguneo muy fino. Dejar secar al aire. Sobre la extensin colocada horizontalmente en el puente de tincin verter 1 ml de eosina-azul de metileno. Dejamos actuar un minuto y lavamos con solucin tampn pH 7,2. Dejamos escurrir y secar en posicin vertical. Inmediatamente antes de su empleo y en un tubo de ensayo, diluimos 0,5 ml. de eosina-azul de metileno con 0,5 ml de solucin tampn pH 7,2. Mezclamos bien y cubrimos con esta dilucin la extensin. Teimos durante 3-5 minutos y lavamos con agua del grifo. Volvemos a lavar con solucin tampn pH 7,2. Dejamos escurrir y secar en posicin vertical.

Lectura de resultados Depositamos una gota de aceite de inmersin y observamos con el objetivo de 100 x. Las clulas se observan coloreadas de la misma manera que con la tincin de Giemsa.

Glbulos blancos teidos con colorante de Wright

LINFOCITO

BASFILO

EOSINFILO

NEUTRFILO

TINCIN DE MAY GRUNWALD-GIEMSA ( TINCIN PANPTICA) El empleo combinado de los colorantes may grunwald y giemsa se conoce con el nombre de tincin panptica de may grunwald giemsa. Se basa en el uso de soluciones preparadas a base de colorantes de acentuado poder policromatfilo y metacromtico Fundamento: Se basa en el agregado de la solucin de may grunwald formada por eosinato de azul de metileno en alcohol metlico , la que fija el extendido y tiene afinidad por los citoplasmas. Luego se agrega el colorante giemsa diluido (en el momento de realizarse la coloracin), esta constituido por azures que son derivados por oxidacin del azul de metileno. Tiene afinidad por los ncleos y ciertas granulaciones. La eosina es un colorante cido por lo tanto tie los componentes acidfilos de las clulas. El azul de metileno es un colorante bsico por lo tanto se une a las fracciones basfilas Es importante respetar las condiciones de la coloracin ya que variaciones de ph pueden alterarla. En esta coloracin se trabaja a ph neutro o ligeramente alcalino. Si se trabaja a ph cido, habr mayor cantidad de sustancias cargadas positivamente y se absorber mayor cantidad de eosina. Los extendidos adquieren una tonalidad rojisa. Si el ph es muy bsico, habr mayor fijacin de azul de metileno y se exagerarn los colores azules. May grunwald Combina la eosina (colorante cido) con el azul de metileno (colorante bsico) El proceso de tincin empieza con la fijacin con metanol cuya accin es fijar la pelcula de sangre por precipitacin y adherencia de las protenas celulares al portaobjetos de vidrio. La tincin efectiva se inicia con la adicin de un amortiguador al colorante lo que da lugar a su ionizacin. La eosina y el azul de metileno son sensibles a cambios de ph de las diferentes estructuras celulares. El reactivo en medio acuoso tiene la accin de diferenciar tiiendo: sustancias acidfilas sustancias basfilas color rojo color azul

ncleo Los grupos cidos de citoplasma ribosomas

se colorean azul (estructuras basfilas) afinidad por colorantes bsicos

Tienen apetencia por el colorante bsico

tincin por azul de metileno

Los grupos bsicos de

molcula de hemoglobina

se colorea rojo (estructura acidfila) afinidad por colorantes cidos tincin por la eosina

tienen apetencia por el colorante cido

Giemsa derivados por oxidacin del azul de metileno (metiltionina) azures (a,b,c)

Es responsable de la coloracin prpura de la cromatina leucocitaria y granulaciones citoplasmticas (azurfilas)

Observadas al microscopio, las clulas presentan las siguientes coloraciones. Hemates: color rosado Grnulos neutrfilos: de rosa a lila Grnulos eosinfilos: de rojo a anaranjado Grnulos basfilos: azul violceo oscuro Citoplasma de neutrfilos: rosa claro Citoplasma de linfocitos: azul celeste claro Citoplasma de monocitos: azul grisceo Ncleo de neutrfilos y linfocitos: violeta oscuro Ncleo de monocitos: prpura azulado algo ms claro que los anteriores 6

Eritrocitos policromatfilos: azul violeta Punteado basfilo: azul oscuro Cuerpos de howell yollie: rojo prpura Plaquetas: prpura oscuro o violeta con un halo azul claro a su alrededor. La coloracin celular es muy variable en cuanto a tonalidades, dependiendo del tiempo de tincin y de los lotes de colorantes, Causas de error Tincin demasiado azulada: - Extensin demasiado gruesa - Excesivo tiempo de tincin - Lavado inadecuado - Alcalinidad del colorante, del agua o tampn Tincin demasiado rosada: - Tincin insuficiente - Excesivo tiempo de lavado - Acidez del colorante o tampn Otras causas: - Utilizacin de portas sucios - Secado del colorante durante el periodo de tincin - Lavado inadecuado durante la tincin - Presencia de polvo en el portaobjeto - Mala filtracin del colorante antes de su uso - Ph impropio del colorante o los diluyentes - El agua destilada no es siempre neutra - Precipitacin del colorante sobre el port-objeto debido a inadecuado lavado o uso del colorante que no ha sido filtrado adecuadamente Tincin cida: los eritrocitos se tien bien pero los leucocitos se tien muy plidos o no se tien. Tincin bsica o alcalina: los eritrocitos se tien plidos y el ncleo de los leucocitos excesivamente azules. Debe corregirse el ph del agua destilada o amortiguador.

Advertencias: 1.- limpieza del porta-objetos para evitar coloraciones defectuosas deben utilizarse siempre porta-objetos cuidadosamente limpios, desengrasados y secos. Debe evitarse el contacto de los dedos con la superficie destinada a la extensin.

2.- agua destilada las coloraciones defectuosas de extensiones de sangre se deben casi siempre al empleo de agua destilada con exceso de cido carbnico. Por eso hay que emplear agua recin destilada para diluir los colorantes y para lavar las extensiones sanguneas. El ph adecuado es 5.8 3.- preparacin de la extensin las extensiones una vez secas deben fijarse lo antes posible (no ms de 24 horas) para luego ser teidas por el colorante de eleccin. Slo se puede usar edta, nunca utilizar otro anticoagulante para hacer el frotis. 4.- mtodo de coloracin no teir nunca las preparaciones cerca de humos de cidos o lcalis fuertes. la tincin en extensiones sobre porta-objetos se realiza en general de tal manera que sta queda cubierta por la solucin colorante con una capa de 2 cm. De espesor pero evitando que se derrame por los bordes .si se aplica una cantidad demasiado pequea de solucin de colorante se pueden producir precipitados del colorante. 5.-dilucin del colorante giemsa es importante que la dilucin del giemsa debe ser preparada en el instante en que se va a usar y jams antes, dado que el colorante produce su efecto mximo en el momento en que la solucin stock se adiciona al agua. 6.- lavado de las extensiones sin volcar el colorante, eliminando del porta-objetos mediante un breve y vigoroso chorro de agua. Si se volcara antes de lavar, se adherira al frotis el precipitado que siempre se forma en las mezclas de colorantes y del que una parte se acumula en la superficie en forma de pelcula irisada. El lavado no debe ser prolongado debido a que el agua decolorara los elementos recientemente teidos. Conviene efectuarlo con agua destilada. 7.- secado inmediatamente despus de efectuado el lavado escurrir el agua colocando el porta-objetos en posicin casi vertical, limpiando previamente su parte posterior con un lienzo.