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Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro - UNIRIO Disciplina de Microbiologia Turma de Nutrio

MTODO DE COLORAO DE GRAM Introduo:

Os mtodos de colorao so muito importantes em bacteriologia, pois facilitam a visualizao das bactrias ao microscpio de luz. Alguns mtodos so denominados de diferenciais, isto permitem a classificao das bactrias em grupos. Entre estes mtodos destacam-se o Mtodo de Colorao de Gram (que classifica a maioria das bactrias em Gram positivas e Gram negativas) e o Mtodo de ZiehlNeelsen (que cora em particular as micobactrias). O objetivo desta aula executar o Mtodo de Colorao de Gram. Este diferencia as bactrias em relao a sua capacidade de resistir a remoo do complexo corante iodopararrosanilina (reao do corante cristal violeta e com o iodo do mordente lugol) por uma soluo de descorante orgnico (soluo de lcool etlico, soluo de acetona, ...). As bactrias que retm o complexo corante (reao positiva) se apresentam coradas em roxo so chamadas de Gram positivas. As que no conseguem reter o complexo corante (reao negativa) se apresentam coradas em rosa so chamadas de Gram negativas. Observao: Os esporos bacterianos no se coram no Mtodo de Gram.

Procedimento:
1- Preparo de Esfregao Bacteriano: 1.1- A Partir de Colnias Bacterianas: colocar uma gota de soluo salina estril na lmina; tocar a colnia bacteriana com uma ala de nquel-cromo e homogeneizar o material da ala na gota de salina colocada da lmina; distender a suspenso bacteriana com movimentos elpticos at que esta forme um filme tnue e homogneo (ESFREGAO); deixar o esfregao secar a temperatura ambiente; fixar o esfregao lmina passando esta por 3-5 vezes sobre a chama do bico de Bunsem;

1.2- A Partir de Culturas em Meio Lquido: colocar uma alada da cultura na lmina; distender a suspenso bacteriana com movimentos elpticos at que esta forme um filme tnue e homogneo; deixar o ESFREGAO secar a temperatura ambiente; fixar o esfregao lmina passando esta por 3-5 vezes sobre a chama do bico de Bunsem;

2- Colorao do Esfregao Bacteriano pelo Mtodo de Gram : cobrir o esfregao com a Soluo de Cristal Violeta por 1 minuto; desprezar o corante e lavar a lmina com gua corrente (no deixar que o jato de gua incida diretamente sobre o esfregao); cobrir o esfregao com o Soluo de Lugol (iodo + iodeto de potssio) por 1 minuto; desprezar o mordente e lavar a lmina com gua corrente; cobrir o esfregao com o Soluo Descorante por alguns segundos e desprezar; lavar a lmina com gua corrente*; cobrir o esfregao com a Soluo de Contra-Corante (safranina ou fucsina de Ziehl-Neelsen diluda 1/10) por 30 segundos; desprezar o contra-corante e lavar a lmina com gua corrente*; secar a lmina e observar ao microscpio ptico com objetiva de imerso;
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