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AulaAula dede BioquímicaBioquímica AvançadaAvançada Tema:Tema: CaracterizaçãoCaracterização dede

AulaAula dede BioquímicaBioquímica AvançadaAvançada

Tema:Tema:

CaracterizaçãoCaracterização dede Proteínas:Proteínas:

QuanQuantifitificaçcaçããoo

Prof.Prof. Dr.Dr. JúlioJúlio CésarCésar BorgesBorges

Depto.Depto. dede QuímicaQuímica ee FísicaFísica MolecularMolecular –– DQFMDQFM InstitutoInstituto dede QuímicaQuímica dede SãoSão CarlosCarlos –– IQSCIQSC UniversidadeUniversidade dede SãoSão PauloPaulo –– USPUSP E-E-mail:mail: borgesjc@iqsc.usp.brborgesjc@iqsc.usp.br

IntroduçãoIntrodução QualquerQualquer trabalhotrabalho comcom proteínaproteína devedeve envolverenvolver aa

IntroduçãoIntrodução

QualquerQualquer trabalhotrabalho comcom proteínaproteína devedeve envolverenvolver aa quantquantificaçãoificação dada amostraamostra

MetodologiasMetodologias

Principais:Principais: ESPECTROFOTOMÉTRICASESPECTROFOTOMÉTRICAS TiposTipos dede AmostrasAmostras versusversus MétodoMétodo

ColorimétricosColorimétricos

AmostrasAmostras impurasimpuras

-- FenômenoFenômeno dede quantificaçãoquantificação indiretoindireto ReaçãoReação entreentre corantecorante--proteínaproteína proporcionaproporciona corcor espeespecíficacífica

AbsorçãoAbsorção

AmostrasAmostras puraspuras

-- FenômenoFenômeno dede quantificaçãoquantificação diretodireto pontoponto único!!!único!!! ProteínaProteína absorveabsorve luzluz -- ImportanteImportante métodométodo dede acompanhamentoacompanhamento dede purificaçãopurificação dede pproteínasroteínas

EspectroEspectro EletroEletro--MagnéticoMagnético Far UV Ultravioleta Near UV Visible light 200 nm 300 nm
EspectroEspectro EletroEletro--MagnéticoMagnético Far UV Ultravioleta Near UV Visible light 200 nm 300 nm

EspectroEspectro EletroEletro--MagnéticoMagnético

Far UV Ultravioleta Near UV Visible light
Far UV
Ultravioleta
Near UV
Visible light
200 nm 300 nm AbsorçãoAbsorção
200 nm
300 nm
AbsorçãoAbsorção

ColorimétricosColorimétricos

MensuraçãoMensuração dada AbsorçãoAbsorção I T = I 0 I 0 Abs = log I
MensuraçãoMensuração dada AbsorçãoAbsorção I T = I 0 I 0 Abs = log I

MensuraçãoMensuração dada AbsorçãoAbsorção

I T = I 0 I 0 Abs = log I
I
T =
I
0
I
0
Abs = log
I
TransmitânciaTransmitância versusversus AbsorbânciaAbsorbância I T = I 0 I 0 Abs = log I TransmTransm

TransmitânciaTransmitância versusversus AbsorbânciaAbsorbância

I T = I 0 I 0 Abs = log I TransmTransm itânciaitância AbsoAbso rbânciarbância
I
T =
I
0
I
0
Abs = log
I
TransmTransm itânciaitância
AbsoAbso rbânciarbância

ConcentraçãoConcentração

ConcentraçãoConcentração

TransmitânciaTransmitância versusversus AbsorbânciaAbsorbância

TransmitânciaTransmitância versusversus AbsorbânciaAbsorbância

TransmitânciaTransmitância versusversus AbsorbânciaAbsorbância

LeiLei dede BeerBeer--LambertLambert

Abs = .l.c
Abs = .l.c
LeiLei dede BeerBeer--LambertLambert Abs = .l.c AbsAbs == loglog II 0 0 /I/I == AbsorbânciaAbsorbância (UA)(UA)

AbsAbs == loglog II 00 /I/I == AbsorbânciaAbsorbância (UA)(UA)

εε == CoeficienteCoeficiente dede absortividadeabsortividade molarmolar (mol/L(mol/L --11 .cm.cm --11 ))

CC == ConcentraçãoConcentração MolarMolar (mol/L)(mol/L) ll == PassoPasso ópticoóptico (cm)(cm)

DesvioDesvio dada LeiLei dede Beer-Beer-LambertLambert AltasAltas concentraçõesconcentrações dodo solutosoluto
DesvioDesvio dada LeiLei dede Beer-Beer-LambertLambert AltasAltas concentraçõesconcentrações dodo solutosoluto

DesvioDesvio dada LeiLei dede Beer-Beer-LambertLambert

AltasAltas concentraçõesconcentrações dodo solutosoluto provocaprovoca oo “bloqueio”“bloqueio” dada passagempassagem dede LuzLuz

ExisteExiste umauma faixafaixa ótimaótima parapara asas medidasmedidas dede AbsorbânciaAbsorbância

parapara asas medidasmedidas dede AbsorbânciaAbsorbância TT == I/II/I 0 0 AbsAbs == logIlogI 0 0 /I/I

TT == I/II/I 00

AbsAbs == logIlogI 00 /I/I

9595

0.0220.022

9090

0,0460,046

5050

0,3010,301

1010

1,0001,000

55

1,3011,301

22

1,7001,700

11

2,0002,000

MedidasMedidas >> 90%90% TT ee << 10%10% ErrosErros altosaltos IdealIdeal 90%90% << TT >> 10%10%

MétodosMétodos dede DeterminaçãoDeterminação dada ConcentraçãoConcentração dede ProteínasProteínas

MétodosMétodos dede DeterminaçãoDeterminação dada ConcentraçãoConcentração dede ProteínasProteínas

ColorimétricosColorimétricos BiuretBiuret ProteinProtein AssayAssay:: 19491949

CobreCobre emem NaOHNaOH –– ComplexoComplexo QuadradoQuadrado planarplanar comcom aa ligaçãoligação peptídicapeptídica

λλ == 270270 nmnm

-- 66 xx maismais sensibilidadesensibilidade

ii

ii

ff

-- MuMu tostos nternter erenteserentes

λλ == 540540 nmnm

-- BandaBanda dede escolhaescolha parapara testestestes analíticosanalíticos

-- MenorMenor númeronúmero dede interferentesinterferentes

DesvantagemDesvantagem presençapresença dede interferentesinterferentes queque reagemreagem comcom oo CobreCobre

LowryLowry assayassay:: 19511951

MolibdatoMolibdato,, tungstatotungstato ee HH 33 POPO 44 –– ÓxidoÓxido--reduçãoredução nana presençapresença dede CuCu 2+2+

λλ == 750750 nmnm

-- VantagemVantagem AltaAlta sensibilidadesensibilidade

-- DesvantagensDesvantagens MuitosMuitos interferentes;interferentes;

-- AbsortividadeAbsortividade muitomuito variávelvariável parapara diferentesdiferentes proteínproteínas;as;

-- ObedeceObedece aa leilei dede Beer-Beer-LambertLambert numanuma pequenapequena faixafaixa dede concentração.concentração.

MétodosMétodos dede DeterminaçãoDeterminação dada ConcentraçãoConcentração dede ProteínasProteínas

MétodosMétodos dede DeterminaçãoDeterminação dada ConcentraçãoConcentração dede ProteínasProteínas ColorimétricosColorimétricos

BicinchoninicBicinchoninic AcidAcid (BCA)(BCA) ProteinProtein AssayAssay:: 19901990

CuCu 2+2+ ++ proteínasproteínas CuCu 1+1+ ComplexaçãoComplexação comcom oo BCABCA

λλ == 560560 nmnm

VantagensVantagens:: Facilidade,Facilidade, rapidezrapidez ee altaalta sensibilidadesensibilidade (=(= Lowry)Lowry)

Desvantagens:Desvantagens: DependênciaDependência dada temperaturatemperatura reacionalreacional ee emem funçãofunção dodo ttempoempo

-- AbsortividadeAbsortividade muitomuito variávelvariável parapara diferentesdiferentes proteínproteínas;as;

-- MuitosMuitos interferentesinterferentes (reações(reações comcom oo CuCu 2+2+ ).).

BradfordBradford methodmethod:: 19761976

ComassieComassie brilliantbrilliant blueblue BG-BG-250250 –– ResíduosResíduos AromáticosAromáticos ee Básicos;Básicos;

InteraçãoInteração comcom proteínasproteínas ionizaioniza oo corante;corante;

λλ == 595595 nmnm

VantagensVantagens:: Sensibilidade;Sensibilidade; Rapidez;Rapidez; MenorMenor númeronúmero dede interfereinterferentes.ntes.

DesvantagensDesvantagens:: VariaçãoVariação dada absortividadeabsortividade específicaespecífica dependentedependente ddaa solubilidadesolubilidade ee tamanhotamanho dada proteína;proteína;

MétodosMétodos dede DeterminaçãoDeterminação dada ConcentraçãoConcentração dede ProteínasProteínas
MétodosMétodos dede DeterminaçãoDeterminação dada ConcentraçãoConcentração dede ProteínasProteínas

MétodosMétodos dede DeterminaçãoDeterminação dada ConcentraçãoConcentração dede ProteínasProteínas

ColorimétricosColorimétricos

NecessitamNecessitam dede CurvaCurva PadrãoPadrão comcom BSABSA ouou aa ProteínaProteína alvoalvo

ErrosErros dede 1010 aa 20%20%

ProteínaProteína alvoalvo ErrosErros dede 1010 aa 20%20% CURVACURVA PADRÃOPADRÃO EquaçãoEquação dada retareta

CURVACURVA PADRÃOPADRÃO EquaçãoEquação dada retareta

Abs = a[P] + b Abs b [ P ] = a
Abs = a[P] + b
Abs
b
[
P
] =
a

bb == brancobranco dada medidamedida

MétodosMétodos dede DeterminaçãoDeterminação dada ConcentraçãoConcentração dede ProteínasProteínas

MétodosMétodos dede DeterminaçãoDeterminação dada ConcentraçãoConcentração dede ProteínasProteínas

AbsorbânciaAbsorbância nono UVUV (método(método direto)direto)

DependeDepende dodo cálculocálculo dodo εε((λλ)) PresençaPresença dede AminoácidosAminoácidos aromáticosaromáticos

dede AminoácidosAminoácidos aromáticosaromáticos CálculoCálculo dodo εε ((λλ)) aa partirpartir dosdos
dede AminoácidosAminoácidos aromáticosaromáticos CálculoCálculo dodo εε ((λλ)) aa partirpartir dosdos

CálculoCálculo dodo εε((λλ)) aa partirpartir dosdos valoresvalores dede εε((λλ)) dosdos respectivosrespectivos aminoácidosaminoácidos

( ) = n . + n . + n . Trp Trp Tyr Tyr
(
) = n
.
+ n
.
+ n
.
Trp
Trp
Tyr
Tyr
Cys
Cys
MétodosMétodos dede DeterminaçãoDeterminação dada ConcentraçãoConcentração dede ProteínasProteínas

MétodosMétodos dede DeterminaçãoDeterminação dada ConcentraçãoConcentração dede ProteínasProteínas

AbsorbânciaAbsorbância nono UVUV (método(método direto)direto)

MétodoMétodo dede EdelhochEdelhoch:: 19671967

λλ == 270270--280280 nmnm ResíduosResíduos dede Tirosina,Tirosina, TriptofanoTriptofano ee cisteínascisteínas

OO valorvalor dede εε((λλ)) dosdos aminoácidosaminoácidos aromáticosaromáticos dependedepende dodo ambienteambiente polar-polar-apolarapolar

-- AA localizaçãolocalização dosdos aminoácidosaminoácidos aromáticosaromáticos nana proteínaproteína éé variável.variável.

-- LogoLogo dependedepende dada EstruturaEstrutura terciáriaterciária dada proteínaproteína

GuanidinaGuanidina--HClHCl desnaturardesnaturar aa proteínaproteína

-- ExposiçãoExposição osos aminoácidosaminoácidos aromáticosaromáticos aoao ambienteambiente polarpolar

-- UsoUso dodo εε((λλ)) dosdos aminoácidosaminoácidos aromáticosaromáticos emem meiomeio polarpolar

ErrosErros dede << 5%5% dependedepende dada presençapresença dede TrpTrp nana proteínaproteína valorvalor dede εε((λλ))

MétodosMétodos dede DeterminaçãoDeterminação dada ConcentraçãoConcentração dede ProteínasProteínas
MétodosMétodos dede DeterminaçãoDeterminação dada ConcentraçãoConcentração dede ProteínasProteínas

MétodosMétodos dede DeterminaçãoDeterminação dada ConcentraçãoConcentração dede ProteínasProteínas

AbsorbânciaAbsorbância nono UVUV (método(método direto)direto)

MétodoMétodo dede PacePace:: 19951995

λλ == 270270--280280 nmnm ResíduosResíduos dede Tirosina,Tirosina, TriptofanoTriptofano ee cisteínascisteínas

UsaUsa valoresvalores dede εε(λ)(λ) dosdos aminoácidosaminoácidos aromáticosaromáticos determinadosdeterminados aa partirpartir ddee váriasvárias

proteínasproteínas enoveladasenoveladas

ErrosErros dede << 5%5% (maiores(maiores dodo queque osos dodo MétodoMétodo dede EdelhoEdelhoch)ch)

ErrosErros dede medidasmedidas dede AbsorbânciaAbsorbância diretadireta MedidasMedidas dede pontoponto únicoúnico

>> 80%80% TT ee << 20%20%

AbsAbs << 0.10.1 ee >> 0.70.7

ErrosErros altosaltos LinearidadeLinearidade podepode serser Comprometida!!!Comprometida!!!

IdealIdeal 80%80% << TT >> 20%20% 0.10.1 << AbsAbs >> 0.70.7

DependeDepende dodo valorvalor dede εε!!!!!!

TT == I/II/I 00

AbsAbs == logIlogI 00 /I/I

9090

0.0460.046

8080

~0,100~0,100

5050

0,3010,301

2020

~0,700~0,700

1010

1,0001,000

EstimativaEstimativa dodo CoeficienteCoeficiente dede AbsortividadeAbsortividade MolarMolar AA partirpartir dada

EstimativaEstimativa dodo CoeficienteCoeficiente dede AbsortividadeAbsortividade MolarMolar

AA partirpartir dada seqüênciaseqüência dede aminoácidosaminoácidos

1)1) ProgramaPrograma SEDNTERPSEDNTERP

AA partirpartir dada seqüênciaseqüência dede aminoácidosaminoácidos 1)1) ProgramaPrograma SEDNTERPSEDNTERP
EstimativaEstimativa dodo CoeficienteCoeficiente dede AbsortividadeAbsortividade MolarMolar AA partirpartir dada
EstimativaEstimativa dodo CoeficienteCoeficiente dede AbsortividadeAbsortividade MolarMolar AA partirpartir dada

EstimativaEstimativa dodo CoeficienteCoeficiente dede AbsortividadeAbsortividade MolarMolar

AA partirpartir dada seqüênciaseqüência dede aminoácidosaminoácidos

1)1) ProgramaPrograma SEDNTERPSEDNTERP

Abs = .l.c Abs c = . l
Abs = .l.c
Abs
c =
.
l

UsarUsar valoresvalores dede εε(λ)(λ) ee leiturasleituras dede

AbsAbs em:em:

276276

278278

280280

282282

nmnm

nmnm

nmnm

nmnm

CalcularCalcular aa concentraçãoconcentração nestesnestes λλ ee acharachar aa médiamédia

DesvioDesvio padrãopadrão dada médiamédia << 5%5%

EstimativaEstimativa dodo CoeficienteCoeficiente dede AbsortividadeAbsortividade MolarMolar AA partirpartir dada
EstimativaEstimativa dodo CoeficienteCoeficiente dede AbsortividadeAbsortividade MolarMolar AA partirpartir dada

EstimativaEstimativa dodo CoeficienteCoeficiente dede AbsortividadeAbsortividade MolarMolar

AA partirpartir dada seqüênciaseqüência dede aminoácidosaminoácidos

2)2) ProgramaPrograma ProtParamProtParam ToolTool -- bo.expasy.org/bo.expasy.org/toolstools//protparamprotparam

ProtParamProtParam ToolTool -- bo.expasy.org/bo.expasy.org/toolstools//protparamprotparam Abs = .l.c Abs c = . l
ProtParamProtParam ToolTool -- bo.expasy.org/bo.expasy.org/toolstools//protparamprotparam Abs = .l.c Abs c = . l
ProtParamProtParam ToolTool -- bo.expasy.org/bo.expasy.org/toolstools//protparamprotparam Abs = .l.c Abs c = . l
Abs = .l.c Abs c = . l
Abs = .l.c
Abs
c =
.
l