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Introduccin

La experiencia de laboratorio fue realizada con los siguientes objetivos: * Adiestrarse con los procesos experimentales con animales (manipulacin, coleccin de rganos y procesamiento de muestras) para extraccin de ARN. * Adiestrarse con diferentes tcnicas de biologa molecular (diseo de primer y uso de PCR como herramienta base de biologa molecular. Extraccin de cidos nucleicos, RT-PCR). Los resultados que esperamos es la identificacin del fragmento del gen de inters, mediante geles de agarosa. Medir la semicuantificacin de la expresin de un gen.

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Marco terico

ADN (cido desoxirribonucleico) Es un tipo de cido nucleico, una macromolcula que forma parte de todas las clulas. Contiene la informacin gentica usada en el desarrollo y el funcionamiento de los organismos vivos conocidos y de algunos virus, y es responsable de su transmisin hereditaria. El ADN es un polinucletido, constituido por muchos nucletidos; y cada nucletido, est formado por un azcar (la desoxirribosa), una base nitrogenada (adeninaA, timinaT, citosinaC o guaninaG) y un grupo fosfato. Lo que distingue a un nucletido de otro es la base nitrogenada, y por ello la secuencia del ADN se especifica nombrando slo la secuencia de sus bases. La disposicin secuencial de estas cuatro bases a lo largo de la cadena es la que codifica la informacin gentica. En los organismos vivos, el ADN se presenta como una doble cadena de nucletidos, en la que las dos hebras estn unidas entre s por unas conexiones denominadas puentes de hidrgeno. Los extremos de cada una de las hebras del ADN son denominados 5P (fosfato) y 3OH (hidroxilo) en la desoxirribosa. Las dos cadenas se alinean en forma paralela, pero en direcciones inversas (una en sentido 5 3 y la complementaria en el sentido inverso), pues la interaccin entre las dos cadenas est determinada por los puentes de hidrgeno entre sus bases nitrogenadas. Se dice, entonces, que las cadenas son antiparalelas.

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Dentro de las clulas, el ADN est organizado en estructuras llamadas cromosomas que, durante el ciclo celular, se duplican antes de que la clula se divida. Replicacin de ADN: proceso por el cual se obtienen copias idnticas de una molcula de ADN. La replicacin es fundamental para la transferencia de la informacin gentica de una generacin a la siguiente y es la base de la herencia. El mecanismo consiste en la separacin de las dos hebras de la doble hlice, las cuales sirven de molde para la posterior sntesis de cadenas complementarias a cada una de ellas. El resultado final son dos molculas idnticas a la original. Este tipo de replicacin se denomina semiconservativa debido a que cada una de las dos molculas resultantes de la duplicacin presenta una cadena procedente de la molcula "madre" y otra recin sintetizada. El Proceso de replicacin es complejo y en el intervienen una serie de enzimas. Existen sitios especficos donde comienza la replicacin denominados orgenes de replicacin. Cuando comienza se forma una burbuja de replicacin que contiene dos horquillas. Un breve resumen de las enzimas que participan y como lo hacen: las enzimas DNA polimerasa encargadas de la adicin de nucletidos por complementariedad, la helicasa que abre la horquilla, la RNA polimerasa que es quien comienza la replicacin ya que puede unir dos nucletidos libres y forma un pequeo fragmento de ARN, que luego es removido

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por una exonucleasa y la DNA polimerasa lo reemplaza por ADN, sellando el eje azcar fosfato mediante la ligasa.

Transcripcin y traduccin de ARN: en un gen, la secuencia de nucletidos a lo largo de una hebra de ADN se transcribe a un ARN mensajero (ARNm). Para que la informacin que contiene el ADN pueda ser utilizada por la maquinaria celular, debe copiarse en primer lugar en una secuencia de nucletidos, ms cortos y con unas unidades diferentes, ARN. Las molculas de ARN se copian exactamente del ADN mediante un proceso denominado transcripcin. La transcripcin es el proceso por el cual se sintetiza un ARN usando como molde una cadena de ADN. Adems el ARNm sufre modificaciones luego de ser transcrito como la adicin del Cap y la cola poly A. El proceso en el cual se eliminan los intrones y empalman los exones se denomina SPLICING. Luego, esta secuencia se traduce a una protena que un organismo es capaz de sintetizar o "expresar" en uno o varios momentos de su vida, usando la informacin de la secuencia. La relacin entre la secuencia de nucletidos y la secuencia de aminocidos de la protena viene determinada por el cdigo gentico, que se utiliza durante el proceso de traduccin o sntesis de protenas. Fases de la sntesis de protenas: Fase de activacin de los aminocidos: mediante la enzima aminoacil-ARNt-sintetasa y de ATP, los aminocidos pueden unirse ARN especfico de transferencia, dando lugar a un aminoacil-ARNt. En este

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proceso se libera AMP y fosfato y tras l, se libera la enzima, que vuelve a actuar. Inicio de la sntesis proteica: el ARN se une a la subunidad menor de los ribosomas, a los que se asocia el aminoacil-ARNt. A este grupo, se une la subunidad ribosmica mayor, con lo que se forma el complejo activo o ribosomal. Elongacin de la cadena polipeptdica: el complejo ribosomal tiene dos centros o puntos de unin. El centro P o centro peptidil y el centro A. El radical amino del aminocido iniciado y el radical carboxilo anterior se unen mediante un enlace peptdico y se cataliza esta unin mediante la enzima peptidil-transferasa. As, el centro P se ocupa por un ARNt carente de aminocido. Seguidamente se libera el ARNt del ribosoma producindose la translocacin ribosomal y quedando el dipeptil-ARNt en el centro P. Al finalizar el tercer codn, el tercer aminoacil-ARNt se sita en el centro A. A continuacin se forma el tripptido A y despus el ribosoma procede a su segunda translocacin. Este proceso puede repetirse muchas veces y depende del nmero de aminocidos que intervienen en la sntesis. Finalizacin de la sntesis de protenas: aparecen los tripletes sin sentido, tambin conocidos como codones stop. Estos tripletes son tres: UGA, UAG y UAA. No existe ARNt tal que su anticodn sea complementario. Por ello, la sntesis se interrumpe y esto indica que la cadena polipeptdica ha finalizado.

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El flujo de la informacin dentro de la clula. En 2957, Francis Crick dio una conferencia en la Sociedad Britnica de Biologa Experimental en la que estableci el Dogma Central de la Biologa, el cual establece que la informacin puede fluir de un cido nucleico a una protena pero no de una protena a otra protena, ni de una protena a un cido nucleico. PROPUESTA INICIAL DE CRICK (1970) Replicacin DNA protenas Transcripcin Traduccin RNA

Dogma fue una denominacin poco acertada, porque un dogma se refiere a una premisa que no se pone en duda y la ciencia justamente se caracteriza por ser un proceso de cuestionamiento permanente. Pero el trmino persisti. Despus de haber publicado su teora, Crick fue criticado por usar la palabra dogma. l mismo reconoci que hubiera sido ms adecuado llamarla hiptesis central. De cualquier manera, desde su formulacin, se ha visto que, con algunas excepciones, el dogma generalmente se cumple. Pero, en el mundo biolgico las excepciones suelen ser muy significativas y reveladoras de la complejidad y multiplicidad de los procesos vitales. Una de esas excepciones fue revelada en 1962 por el virlogo estadounidense Howard M. Temin, quien descubri que en algunos virus que contienen ARN como material gentico se produce DNA a partir de ARN. Temin y otros investigadores, aislaron la enzima capaz de revertir el sentido del flujo de informacin postulado por el dogma; y fue llamada transcriptasa inversa. MODIFICACION POSTERIORES Replicacin Transcripcin Replicacin Traduccin

FQByF - Biologa General y Celular ADN Protena Transcripcin Inversa

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Retrotranscripcin. Es un proceso de la biologa molecular que implica la generacin de una cadena de cido desoxirribonucleico (ADN) de doble cadena a partir de un cido ribonucleico (ARN) de cadena simple. La clave es la transcriptasa inversa o retrotranscriptasa; descrita por vez primera en virus de la familia Retroviridae de forma independiente por los investigadores Howard Temin y David Baltimore en 1970,su descubrimiento supuso la primera evidencia de la falsedad del dogma central de la biologa molecular. La transcriptasa inversa, transcriptasa reversa o retrotranscriptasa es una enzima de tipo ADN-polimerasa, que sintetiza ADN de doble cadena utilizando como molde ARN monocatenario, sea cataliza la retrotranscripcin o transcripcin inversa. Esta enzima se encuentra presente en los retrovirus. Su nombre obedece a que el proceso normal de la transcripcin, la que se puede llamar "directa", codifica el ARN a partir de la secuencia inicial de ADN, y no al revs. Una forma sencilla de sntesis de ADN de doble cadena a partir de transcriptasa inversa, tambin llamada ADN/ARN-polimerasa dirigida, sera partir de un cebador cola de poli-T que establecera bases complementarias con la cola de poli-A del ARN transcrito de la hebra que se va a sintetizar, lo que forma un hbrido ARN/ADN. Dicho hbrido podra separarse mediante ribonucleasas, y despus, con la accin de una ADN-polimerasa y un nuevo cebador, ser completada la hebra de ADN de doble cadena. En la biologa molecular y la bioqumica, la transcriptasa inversa, tambin conocida como ADN polimerasa dependiente de ARN, es una enzima ADN polimerasa que transcribe una sola cadena de ARN en una sola cadena de ADN. Tambin ayuda en la formacin de una doble hlice de ADN una vez que el ARN ha experimentado una transcripcin inversa en una sola cadena de cDNA. La transcripcin inversa implica la sntesis de ADN a partir del ARN. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) La reaccin en cadena de la polimerasa, es una tcnica de biologa molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mnimo. Esta tcnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificacin resulta mucho ms fcil

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identificar con una muy alta probabilidad virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadveres) o hacer investigacin cientfica sobre el ADN amplificado. La PCR puede efectuarse como una tcnica de punto final, como una herramienta de generacin del ADN deseado, o como un mtodo continuo, en el que se evale dicha polimerizacin a tiempo real. Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recin formadas entre s tras cada fase de replicacin y, a continuacin, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas. La reaccin en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por Kary Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California SA, en la dcada de 1980. Inicialmente la tcnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (95 C en las fases de desnaturalizacin del ADN) suponen la inmediata desnaturalizacin de toda protena, se emplean ADN polimerasas termoestables, extradas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayora de los seres vivos. Dichos microorganismos son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus termophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer correccin de errores (Pfu, Vent). Hoy, todo el proceso de la PCR est automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reaccin para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reaccin (muchos termocicladores modernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos simplemente invirtiendo la corriente elctrica). Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad trmica, permitiendo que se alcance rpidamente el equilibrio trmico. Casi todos los termocicladores tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensacin sobre los tubos de reaccin.

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Termociclador: aparato en el que se efecta la PCR convencional. Por lo general, la PCR es una tcnica comn y normalmente indispensable en laboratorios de investigacin mdica y biolgica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonacin de ADN para la secuenciacin, la filogenia basada en ADN, el anlisis funcional de genes, el diagnstico de trastornos hereditarios, la identificacin de huellas genticas (usada en tcnicas forenses y test de paternidad) y la deteccin y diagnstico de enfermedades infecciosas. Para realizar la tcnica se necesitan: Los 4 desoxirribonuclesidos-trifosfato (dNTP), sustratos para polimerizar nuevo ADN.

Dos cebadores o primers (reverse y forward) oligonucletidos que son (cada uno) complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y cuarenta nucletidos, normalmente de 18 a 22, que permiten que la polimerasa inicie la reaccin. Deben estar situados enfrentados y a no mucha distancia. Delimitan la zona de ADN a amplificar, es decir, corresponden a los nucletidos que definen los extremos de la secuencia que se desea replicar.

Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado comnmente como cloruro de magnesio (MgCl2), o algn otro catin divalente. Tambin se puede emplear manganeso (Mn2+), para mutagnesis de ADN mediante PCR, ya que altas concentraciones de Mn2+ incrementan la tasa de error durante la sntesis de ADN. Actan como cofactores de la polimerasa.

Iones monovalentes, como el potasio.

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Una solucin tampn (buffer) que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa. ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura ptima alrededor de 70 C (la ms comn es la polimerasa Taq).

ADN molde, que contiene la regin de ADN que se va a amplificar.

Termociclador, el aparato que va a mantener la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman un ciclo.

Agua libre de nucleasas.

El proceso de PCR consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de temperatura, ciclos; cada ciclo consiste en 3 pasos a diferentes temperaturas. Los pasos de ciclos estn precedidos por un choque trmico ("hold") a alta temperatura (> 90 C), y seguido por otro hold al final del proceso para la extensin de producto final. Inicio: se lleva la reaccin hasta una temperatura de 94-96 C, que se mantiene durante 1-9 minutos (esto slo es necesario para ADN polimerasas que requieran activacin por calor). Desnaturalizacin: se desnaturaliza el ADN (se separan las dos hebras de las cuales est constituido). El modo ms habitual de realizar este paso es el calentamiento (94-95 C) de la muestra. Alineamiento o unin del cebador: luego se producir la hibridacin del cebador, el cual se unir a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para esto es necesario bajar la temperatura a 40-68 C durante 20-40 segundos, permitiendo as el alineamiento. Los puentes de hidrgeno estables entre las cadenas de ADN (unin ADN-ADN) slo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el hbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarn como lmites de la regin de la molcula que va a ser amplificada. Extensin o elongacin de la cadena: acta la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la sntesis de

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nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde aadiendo los dNTP complementarios en direccin 5' 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). Para la polimerasa Taq, la temperatura de mxima actividad est en 7580 C (comnmente 72 C). El tiempo de extensin depende de la ADN polimerasa usada y de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar. Elongacin final: etapa nica que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 C durante 5-15 minutos tras el ltimo ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado. Conservacin: se lleva a cabo a 4-15 C durante un tiempo indefinido para conservar la reaccin a corto plazo. Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se emplean tcnicas de electroforesis, que separan los fragmentos de ADN generados de acuerdo a su carga, (longitud) y a su tamao: tpicamente se emplean la electroforesis en gel de agarosa, para fragmentos grandes. Los tamaos de los productos de la PCR estn determinados por un marcador de peso molecular de ADN, que contiene fragmentos de ADN de tamao conocido, y que se corre en el gel junto con los productos de PCR. Tipos de PCR PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR): es una variante de la PCR en la que usamos ARN como molde inicial en vez de ADN, y emplea una transcriptasa inversa para realizar la sntesis de un ADN complementario al ARN (ADNc). De esta forma, el desarrollo inicial de una RT-PCR sera: 1er paso: retrotranscripcin a partir del ARN (el ARN es transcrito a cDNA utilizando la transcriptasa inversa)

2 paso: amplificacin a partir de la primera hebra de ADNc. 3er paso: PCR estndar.

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Procedimiento: RT-PCR utiliza un par de cebadores que son complementarios a una secuencia definida en cada una de las dos hebras del DNA. El primer paso es la transcripcin reversa (RT), en los que el ARN es transcrito a cDNA utilizando la transcriptasa inversa. Este paso es muy importante para llevar a cabo la polimerizacin en cadena de la polimerasa de ADN, que slo puede actuar sobre el ADN molde. El paso de RT se puede realizar en el mismo tubo de PCR o en uno separado con una temperatura entre 40 C y 50 C, dependiendo de las propiedades de la transcriptasa inversa utilizada.

El siguiente paso consiste en la desnaturalizacin del ADN de doble cadena a 95 C, por lo que las dos acciones distintas y los primers pueden unirse de nuevo a temperaturas ms bajas y comenzar una reaccin en cadena de nuevo. Entonces, la temperatura disminuye hasta llegar a la temperatura de hibridacin que puede variar dependiendo de la configuracin de los cebadores utilizados, su concentracin y los cationes de concentracin. La principal consideracin al elegir la temperatura de hibridacin ptima es la temperatura de fusin (Tm) de los cebadores.

El paso final de amplificacin por PCR del ADN es la extensin de los cebadores. Esto se hace con termoestable Taq polimerasa de ADN, por lo general a 72 C, la temperatura a la que la enzima funciona ptimamente. La duracin de la incubacin en cada temperatura, las alteraciones de temperatura, y el nmero de ciclos son controlados por un termociclador programable. El anlisis de los productos de PCR depende del tipo de la PCR aplicada. Si una PCR convencional se utiliza, el producto de PCR se detecta mediante electroforesis en gel de agarosa y bromuro de etidio (o de cido nucleico otras manchas).

RT-PCR (reaccin en cadena de la polimerasa de transcripcin inversa) Es un mtodo sensible para la deteccin de los niveles de expresin del ARNm. Tradicionalmente la RT-PCR de dos pasos: la reaccin de RT y la amplificacin por PCR. ARN es la primera transcripcin inversa en cDNA utilizando una transcriptasa inversa, el ADNc resultante se utiliza como plantilla para la amplificacin de PCR posterior con iniciadores especficos para uno o ms genes. RT-PCR tambin se puede realizar

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como RT de un solo paso PCR en el que todos los componentes de la reaccin se mezclan en un tubo antes de comenzar la reaccin. RT-PCR es una variante de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), una tcnica de laboratorio de uso general en biologa molecular para generar muchas copias de un ADN de secuencia, un proceso llamado "amplificacin". En RT-PCR, sin embargo, una cadena de ARN es la primera transcripcin inversa en su ADN complementario (ADNc) utilizando la enzima transcriptasa inversa , y el ADNc resultante es amplificada por PCR tradicional o la PCR en tiempo real . PCR de transcripcin inversa no se debe confundir con la reaccin en cadena de polimerasa en tiempo real (Q-PCR/qRT-PCR), que tambin es a veces abreviado como RT-PCR. Existe un mayor riesgo de contaminacin cruzada de las muestras ya que la deteccin del producto de PCR requiere el tratamiento posterior a la amplificacin de las muestras. Por otra parte, la especificidad de la prueba est determinada principalmente por los iniciadores, lo que puede dar resultados falsos positivos. Sin embargo, la cuestin ms importante sobre RT-PCR convencional es el hecho de que se trata de un semi o incluso una tcnica de bajo cuantitativos, mientras que la amplificacin se puede visualizar slo despus de la amplificacin de los extremos. Espectrofotometra de cidos nucleicos Los dobles enlaces conjugados de las bases nitrogenadas hacen que los cidos nucleicos (AN) absorban luz ultravioleta (UV). El espectro de absorcin caracterstico de AN presenta un mximo a ~ 260 nm. Si bien el coeficiente de extincin de un AN en particular depende de la secuencia de nucletidos, algunas reglas empricas permiten estimar la concentracin a partir del valor de A260. As, una unidad de absorbancia a 260nm corresponde aproximadamente a una concentracin de 50 g/ml de ADN doble hebra, 40 g/ml de ARN o 33 g/ml de fragmentos cortos de ADN monohebra (oligodesoxinucletidos). En las preparaciones de AN, son frecuentes las impurezas de naturaleza proteica. Dado que los aminocidos aromticos (Phe, Tyr, Trp) absorben luz UV, la presencia de protenas lleva a sobrestimaciones de la concentracin de AN. Dado que el mximo de absorbancia de las protenas se encuentra en ~ 280 nm, es posible estimar el grado de impurezas de origen proteico a partir del cociente A260/A280. La presencia de protenas en la muestra har que el cociente A 260/A280 sea menor que

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el esperado para cidos nucleicos puros. Para el ADN doble hebra en soluciones de alta pureza se espera A260/A280 1.8, y para ARN, A260/A280 2.0.

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Experiencia de Laboratorio Da 1 (sbado 28 de mayo): Obtencin y procesamiento de la muestra. Anestesiamos un rata macho de 70 gr. de un mes y un da de vida, mediante una inyeccin intramuscular en el musculo abdominal. La anestesia era una mezcla de aproximadamente 170 ml (1oo ml de ketamina por 30 ml de xilacina). Dicha mezcla est aprobada. (Realizado por los profesores a cargo). Para asegurarnos que el animal estaba completamente anestesiado, con una pinza le apretbamos la patita y no tena que tener ningn tipo de reflejo la rata. Ya anestesiado, abrimos el animal por la cavidad abdominal, y retiramos cuidadosamente tres rganos: corazn, hgado e intestino. El corazn es el ltimo rgano en retirar. Con muchsimo cuidado de no romper el pncreas, ya que contiene RNasas que destruiran el ARN que necesitamos. (Realizado por los profesores a cargo) Para extraer las muestras no es necesario que la rata est en ayuno, y no se debe matar el animal antes de retirar los rganos porque sino se degradara el ARN (es muy inestable) y nosotros lo necesitamos intacto. Al retirar los rganos, los lavamos con solucin Ringer para mantener el equilibrio osmtico y as no se daen nuestras muestras. En el caso del intestino, tuvimos que lavarlo por dentro con sta solucin, para as eliminar todo desecho que contenga dentro (sobre hielo). (Realizado por los profesores a cargo) Luego, colocamos las muestras en 4oo l de solucin RNAlater (Ambion) durante 24 hs. Durante el aislamiento y almacenamiento del mismo, debe tenerse mucho cuidado para impedir que lo degraden las RNasas. Por eso se las incuba en sustancias que contengan inhibidores de las RNasas como el RNAlater. RECOMENDACIONES. * Trabajar con guantes lavados previamente con alcohol 70.

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Las pipetas a utilizar tambin las lavamos con alcohol 70. Todo el material a utilizar debe estar esterilizado.

* Todos los materiales que usamos para extraer y contener las muestras, se limpian con solucin Ringer. * Para contener las muestras se utilizan tubos eppendorf, los cuales son libres de DNasas, RNasas. * Las muestras se conservan a 4 C, en hielo granizado.

* Se recomienda trabajar a aproximadamente 15 cm de fuego, para que el aire sea estril. * Los tips utilizados en las pipetas deben estar totalmente esterilizados, y slo se utilizan una sola vez y luego son desechados. Da 2 (lunes 30 de mayo): Obtencin del ARN y medicin de la absorbancia. Homogeneizacin: durante la homogeneizacin el Trizol mantiene la integridad del ARN. El trizol (guanidin tiocianato-fenol-cloroformo) desnaturaliza protenas hacindolas insolubles en la preparacin. Procedimos a retirar con una pipeta el RNAlater colocado anteriormente. Luego, le agregamos a las muestras 800 l de Trizol por 50-100mg de tejido; y realizamos la homogeneizacin de las mismas mediante un homogeneizador. Una vez que las homogeneizamos, las dejamos incubar a las muestras por 5 minutos a temperatura ambiente, y as permitimos que acte el Trizol. Se rompieron todas las grasas que contengan las muestras y los complejos nucleoproteicos. Despus, centrifugamos los tejidos en una centrifuga refrigerada a 4 C durante 10 minutos a 12000 g, y as removimos detritos. Mediante este proceso los residuos orgnicos hacia el fondo de los eppendorf, y as pudimos extraer y transferir una cantidad aproximada de 800l del sobrenadante obtenido a un eppendorf limpio. Separacin de fases:

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En el nuevo eppendorf que contiene el sobrenadante obtenido en el paso anterior, le agregamos 200 l de cloroformo a cada tubo, bajo campana (para cargar la pipeta levantamos y soltamos varias veces, para que cargue. Luego lo colocamos en el eppendorf). Y agitamos vigorosamente por 15 segundos; y as conseguimos que nuestras muestras se separen en 3 fases: acuosa, interfase y orgnica. A esto, lo dejamos incubar por 2-3 minutos a temperatura ambiente y luego lo centrifugamos por 15 minutos a 12,000 g a 4C.

Precipitacin del ARN: la mayor parte de ARN se extrae de la fase acuosa, pues permanece soluble en la fase superior de cidos acuosos debido a la presencia del grupo oxidrilo en su carbono 3, que lo hace mas soluble que el DNA, que se encuentra en la interfase o en la fase orgnica (inferior) junto con las protenas. Entonces, transferimos 400 l de la fase acuosa (fase superior) con la pipeta, sin levantar nada de la interfase ni fase orgnica; si creemos que tomamos algo que no sea fase acuosa, lo volvemos. Y lo transferidos a un nuevo eppendorf. A esto le agregamos 0,5ml de isopropanol a cada tubo para que precipite el ARN (deshidrata el RNA). Mezclamos por inversin, y observamos una turbulencia (la hebra de ARN). Seguidamente, dejamos incubar por 10 minutos a temperatura ambiente, luego centrifugamos a 12,000 x g por 10 minutos a 4C. El ARN form un pellet. Lavado de ARN: Se desecha el sobrenadante que contiene las protenas. Lavamos el pellet de ARN formado con alcohol 75% en agua tratada con DEPC. Luego, separamos el pellet con pequeos golpes y por ltimo centrifugamos las muestras a 7500 g por 5 minutos a 4C. Este proceso se repite 3 veces para conseguir un pellet bien limpio. El ARN puede ser almacenado en alcohol a -70C por meses.

FQByF - Biologa General y Celular Redisolver el ARN:

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Procedimos a remover el sobrenadante y lo dejamos secar al aire. SIN PERDER EL PELLET. Y luego, lo redisolvimos en 50l de agua libre de nucleasas (el corazn, como obtuvimos menor cantidad de ARN, lo disolvimos en 40 l). Determinacin de la concentracin del ARN y su pureza: es esencial que las todas las muestras del anlisis tengan grados de pureza (A260/280) e integridad (28S/18S) comparables. Realizamos una dilucin 1/10 de ARN de la muestra del corazn y una dilucin 1/100 del intestino y del hgado. Luego, diluimos en agua libre de nucleasas. Medimos el blanco y despus pipeteamos con una micro pipeta el RNA diluido en un ampliquant (que mide la absorbancia), y as medimos la absorbancia a 260nm (presencia de nucletidos) y 280nm (presencia de protenas). Y de la relacin de abs 260/abs 280, calculamos la pureza de cada muestra. Una buena pureza debe dar 1,7-2 Si la pureza nos da un resultado mayor a 2 es porque las muestras estn contaminadas con protenas. En caso que nos de menor a 2, es porque estn contaminadas con ADN. Estos son nuestros resultados sobre las absorbancias y la pureza de las muestras. Muestra Corazn Hgado Intestino Abs 260 0,694 1,606 2,287 Abs 280 0,377 0,937 1,343 Dilucin 1/10 1/100 1/100 Pureza 1,840 1,713 1,102

Luego, calculamos la concentracin de ARN en la muestra: [ARN ug/mL]= fd x 40 x 10/3 x Abs 260 1000

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Corazn= 10 x 40 x 10/3 x o,694 = 0,935 g / mL 1000 Hgado= 100 x 40 x 10/3 x 1,606 = 21,41 g / mL 1000 Intestino= 100 x 40 x 10/3 x 2,287 = 1000 Da 3 (sbado 4 de junio): Retrotranscripcin y PCR. Ya que las concentraciones de las muestras que se obtuvieron no eran las esperadas, trabajamos sin desoxirribonucleasa 1. Se realiz una RT mix: Buffer 10X RT (MMLV) Agua libre de nucleasas dNTPS 2 L 1 L 6 L 1 L 30,49 g / mL

Estas cantidades se multiplicaron por la cantidad de muestras N= 4 (tres muestras y se le suma 1 por un margen de error) por lo que nuestro volumen final sera:
* * * *

Buffer 10X : 8 L RT (MMLV) :4 L Agua libre de nucleasas: 24 L dNTPS: 4 L

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Se procedi a realizar un control negativo, en el cual se utilizaron las mismas cantidades, pero se retir la RT y se agreg 1 L de agua. La cantidad de las muestras eran dos, un control perteneciente a cada comisin. Las muestras ms el margen nos da un total de N= 3 por lo que la RT mix del control negativo tiene los siguientes componentes: *
* *

Buffer 10X: 6 L Agua libre de nucleasas: 21 L dNTPS: 3 L

Se llev 10 minutos a bao mara a 70C, se suben y se bajan las temperaturas con el fin de que los oligos se apareen mejor y evitar los pliegues. Se utiliz un tubo con tapa circular con el fin de que no condensara en las paredes. Control negativo: es un control que no tiene que dar nada. Se saca la RT (mmlv) y se le agrega 1 L de agua. Si se ve en el gel de agarosa significa que las muestras estn contaminadas con ADN. Se tenan 3 muestras ms el control negativo, N=4. Se hacen diluciones 1 /5 de esas muestras. Se dividen en dos, sacas 10 L para los genes de inters (21laudina 2 y 21laudina 12) y 10 L para los genes de referencia EEF1A1. De esos 4 ahora te quedan 8. Luego se realizamos la PCR mix: Buffer 10X dNTPS Agua libre de nucleasas Taq MgCl2 3,5 L 0,28 L 15,01 L 0,11 L 2,1 L

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Al tener 8 tubos ms el margen de error N=9, las proporciones quedaran:

o o o o o

Buffer 10 X: 31,5 L dNTPS: 2,52 L agua libre de nucleasas: 135,09 L TAQ: 0,99 L Cloruro de magnesio: 18,8 L

Luego de agregar esto a cada tubo, se hizo la disolucin del primer: 1,25 L del primer ms 18,78 L de agua libre de nucleasas, quedndote un total 20,03 L. En cada tubo donde se puso la PCR mix, se le agregaba un primer forward en un lado del tubo, y el reverse del otro con el fin de que no polimericen entre s. Eso se llev al termociclador minutos a las temperaturas necesarias para la PCR; el mismo termociclador regula las temperaturas y cuando termina las mantiene al final a una temperatura constante de 4C. Da 4 (lunes 6 de junio): Corrida en gel de agarosa y discusin de los datos. Premisas para armar el informe. Colocamos el gel de agarosa al 2,5 %, buffer TBE 0.5X y se le agregamos 1 L de gel red, (termo resistente). Se recomienda agregarlo durante la preparacin del gel ya que de esta forma permite ver las bandas con mayor intensidad que si se agregara al final. Esta preparacin la calentamos hasta que el gel de agarosa tiende a derretirse (tiene un bajo punto de fusin). Cuando su temperatura baja, lo colocamos sobre la cama de la cuba. Previamente a cada tubo que contiene las muestras, le colocamos dos L de loading buffer 6X, el cual le da un peso a la muestra permitiendo que luego por electroforesis se dirija a un polo. El loading buffer est compuesto por sacarosa, agua destilada y azul de bromo fenol (en una cantidad de punta del tip) el cual es inocuo.

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Una vez preparado el gel, lo colocamos sobre la cama y dejamos pasar unos 10 minutos para que polimerice y le agregamos un peine para que nos marcara los surcos en donde sembramos las muestras. El peine utilizado contena 15 surcos. Una vez que polimeriz, retiramos el peine y le agregamos el buffer TBE que permite que la corriente pase. Se recomienda colocarlo antes de sembrar las muestras ya que no se corre el riesgo de que si se agrega despus levante las muestras ya sembradas. Por lo general, el buffer TBE utilizado para la preparacin del gen es un buffer nuevo y el que se utiliza sobre la cama esta reciclado. A las muestras las agregamos de a una en los diferentes surcos que dej el peine; cargando la muestra en la pipeta, lo resuspendamos y luego lo colocbamos en los surcos. Con las muestras en su lugar, realizamos la electroforesis por 90 minutos a un voltaje constante de 50mV/cm.

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Resultado obtenido en gel de agarosa. We ll 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 B12 1 3 1 4 1 5

M W

4contr
ol

5contr
ol

6contr
ol

Bcontrol

MW: marcador de peso molecular. Muestra 4: corazn. Muestra 5: hgado. Muestra 6: intestino. (El well 7 se dej vaco porque no se arm bien)

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Conclusin. Al observar el resultado del gel de agarosa, podemos identificar que nuestras muestras estn contaminadas con ADN genmico. De esto nos damos cuenta, ya que el control negativo no debera verse en el gel, porque no se le realiz la RT. Los well 3 y 4 (correspondientes a la muestra del tejido del corazn) dieron bastante bien. Los well 5 y 6, dieron totalmente contaminados. Y los well 8 y 9 (del intestino) tambin nos dieron relativamente bien. Lo que observamos en la imagen, es que esos puntitos por todos lados es contaminacin de ADN; y debajo son los desechos de primer utilizados durante el procedimiento. No podemos cuantificar contaminado con ADN. la expresin de ADNc, porque est

ADN amplificado

de ADN genmico. de ARN de las muestras.

Igual, este laboratorio fue realizado para poder observar estas bandas. Su intensificacin, y eso lo pudimos observar; solamente que no podemos cuantificarlo porque est contaminado con ADN. Los resultados no fueron los esperados porque no seguimos con las normas recomendadas para trabajar con ARN, ya que a modo de aprendizaje pipetebamos los alumnos, hablbamos mientras realizbamos la experiencia, nos movamos de un laboratorio a otro, y eso produce contaminacin.

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Glosario Absorbancia 260: el estado fsico de los cidos nucleicos est relacionado con su capacidad de absorcin de la luz ultravioleta (UV) a 2.600 . El menor grado de absorcin se produce en estado de doble hlice, la absorcin aumenta cuando se produce la desnaturalizacin pasando a estado de hlice sencilla (efecto hipercrmico, aumento de la absorbancia) y, por ltimo, si degradamos este ADN de hlice sencilla a nivel de nucletidos libres, de nuevo aumenta la absorbancia. Por tanto, la absorbancia a 2.600 se puede utilizar como una medida del estado fsico de la molcula de ADN. Las curvas de fusin tienen forma de S observndose un aumento brusco de la absorbancia al llegar a una temperatura determinada, la temperatura de fusin. Absorbancia 280: La mayora de protenas presenta un mximo de absorbancia a 280 nm, debido a la presencia de aminocidos aromticos (tirosina, triptofano y fenilalanina). La absorbancia a 280 nm puede usarse para medir protenas en concentraciones entre 0.1 y 0.5 mg/ml, en la ausencia de sustancias que interfieran con la lectura. Algunas preparaciones de protenas parcialmente purificadas pueden tener cidos nucleicos, los cuales tienen un mximo de absorcin a 260 nm. Una ecuacin para calcular la concentracin de protena en la presencia de cidos nucleicos en cubetas de 1 cm de paso es: (protena)mg/ml = 1.55 A280nm - 0.76 A260nm. La ecuacin fue derivada para enolasa (A280/A260 = 1.75) en la presencia de cido nucleico de levadura (A280/A260 = 0.49) y por tanto puede no ser precisa para otras protenas y otros cidos nucleicos. La absorbancia a 280 nm de una solucin de protena 0.1% (p/v) vara entre 0.5 y 2.5, dependiendo de la proporcin de aminocidos aromticos que contengan. ADNc: sinnimo de ADN complementario o copia de ADN. Puede ser monocatenario o bicatenario. ADNc es ADN sintetizado a partir de un ARNm maduro en una reaccin catalizada por la enzima es transcriptasa inversa y la enzima ADN polimerasa. Este proceso se denomina transcripcin inversa (RT) o la primera lnea de la sntesis de ADNc. El propsito de la conversin de RNAm a ADNc es para el anlisis de la plantilla de ARNm porque el ADN es mucho ms estable que el ARN. Una vez que ARNm se convierte en DNA, la DNA se puede utilizar para la RTPCR, como punta de prueba para el anlisis de expresin y para la clonacin de la secuencia del ARNm. Cuando los cientficos quieren

FQByF - Biologa General y Celular expresar una determinada protena expresan esta protena (heterloga que codifica para la protena de la producida por retrovirus (como el Inmunodeficiencia , etc), que est provirus.

Michel Mara Cecilia en una clula que normalmente no expresin), que trasladar el cDNA clula receptora. DNAc tambin es VIH-1 , VIH-2 , Simian Virus de la integrado en su sede de crear un

Agua DEPC: es til en biologa molecular, particularmente cuando se va a trabajar con RNA. El trmino DEPC significa Dietilpirocarbonato, y es una sustancia qumica que elimina Ribonucleasas, enzimas capaces de degradar el RNA. Se prepara adicionando el compuesto DEPC, 0.01 ml por cada 100 ml de agua. Con el agua DEPC puedes disolver RNA aislado de cualquier tejido, pues esta agua ya no tendra ribonucleasas que degraden el RNA. Agua libre de nucleasas: (H2O + C6H10O5) tambin llamada agua estabilizada, oxido de dihidrgeno estabilizada, dihidrgeno oxido estabilizada. Liquido, incoloro, transparente e indoloro. Con pH 7, su densidad 1.0 kg/L aproximadamente a 20C, completamente soluble en agua. Cebadores primers: secuencias cortas de nucletidos 20-24 nucletidos de longitud, complementarias a una regin del DNA que se quiere amplificar. Centrfuga: mquina que pone en rotacin una muestra para separar por fuerza centrfuga sus componentes o fases (generalmente una slida y una lquida), en funcin de su densidad. Una aplicacin tpica consiste en acelerar el proceso de sedimentacin, dividiendo el plasma y el suero en un proceso de anlisis de laboratorio. DNasa I: Enzima que es capaz de hidrolizar el ADN altamente polimerizado quebrando los enlaces fosfodister, preferencialmente adyacentes a un nucletido de pirimidina. Cataliza la segmentacin endonucleoltica del ADN dando lugar a los productos finales 5'-fosfodi- y oligonucletido. La enzima tiene preferencia por el ADN de cadena doble. dNTPs: nucletidos fosfatados. stos son la materia prima del DNA. Literalmente son los "ladrillos" para construir una hebra de acido nucleico. La polimerasa toma estos dNTPs y los va organizando sobre una cadena

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de hexosas (desoxiribosa en el DNA), en una secuencia determinada. La amplificacin mediante PCR se hace de manera exponencial. Es decir, siempre doblo la cantidad anterior de fragmentos x que desnaturo las dos hebras. Eppendorf: tubo de microcentrfuga, pequeo contenedor cilndrico de plstico, con un fondo cnico y una tapa unida al cuerpo del tubo para evitar su desprendimiento. Son empleados profusamente en biologa molecular y bioqumica para la centrifugacin, y se emplean a menudo como simples viales contenedores de sustancias qumicas. Los tubos estn fabricados de polipropileno, y pueden emplearse a temperaturas muy bajas (-20 C) o con disolventes orgnicos como el cloroformo. Su tamao oscila entre los 200 L y los 2 mL. La capacidad ms comnmente usada es de 1,5 mL, siendo por otra parte los de 200 l los ms empleados para PCR. La desinfeccin de los tubos es posible (1 atm, 120 C, 20 minutos), pero dado su bajo costo y la dificultad de limpieza de la superficie de plstico, los tubos de microcentrfuga son usualmente desechados despus de su uso. Ketamina: es un anestsico general veterinario, fuerte, con propiedades analgsicas. Bloquea el sistema nervioso sin deprimir el sistema respiratorio ni el circulatorio. Es una arilciclohexidina, relacionada qumicamente con la fenciclidina y ciclohexamina. La ketamina trabaja adhirindose a estos receptores principalmente el receptor PCP (PHENCYCLIDINE) y bloquendolos. Se elimina por orina sin metabolizar un 4% y un 17% en forma hidroxilada. En los tejidos permanece parte del frmaco, lo cual puede contribuir a su acumulacin cuando se da en dosis repetidas o infusin continua. La ketamina provoca una sensacin de que la mente ha sido separada del cuerpo. El tacto es excepcional y supersensorial. Esto crea alucinaciones y experiencias "fuera del cuerpo" de 2 a 3 horas. El estado anestsico que produce se caracteriza por un estado de analgesia profunda, perdida de la conciencia y reflejo normal de la faringe y laringe. Durante este tiempo, podes ser incapaz de moverte. Varias dosis puede crear problemas respiratorios y fallo en el corazn. La ketamina es MUY PELIGROSA si es mezclada con alcohol u otras drogas. Una sobredosis de Ketamina te anestesiar por completo, 10 mg. por libra de peso es una dosis prcticamente suicida porque incluso puede paralizar el sistema respiratorio si se combina con alcohol o barbitricos de cualquier tipo.

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Oligo-dT: DNA sintetico compuesto por 15 nucleotidos de base timina. Es complementario a la terminacin poliadelinada presente en el RNAm de organismos eucariotas. Se utiliza como primer universal para la transcripcin reversa. Pellet: en los procesos de centrifugado, se denomina "pellet" al material sedimentado. Pureza del ARN: las lecturas A260 y 260/280 de las relaciones de transformacin no son bastantes para asegurar el ARN de la pureza elevada. Usted debe tomar un espectro ULTRAVIOLETA completo. Usted puede tambin utilizar la relacin de transformacin de 260/230 para ayudar a determinar la cantidad de contaminacin orgnica en su ARN. Es un nmero mucho ms variable que la relacin de transformacin de 260/280, pero generalmente, las relaciones de transformacin sobre 1 indican buena pureza. RNAlater: reactivo de tejido de almacenamiento acuoso que estabiliza y protege el ARN celular, sin congelar muestras de tejido intacto. RNAlater elimina la necesidad de procesar de inmediato las muestras de tejido o para congelar las muestras en nitrgeno lquido para su posterior procesamiento. Piezas de tejido se pueden cosechar y sumergir en el RNAlater para el almacenamiento sin comprometer la calidad o la cantidad de ARN obtenido despus del aislamiento de ARN. Las muestras se pueden almacenar congelados o sin congelar. Simplifica la recoleccin de la muestra de un reactivo, inmediatamente inactiva RNasas y estabiliza el ARN en los tejidos o clulas Mayor flexibilidad, sin necesidad de congelar las muestras en nitrgeno lquido. Elimina la necesidad de congelar y moler muestras mayora de los tejidos Flexible tejido de almacenamiento - ARN es estable durante 1 da a 37 C, 1 semana a 25 C, 1 mes a 4 C o largo plazo a -20 C Compatible con muchos procedimientos de aislamiento de ARN incluyendo la mayora de kits de Ambion de aislamiento de ARN.

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Solucin Ringer: solucin salina que contiene cloruro de sodio, potasio, calcio y magnesio. Dicha solucin mantiene las muestras en las mismas condiciones que dentro del organismo, controlando el equilibrio osmtico. Este producto permite el almacenamiento de muestras a 4C por una semana o un mes a -20C. Taq polimerasa: es un termoestable polimerasa de ADN ,lleva el nombre del termfilo bacteria Thermus aquaticus de la que fue aislado originalmente por Thomas D. Brock en 1965. Es abreviado a "Taq Pol" (o "Taq"), y se utiliza en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), un mtodo de amplificacin de segmentos cortos de ADN. Taq polimerasa es una enzima capaz de soportar las condiciones de desnaturalizacin de protenas (alta temperatura) necesarios durante la polimerizacin en cadena. Sustituy a la DNA polimerasa de E. coli originalmente utilizado en la PCR. La temperatura ptima de Taq de la actividad es 75-80 C, con una vida media de 9 minutos a 97,5 C, y se puede replicar de 1000 pares de bases cadena de ADN en menos de 10 segundos a 72 C. Carece de actividad correctora , y tiene una tasa de error medido en aproximadamente 1 de cada 9.000 nucletidos. Algunos ADN polimerasas termoestables han sido aislados de otras bacterias y arqueas termfilas, tales como Pfu ADN polimerasa , que posee una actividad de lectura de pruebas, y se estn utilizando en lugar de (o en combinacin con) Taq de amplificacin de alta fidelidad. Termociclador: tambin conocido como mquina de PCR o reciclador trmico de PCR es un aparato usado en Biologa Molecular que permite realizar los ciclos de temperaturas necesarios para una reaccin en cadena de la polimerasa de amplificacin de ADN o para reacciones de secuencia con el mtodo de Sanger. El modelo ms comn consiste en un bloque de resistencia elctrica que distribuye a travs de una placa una temperatura homognea durante tiempos que pueden ser programables. Dado que las reacciones incubadas en el aparato son en soluciones acuosas, suelen incluir una placa de tapa calentada constantemente a 103 C para evitar la condensacin de agua en las tapas de los tubos donde ocurre la reaccin, y as evitar que los solutos se concentren, lo que modificara las condiciones ptimas para la enzima polimerizante y la termodinmica del apareamiento de los iniciadores. Xilacina: forma parte del grupo de los agentes agonistas- 2, y es utilizado para lograr inmovilizacin farmacolgica de diferentes animales. Es frecuente observar tras su aplicacin, disminucin de la

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frecuencia cardaca, bloqueos atrios ventriculares de primero y segundo grado, hipertensin inicial seguida de hipotensin ms duradera. Es un derivado de las tiacinas que al ser formulado como clorhidrato toma forma de cristales incoloros, de sabor picante. Se disuelve rptidamente en agua y metanol. Existen diferentes grados de depresin que puede alcanzar el sistema nervioso central, los cuales pueden describirse como: Analgesia: Es una disminucin de la capacidad de captacin del dolor. Sedacin: Comprende una depresin central moderada, donde el paciente se halla despierto, se disminuye la hiperexitabilidad y hay tendencia al sueo y embotamiento de la conciencia. Hipnosis: Es similar al sueo normal profundo. Hay una moderada depresin del SNC. Anestesia: Es una depresin central ms profunda, con ausencia de la motilidad, de la actividad refleja y de la sensacin dolorosa. Coma: Prdida de todos los reflejos, con persistencia slo de la actividad autonmica. Muerte: Cese de todas las funciones vitales. La droga se puede administrar por vas diversas. Su absorcin es relativamente rpida, de acuerdo a los resultados clnicos, aunque, como se ha dicho, es algo irregular. La eliminacin se lleva a cabo bsicamente por orina. Luego de su administracin por va intra muscular, el comienzo de su efecto puede visualizarse entre los primeros 1 a 15 minutos, pero su absorcin es muy variable.

Anexo Recomendaciones para la extraccin del RNA Se recomienda el uso de muestras frescas para la obtencin del RNA. Para la extraccin de RNA a partir de tejidos, congelar el tejido en nitrgeno lquido inmediatamente despus de su obtencin (en nuestro

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caso lo conservamos en RNAlater). El tejido as congelado puede mantenerse a -80C hasta la extraccin del RNA. Para la extraccin, trocear y pesar el tejido sin descongelar, mantenerlo en hielo seco hasta su homogenizacin en la solucin de lisis. Otra solucin para acumular tejido hasta el momento de la extraccin, es utilizar una solucin estabilizadora de RNA como el RNAlater de AMBION (Cat #AM7020, AM7024) o QIAGEN (Cat # 76104, 76106). Seguir las instrucciones del fabricante. Para el anlisis de expresin gnica es imprescindible el procesamiento de las muestras control o referencia y experimental en paralelo y siguiendo exactamente el mismo procedimiento. Recomendaciones bsicas para el manejo de RNA El RNA es un material extremadamente sensible y deben tomarse las mximas precauciones para evitar la contaminacin con ribonucleasas (RNasas) y su degradacin. Las RNasas son unas enzimas muy estables y activas que hidrolizan el RNA y no requieren de cofactores para su funcin. Las RNasas son muy difciles de inactivar, soportan el autoclavado y son insensibles a los mtodos estndar para la inactivacin de protenas. Es importante trabajar en un ambiente libre de RNasas, y debe tratarse el material para su eliminacin. Las siguientes recomendaciones ayudan a prevenir la contaminacin de RNasas: Utilizar guantes durante todo el proceso de manejo de muestras, material fungible y de vidrio, y extraccin de RNA. Las RNasas estn presentes en grandes cantidades en la piel y es la mayor va de contaminacin de RNasas. Durante la extraccin intentar trabajar lo ms rpido posible para minimizar la exposicin con RNasas y evitar la degradacin del RNA.

Opcional: Tratar superficies, extremos de las pipetas y gradillas con solucines descontaminantes de RNasas. Utilizar pipetas especficas para el manejo de RNA.

Mantener la muestra de RNA siempre en hielo o bloque fro, al menos que est disuelta en un disolvente orgnico.

Utilizar material plstico desechable (tubos, puntas de pipetas) estril y certificado libre de RNasas.

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El material de vidrio debe incubarse en un horno a 240C toda la noche. Los tapones de plstico, y otro tipo de material de plstico no desechable como cubetas de electroforesis, probetas, vasos de precipitados, debe lavarse con 0.1M NaOH, 1mM EDTA durante 5 minutos, y enjuagarse con agua MilliQ libre de RNasa. Alternativamente, material de plstico resistente al cloroformo, puede enjuagarse con cloroformo. El agua y las soluciones deben tratarse con DEPC (dietil pirocarbonato) 0,1 % (v/v en agua destilada).

Precaucin: El DEPC es txico y posible carcingeno. Utilizar guantes y realizar todo el proceso en una campana de extraccin hasta su inactivacin por autoclavado.

Se recomienda resuspender el RNA en agua ultrapura tratada con DEPC o libre de RNasas.

No hablar cuando se estn pipeteando soluciones con RNA o manipulando material o reactivos que se vayan a emplear en su preparacin. En la saliva hay RNasas.
Emplear tubos eppendorf y puntas de micropipeta que no se hayan tocado con las manos desnudas y que hayan sido convenientemente tratadas para eliminar restos de RNAsas.

Usar material de vidrio tratado con soluciones inactivadoras de RNAsas y manipularlo a partir de ese momento siempre con guantes y cuidando de no contaminarlo con RNAsas.

Requisitos de Calidad de las muestras La calidad del RNA se mide en base a tres parmetros bsicos: Pureza: La contaminacin de la muestras con impurezas orgnicas e inorgnicas (p.ej. fenol, cloroformo), y protenas afecta de forma significativa la sensibilidad y especificad del resultado. Para determinar el grado de pureza del RNA se determina la relacin de absorbancia A260/280 y A260/230, que debe ser = 1,8.

Integridad: La absorbancia a 260 nm y la relacin A260/280 slo nos da una indicacin de la cantidad de RNA y del grado de contaminacin de impurezas orgnicas e inorgnicas, pero no nos dice

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nada sobre el nivel de degradacin de RNA. Existen dos mtodos para determinar el grado de degradacin del RNA: Relacin entre las bandas ribosomales 28S y 18S que se observan en un gel de agarosa como bandas discretas y cuya relacin 28S/18S en un RNA ntegro es cercano a dos. Se recomienda una relacin 28S/18S = 1,2.
o

RIN: RNA Integrity Number, es un nmero que aplica el algoritmo del software del Bioanalizador 2100 Bioanalyzer de Agilent Technologies y que es un indicador del grado de degradacin de la muestra de RNA. Un RNA intacto tiene un RIN 9-10, mientras que un RNA degradado tendra un RIN <6. Para las aplicaciones de PCR a tiempo Real y microarrays se recomienda un RIN mnimo de 7, aunque depende del tipo de muestra.
o

Contaminacin de DNA genmico: la contaminacin de DNA puede afectar de forma significativa a la sensibilidad y especificidad del resultado de expresin gnica. El mejor mtodo para evitar la contaminacin de DNA genmico es el utilizar un mtodo de extraccin que combine al extraccin orgnica en fenol (Trizol) y la posterior purificacin. Existen kits de purificacin en columna que incluyen un pretratamiento en columna con DNasa y posterior elucin del RNA. En aquellos casos en los que la muestra contenta un grado de contaminacin inaceptable debe tratarse la muestra con DNasa (QIAGEN o AMBION) y repurificar en columna tras el tratamiento. Es muy importante eliminar totalmente la DNasa ya que inactiva la reaccin de retrotranscripcin requerida en la sntesis de cDNA o cRNA.

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Bibliografa CURTIS, Helena. (2008) Biologa 7 edicin en espaol. Editorial Mdica Panamericana.
Wikipedia la enciclopedia libre, http://es.wikipedia.org/wiki/Reacci %C3%B3n_en_cadena_de_la_polimerasa#PCR_con_transcriptasa_inversa_.28RTPCR.29

http://commons.wikimedia.org/wiki/ http://translate.google.com.ar/translate?hl=es&langpair=en| es&u=http://www.protocol-online.org/prot/Molecular_Biology/PCR/RTPCR/index.html

Ambion Applied Biosystems, http://www.ambion.com/techlib/resources/RNAlater/ Invitrogen, http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/brands/Product-Brand/Trizol.html