A coleo Cadernos Acadmicos da UFGD tem como objetivo divulgar o material produzido pelos docentes da universidade, para uso

didtico nas atividades de ensino e extenso.

TCNICAS LABORATORIAIS NA ANLISE DE ALIMENTOS

Rafael Henrique de Tonissi e Buschinelli de Goes Hellen Leles Lima

Universidade Federal da Grande Dourados COED Editora UFGD Coordenador Editorial : Edvaldo Cesar Moretti Tcnico de apoio: Givaldo Ramos da Silva Filho Redatora: Raquel Correia de Oliveira Programadora Visual: Marise Massen Frainer e-mail: editora@ufgd.edu.br Conselho Editorial - 2009/2010 Edvaldo Cesar Moretti | Presidente Wedson Desidrio Fernandes | Vice-Reitor Paulo Roberto Cim Queiroz Guilherme Augusto Biscaro Rita de Cssia Aparecida Pacheco Limberti Rozanna Marques Muzzi Fbio Edir dos Santos Costa Reviso: Raquel Correia de Oliveira Projeto grfico e capa: Marise Massen Frainer Impresso: Grfica Centro Imagem | Campo Grande | MS

Ficha catalogrfica elaborada pela Biblioteca Central - UFGD

636.0855 Goes, Rafael Henrique de Tonissi e Buschinelli G598t Tcnicas laboratoriais na anlise de alimentos. /

Rafael Henrique de Tonissi e Buschinelli Goes, Hellen Leles Lima. Dourados, MS: Ed.UFGD, 2010. 52p . (Cadernos acadmicos UFGD. Cincias agrrias). ISBN 973-85-61228-66-8

1. Nutrio animal Anlise. 2. Alimentos - Anlise. I Lima, Hellen Leles. II. Ttulo.

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SUMRIO
1. 2.

Introduo Amostragem na Bromatologia Coleta e cuidados com a amostra Cuidados a serem realizados na amostragem/coleta da amostra Preparao da amostra Amostragem de fezes e urina Gros Roteiro para coleta de amostras de produtos a granel Roteiro para coleta de amostras de produtos ensacados Consideraes gerais

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3. Composio Centesimal

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Matria seca (MS) e umidade Matria seca parcial ou pr-secagem (ASA) Matria seca total ou secagem definitiva (ASE) Matria mineral ou cinza Protena bruta (PB) ou nitrognio total Fibra bruta (FB) O mtodo de Van Soest na determinao da qualidade de forrageiras Determinao de fibra em detergente neutro Determinao da fibra em detergente cido Determinao de lignina Gordura ou extrato etreo
4. Avaliao da Digestibilidade IN VITRO da Matria Seca Digestibilidade in vitro da matria seca (DIVMS) usando o instrumento daisy (in vitro true digestibility- ivtd) Segundo Estgio (Pepsina + HCl 6N) Clculos Procedimentos de coleta, preparo e incubao do incuo 5. Bibliografia

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50

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1. Introduo

Esse manual tem como objetivo facilitar o acesso de estudantes de graduao em Zootecnia e profissionais ligados rea de avaliao de alimentos para animais, seguindo as metodologias mais utilizadas em laboratrios de anlise de alimentos. A produo animal uma rea voltada principalmente para o fornecimento de alimentos e outros produtos de origem animal para atendimento das necessidades do homem. O objetivo prtico da avaliao de alimentos aperfeioar a sua eficincia de utilizao, oferecendo assim uma resposta mais confivel em relao produo animal e proporcionando retorno financeiro mais adequado ao produtor (BERCHIELLI, 2006). A anlise de alimentos a serem utilizados para raes animais, forrageiras e outros alimentos de muita importncia para todos os pesquisadores. O objetivo principal destas anlises conhecer a composio qumica, alm de verificar a identidade e pureza, sejam elas de natureza orgnica ou inorgnica, do material analisado. Um estudo mais completo desses alimentos e dessas forragens conter propriedades como: aroma, aspecto, sabor, alteraes, estruturas microscpicas e a digestibilidade que interessa especialmente ao zootecnista que ir determinar o valor nutritivo deste alimento, ou seja, a parte do alimento que estaria disponvel para o animal. importante saber que essas anlises no representam compostos quimicamente definidos, mas sim grupos de compostos qumicos. A protena, por exemplo, no s abrange vrios compostos qumicos e compostos de nitrognio, como o extrato etreo; ela inclui tambm os triglicerdeos, outros compostos solveis em ter, como pigmentos e ceras. O mtodo normalmente usado para as anlises chamado de
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Weende. Por este mtodo que se tem a anlise aproximativa dos alimentos, desde 1864, com exceo do nitrognio, que feito pelo mtodo KJELDAHL (A.O.A.C.,1984). As anlises clssicas comumente feitas visam obter informaes sobre Matria Seca, Protena Bruta, Gordura ou Extrato Etreo, Fibra Bruta, Extrato No Nitrogenado e Cinza ou Matria Mineral. O mtodo descrito por VAN SOEST (1967) foi usado de forma complementar para se obter maiores informaes sobre a forrageira estudada, por ser mais preciso nas informaes de carboidratos, separando a fibra bruta em fibra em detergente neutro e detergente cido. Procurou-se a forma mais prtica e fcil de construir este material, para corresponder s principais necessidades de estudo ligadas nutrio animal e anlise de alimentos, buscando as tcnicas mais recentes e visando atender aos novos e mais dinmicos conceitos dessa rea cientfica.

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2. Amostragem na Bromatologia 2.1. Coleta e cuidados com a amostra

A coleta tem por finalidade obter amostras representativas da mdia do material e ser analisado. Deve ser realizada da forma mais cuidadosa possvel para obter uma amostra que, mediante sua anlise, indique com preciso a qualidade real do lote, transferncia e propriedade, sada ou nas inspees que porventura ocorram. Deve-se retirar numerosa quantidade de amostras parciais, colhidas em diferentes pontos e locais de interesse: campo, fabricao, depsito, transporte, sacaria, etc. Desta amostra s vezes volumosa, aps homogeneizada, podem ser retiradas amostras parciais, antes que sejam enviadas ao laboratrio. Aps a coleta a amostra deve ser armazenada de forma correta, a fim de se preservar o valor nutritivo, e ao mesmo tempo deve ser identificada corretamente (selada ou rotulada), para finalmente ser transportada ao laboratrio. Uma amostragem deficiente resultar sempre em valores errneos em anlises posteriores, impossibilitando o estabelecimento de manejo adequado para a perfeita estocagem e conservao dos alimentos.
2.2. Cuidados a serem realizados na amostragem /coleta da amostra

- Amostragem deve ser ao acaso - Nmero de amostras (varivel)

4 (sempre) 100 recipientes 101-200 recipientes 201-2000 > 2000 10% a coletar (mnimo 5) 5% a coletar (mnimo 10) 3% a coletar (mnimo 25) 1% a coletar (mnimo 50)
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- Quantidade de amostra (a quantidade deve ser suficiente para se realizar todas as anlises propostas). - Embalagem (preservar o alimento contra alteraes entre o local de coleta e o laboratrio) - Rotulagem (identificao da amostra) - Produto, local da coleta, data da coleta (horrio, se pertinente), observao. - Transporte (imediatamente para o laboratrio, evitar alteraes, refrigerao amostras deteriorveis).
2.3. Preparao da amostra

Durante a preparao da amostra no laboratrio deve-se assegurar a homogeneizao, de tal forma que qualquer poro utilizada possa ser representativa de um todo. As amostras que se necessite ao chegar devem ser cortadas em pequenos pedaos com faca inoxidvel, para posterior homogeneizao. Aps esta tritura prvia, o material deve ser identificado e colocado em saco de papel previamente pesado e levado balana (com preciso de duas casas decimais). O peso total (amostra mais saco de papel) deve ser anotado no formulrio prprio. Antes de levar o material para a estufa de secagem com ventilao forada, deve-se perfurar o saco de papel, para permitir melhor circulao de ar.
2.3.1. Forrageiras pastagens

Devem ser coletadas amostras em zig zag, no mnimo 15. Logo em seguida devem ser homogeneizadas e misturadas, retirando uma sub-amostra para posterior anlise. Acondicion-las em sacos plsticos, alocadas em caixa de isopor ou refrigeradas para que no ocorra uma perda de umidade.

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To logo as amostras sejam colhidas devero ser embaladas e enviadas ao laboratrio com rapidez, a fim de se evitar perdas de umidade e a ocorrncia de fermentaes indesejveis. Muitas vezes a amostra encaminhada tem sua origem de amostras parciais, colhidas em diferentes pontos do local de interesse. A manipulao da amostra, at o momento de sua anlise, dever ser to cuidadosa quanto possvel, para evitar a ocorrncia de alteraes nos princpios nutritivos existentes (SILVA e QUEIROZ, 2002). Ao coletar amostras rentes ao solo, deve-se ter cuidado para que no haja contaminao de material morto e/ou terra.
2.3.2. Silagens, feno e outras amostras

Para fenos a amostra deve ser retirada de acordo com o tamanho do experimento, utilizando-se o bom senso. Por exemplo: em lotes de um (1) a 10 fardos, todos devem ser avaliados; em lotes com 10 a 100 fardos retira-se uma amostragem de 10 fardos ao acaso e em lotes com mais de 100 fardos pode-se amostrar 10% dos fardos ao acaso. Na avaliao de silagens, geralmente 10 a 15 amostras so coletas de locais diferentes do silo, dependendo este nmero do tipo e tamanho do silo. O material deve ser devidamente ensacado, com etiqueta escrita a lpis. O ar deve ser retirado e devem constar na ficha de encaminhamento das amostras informaes sobre o perodo de armazenamento, condies do clima no momento da ensilagem, aditivos utilizados e a data de plantio e colheita. O material deve ser mantido no freezer antes de ser encaminhado ao laboratrio.
2.4. Amostragem de fezes e urina

Amostras de fezes, geralmente coletadas para ensaios de digestibilidade, devem ser bem homogeneizadas e corresponder entre um (1) e 5% da quantidade produzida diariamente, ao longo de sete (7) dias de
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coleta. O material deve ser congelado. J a coleta da urina deve ser efetuada uma vez ao dia, durante 7 dias consecutivos. Ao final as amostras devem ser bem misturadas, dando origem a pelo menos duas amostras representativas. O material deve ser conservado a 10C.
2.5. Gros 2.5.1. Equipamentos utilizados

Os seguintes equipamentos so usados na amostragem de gros sob diferentes circunstncias e na manuteno da representatividade da amostra durante o perodo necessrio.
2.5.2. Caladores simples

So extratores metlicos utilizados para a retirada de amostras em sacaria de aniagem ou algodo atravs de simples furao dos sacos.
2.5.3. Caladores (sondas manuais)

So extratores metlicos utilizados na amostragem de gros a granel, possuem divises (septos) no seu interior, permitindo a retirada de muitas pequenas amostras de uma s vez, em vrias profundidades.

2.5.4. Sondas Pneumticas

So equipamentos que retiram as amostras atravs de suco dos gros. Deve-se observar que o uso desses equipamentos na recepo de gros no permitido j que pode causar erros na amostragem devido retirada de mais quantidades de impurezas leves do que deveria e
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menos impurezas pesadas do que realmente possa existir. Poder ser utilizada em fbricas que recebam produtos limpos e secos.

2.5.5. Sondas Torpedo

So extratores utilizados para coleta de amostras de produtos a granel a grandes profundidades e dotados de varetas auxiliares que vo se encaixando uma outra pelo sistema de roscas, possuindo ainda um terminal para facilitar a sua introduo no interior da massa de gros. Tais equipamentos so prprios para o controle de armazenagem ou verificao parcial da qualidade de um silo ou graneleiro.

2.5.6. Pelicanos

So coletores de amostras de produtos a granel em queda livre (dutos de descarga) ou na sada dos transportadores, como correias transportadoras, elevadores de caneca, roscas sem fim. Devem ser utilizados baldes para depsito das pequenas amostras medida que elas vo sendo retiradas, visando posterior homogeneizao. Tais equipamentos so adotados como padro na coleta de amostras de produtos descarregados em nossas moegas, no podendo em hiptese alguma serem utilizados outros equipamentos.
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2.6. Roteiro para coleta de amostras de produtos a granel 2.6.1. pocas de coleta

a) Antes de efetuar a pesagem do veculo pr-amostragem dos gros, seja ainda na fila de espera ou j no ptio do armazm. Essa operao dar informaes sobre a qualidade do produto, atravs de determinaes de sua sanidade, teor de umidade e de impurezas, permitindo escolher o local e/ ou moega onde ser descarregado ou optar pela rejeio do mesmo. Tal procedimento, alm de facilitar a secagem devido separao de produtos de mesma umidade, agiliza o recebimento na unidade. O equipamento indicado para a pramostragem o calador. b) Durante a descarga nas moegas, ser feita a amostragem oficial utilizando-se o pelicano. A partir dessas amostras, depois de homogeneizadas, feita a determinao da qualidade dos gros. c) No decorrer do perodo de armazenamento devero ser realizadas amostragens da massa de gros a ttulo de inspeo, a fim de se verificar o estado qualitativo e fitossanitrio do produto estocado. Para esta atividade devero ser utilizadas sondas torpedo na coleta de amostras superficial e o pelicano na coleta de amostras pelas bocas de descarga. d) Por ocasio da expedio do produto, devero ser reti14
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radas amostras para sanar as dvidas quanto natureza e caractersticas do produto expedido. Pode-se utilizar o pelicano durante o carregamento, todavia o calador o mais indicado.
2.6.2. Procedimento operacional propriamente dito

a) Na coleta de amostras realizada com introduo em posio oblqua do calador na massa de gros, o esquema de coleta a ser utilizado ser determinado pelo classificador que poder alternar para cada operao. Esquema A Esquema B

b) As amostras relativas entrada do produto na unidade de armazenagem devero ser coletadas com uso de pelicanos. Tal coleta se d durante toda a descarga, com no mnimo trs giros no caminho (um no incio, um no meio e outro no fim da descarga). Nos caminhes basculantes a coleta semelhante realizada nos caminhes convencionais.

c) No caso de silos pode-se estabelecer para coleta de amostras os quatro pontos cardeais e o centro da massa a
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alturas pr-determinadas da massa de gros, como mostra e esquema abaixo:

- As amostras podem ser coletadas com sonda pneumtica, sonda torpedo ou mesmo caladores. Neste tipo de amostragem, as amostras devem ser analisadas separadamente, segundo as diferentes alturas em que forem coletadas para verificao da existncia de possveis bolsas de calor ou umidade. Para armazns graneleiros ou piscinas o procedimento semelhante, devendo-se aumentar o nmero de pontos de coleta e distribulos de acordo com o dimensionamento das estruturas armazenadoras em questo.
2.7. Roteiro para coleta de amostras

de produtos ensacados
2.7.1. pocas de coleta

A operao dever ser realizada por ocasio do recebimento e expedio do produto, bem como em casos de transferncia de propriedade, visando determinao de seu percentual de umidade e de impurezas. No recebimento da mercadoria, deve-se avaliar as condies em que os gros se apresentam. Averiguar a necessidade de equipamentos de secagem e/ou limpeza ou da opo pelo seu armazenamento imediato quando as caractersticas de teor de umidade e impurezas assim o permitirem.

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No decorrer do perodo de armazenagem, amostragens podero ser realizadas a ttulo de inspeo sempre que houver indcios de infestao por insetos ou de deteriorao no produto estocado.
2.7.2. Quantidades a extrair

a) Nos lotes de produtos ensacados, proceder retirado de amostras em no mnimo 10% do total de sacas, numa proporo mnima de 30 gramas de cada saca.
2.7.3. Procedimento operacional propriamente dito

As amostras so obtidas atravs da furao dos volumes (sacas) com caladores simples. A operao consiste em introduzir o calador no sentido de baixo para cima, promovendo-se o movimento vai e vem para facilitar o deslizamento do produto.

2.8. Consideraes gerais

De acordo com Silva e Queiroz (2002), a maioria das amostras se encontram em uma das seguintes categorias: (1) suficientemente secas para serem finamente modas e analisadas imediatamente (amostra com mais de 90% de matria seca); (2) suficientemente secas para serem grosseiramente modas (peneira de 3-6 mm), mas ainda muito midas, que precisem ser pr-secas ou parcialmente secas antes de finamente

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serem modas (amostra com mais ou menos 85% de matria seca); e (3) amostras que precisam ser pr-secas antes de serem grosseiramente modas (peneiras de 4-6 mm) e finamente modas (amostra com baixo teor de matria seca). Estas categorias de amostras devem ser manejadas diferentemente, isto , necessitam de tritura prvia, moagem preliminar ou moagem final. Tritura prvia a primeira tritura de amostras feitas com tesouras ou facas, que geralmente ocorre com as forragens verdes, razes, tubrculos e etc. que necessitam ser cortados antes da secagem final. Os gros so grosseiramente triturados em moinhos adequados, enquanto as forragens ensiladas e as raes fareladas no necessitam dessa tritura. Moagem preliminar ocorre aps a triturao prvia em amostras com 85 % ou mais de matria seca (raes fareladas) ou em amostras com menos de 85% de MS (forragens verdes) que j foram pr-secas, de acordo com a Figura 1. Moagem final nessa etapa mi-se as amostras ate obter um p bem fino, usando-se moinho de facas ou ciclone com peneiras de 1 mm. realizada aps a moagem prvia e preliminar com amostras.

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Amostra como oferecida ou como coletada

Amostra contendo mais do que 88% de matria seca

Amostra contendo menos do que 88% de matria seca

Moer, usando peneira de 1mm

Analise as amostras quimicamente

Determine % de matria seca parcial no alimento como oferecido a 600C ou seca a frio; Deixe equilibrar com a umidade do ambiente; Pese; Esta anlise ser denominadacomo sendo % de matria parcialmente seca do alimento como oferecida ou como coletado

Determine a matria seca a 1050C

Moer, usando peneira de 1mm

Este ser conhecido como: Matria Seca como oferecida ou colhida para demonstrar a produo

Analise quimicamente as amostras se os elementos no foram afetados pela secagem

Este valor de matria seca pode ser usado para calcular a produo de matria seca por unidade de rea

Determine a % de matria seca a 1050C. Esta anlise ser conhecida como % de matria seca na amostra parcialmente seca

Matria Seca do alimento como oferecida para demonstrar a produo

Figura 1- Fluxograma de preparo das amostras enviadas ao laboratrio de nutrio animal

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3. Composio centesimal 3.1. Matria seca (MS) e umidade

o ponto de partida para anlise de alimentos, tanto no aspecto de conservao como no de comparao do valor nutritivo dos alimentos. Pode ser dividido em matria seca parcial ou pr-secagem e secagem definitiva para ento se determinar a matria seca total.
3.2. Matria seca parcial ou pr-secagem (ASA)

A umidade evaporada da amostra e a matria parcialmente seca determinada como resduo remanescente aps a secagem em estufa. Realizada quando as amostras contem alto teor de umidade (gramneas, silagens, etc.), em estufa de circulao forada de ar com temperatura de 55 C por 16 / 24 horas para se evitar perdas por volatilizao ou alterao dos nutrientes. O tempo de secagem pode variar de acordo com a umidade da amostra e pode durar at trs dias ou quando a amostra estiver em aspecto quebradio, permitindo a moagem perfeita. A perda de gua deve ser computada no clculo da umidade final, portanto o material deve ser pesado antes de ser colocado na estufa. Deve-se pesar o material em que sero acondicionadas as amostras (sacos de papis, plsticos, etc...) Feito isso, leva-se o saco com amostra para a estufa com circulao de ar forado, a uma temperatura de 60 5 C por 72 horas para pr-secagem (atingir aspecto quebradio / ponto de feno, aproximadamente 18% de matria seca). Aps este perodo, o material deve ser retirado da estufa e colocado sobre um balco por 1 hora, para que a umidade da amostra entre em equilbrio com a umidade do ambiente. Este material chamado de amostra seca ao ar (ASA).
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Aps resfriado, faz-se pesagem do saco contendo a amostra seca ao ar (ASA). A seguir, a ASA deve ser processada em moinho contendo peneira de 30 mesh, ou seja, 30 furos por polegada linear (1mm). A frao moda deve ser recolhida em um frasco de vidro escuro com tampa de polietileno, que deve ser etiquetado e armazenado para posteriores anlises.
Exemplo: Amostra de Braquiria do brejo (B. arrecta) Tara (saco de papel): 9,32g Tara mais amostra verde: 446,00g Tara mais ASA: 200,27g Amostra verde: 436,68g ASA = 200,27 9,32 = 190,95 %ASA = = 43,7276

3.3. Matria seca total ou secagem definitiva (ASE)

Usadas em amostras submetidas pr-secagem ou que contenham mais de 80% de MS (raes fareladas, gros, farelos, etc...) A determinao da matria seca (MS) o ponto de partida da anlise de alimentos, pois possibilita a comparao dos dados encontrados com outros afins (independente de poca, local ou regio). A anlise de MS feita retirando-se a gua livre do material a ser analisado, que a maior frao de gua existente nos alimentos. As demais formas de gua encontradas nas forrageiras e alimentos concentrados so denominadas de estrutura e de constituio, que apesar da importncia sob o aspecto fsico-qumico no apresentam valores no aspecto prtico, pelos baixos teores com que esto presentes. A determinao de umidade pode ser feita por dois processos: direto e indireto. De um modo geral, o procedimento constitui-se de duas
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fases: secagem prvia (ASA), e secagem definitiva conhecida como Amostra Seca em Estufa (ASE). O mtodo indireto consiste na determinao da MS, considerada por diferena de peso, sendo que esta correspondente perda de gua na realidade ocorrem perdas de outras substncias volteis, alm de gua, que acabam sendo consideradas como gua, levando a um erro que considerado uma desvantagem deste mtodo. A umidade eliminada da amostra pela secagem em estufa a uma temperatura de 135C por duas horas, ou 100C por 24 horas, ou 105C por 16 horas (uma noite).
Procedimento:

A secagem definitiva realizada a partir do material coletado, em duplicata, cada uma pesando aproximadamente 2g. Pese as amostras em um pesa filtro ou placa de petri com tampa, previamente secos e tarados, fazendo a secagem em estufa a 105.C durante uma noite. Depois retire os pesa filtros da estufa, colocando-os em dessecador durante 1 hora para esfriar, quando forem pesados. Nesses procedimentos, realize as pesagens para determinao da MS realizadas em balana analtica com preciso de 0,0001g. O material assim obtido chamado de amostra seca em estufa (ASE). Clculo percentual da Amostra Seca na Estufa (ASE) % ASE = ASE(g) * 100 ASA(g) A determinao de matria seca total (MST) obtida atravs da seguinte expresso: % MST = % ASA* % ASE 100 A determinao da umidade total calculada subtraindo-se de 100 g a percentagem de matria seca.
Umidade = 100 MST
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61,5682

61,5686

61,5684

Umidade %

Resumindo: ASA (%) =

AMOSTRA

X 100 * 100

ASA

38,4318

38,4314

38,4316

MST %

ASE (%) = peso amostra seca %MST = %ASA*%ASE %U = 100 MST (%) MST% = 100 U%
100

ASA

43,7276 87,8892

43,7276 87,8883

87,8888

42,7276

ASA %

ASE %

3.4. Matria mineral ou cinza

Cinza ou resduo mineral o produto que se obtm aps o aquecimento de uma amostra, temperatura de 500 a 600C, at o aquecimento ao rubro, porm no superior a 600C, durante quatro horas ou at a combusto total da matria orgnica. Por meio de aquecimento em temperatura elevada, todas as substncias volteis que se decompem pelo calor so eliminadas, e a matria orgnica toda transformada em CO2 ,H2O, etc. A cinza, nos alimentos, contm principalmente os seguintes ctions: clcio, potssio, sdio, magnsio, ferro, cobre, cobalto, alumnio; e nions: sulfato, cloreto, silicato, fosfato, etc. A determinao da cinza feita muitas vezes apenas para se conhecer o extrato no nitrogenado (ENN), e/ou matria orgnica de determinadas amostras, sem a preocupao do teor de minerais. Assim sendo, pode-se fazer a determinao da matria mineral, dependendo do objetivo do pesquisador em seu trabalho e
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ASE (g)

ASA (g)

1,9520 2,2210 37,5053 37,7743 148 1 35,5533

Quadro 1. Determinao da Secagem Definitiva.

Pesa Filtro (g)

N PF

83 Mdia 2

34,2210

36,2696

Pesa Filtro + ASA (g)

36,0215

Pesa Filtro + ASE (g)

2,0486

1,8005

tambm do tipo de alimento a ser analisado. Por exemplo, quando analisamos produtos como farinha de ossos ou produtos de origem marinha, o teor de cinzas pode permitir uma boa estimativa da riqueza de clcio e fsforo, no entanto, quando analisamos produtos vegetais, a determinao da cinza tem relativamente pouco valor, isto porque seus componentes minerais so muito variveis. Forrageiras ricas em slica resultam em valor elevado de cinzas, porm essa no apresenta nenhum benefcio nutricional ao animal. Existem dois mtodos para se determinar as cinzas: incinerao simples e incinerao dupla (no mais usado pelos inconvenientes que apresenta na prtica). Na determinao da matria mineral so usados cadinhos de porcelana limpos, colocados na mufla por 15 minutos temperatura de 550oC. Em seguida so resfriados em dessecador e pesados. Dentro dos cadinhos ser colocada uma quantidade de aproximadamente um (1) grama. Os cadinhos com as amostras so colocados na mufla, que ligada em seguida. A elevao da temperatura deve ser lenta inicialmente, para evitar que a queima da amostra seja violenta, provocando perdas indesejveis. Por ocasio da colocao dos cadinhos na mufla, recomenda-se pingar umas gotas de cido ntrico por cima das amostras, facilitando a oxidao do carbono e sua conseqente volatilizao. O resultado final da anlise no alterado porque o cido ntrico tambm volatilizado. Uma vez queimadas as amostras so retiradas da mufla, esfriadas em dessecador e pesadas.
Calculo:

A - peso do cadinho + cinzas B - peso do cadinho C - peso da amostra parcialmente seca (ASA) % CINZAS =
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( (A-B) ) * 100 C

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Cinza MN %

3,2613

2,9781

3,1197

3.5. Protena bruta (PB)

ou nitrognio total O termo Protena Bruta (PB) envolve um grande grupo de substncias com estruturas semelhantes, porm com funes fisiolgicas diferentes. Baseado no fato das protenas terem porcentagem de nitrognio quase constante (em torno de 16%), o que se faz determinar o nitrognio e por meio de um fator de converso a porcentagem de protena bruta obtida pela multiplicao desta porcentagem de nitrognio no alimento pelo fator de converso 6,25 transformando o resultado em Protena Bruta. O mtodo de Kjeldahl (1883) o mais utilizado, principalmente em forragens, e vem sendo usado nos laboratrios de nutrio animal por mais de 120 anos. Este mtodo determina o nitrognio contido na matria orgnica, incluindo o nitrognio protico propriamente dito e outros compostos nitrogenados no proticos, como: aminas, amidas, lecitinas, nitrilas e aminocidos. O mtodo Kjeldahl se baseia numa digesto cida, na qual o nitrognio da amostra transformado em amnio (NH4+), sendo posteriormente separado por destilao e finalmente dosado pela titulao.

Cinza MS %

8,4858 87,8888 7,4580 0,1653 27,9604 30,0115 27,7951 20 1 2,2164

7,7490 6,8105 D1 24,5375 26,5579 2,0204 24,6751 0,1376 2 87,8888

ASE %

Quadro 2. Determinao da Anlise de Matria Mineral.

Amostra Cad.n

Peso Cad. (g)

Cad. + ASA (g)

ASA (g)

Cad.+ Cinza (g)

Peso da Cinza (g)

Mdia

7,1343

Cinza ASA %

8,1174

25

O mtodo est baseado em trs etapas: 1) Digesto - Nitrognio orgnico foi transformado em amnia que reage com o H2SO4, formando sulfato de amnio (NH4)2SO4 e os compostos orgnicos so convertidos em CO2, H2O etc. 2) Destilao - A amnia separada e recolhida em uma soluo receptora (H3BO3 + indicador). 3) Titulao - Determinao quantitativa da amnia contida na soluo receptora. Na determinao do nitrognio so pesadas duas amostras de ASA de aproximadamente 200 mg cada e introduzidas em tubos abertos, onde recebem aproximadamente 2 gramas de mistura digestora (K2SO4 +CUSO4.5H2O+Se) e 5 mL de cido sulfrico concentrado. A mistura digestora serve para aumentar o ponto de ebulio do cido sulfrico, acelerando a digesto cida. Durante a digesto cida a temperatura deve ser elevada gradativamente at atingir 350C. No final da digesto, o material fica completamente claro indicando a produo de sulfato de amnia. Prximo fase final da digesto, deve-se agitar o balo de modo a uniformizar o material em digesto, para obter total combusto (no deixar que o material parcialmente oxidado se fixe nas paredes do balo). Em seguida, esfria-se o balo naturalmente colocando um pouco de gua destilada. Durante a fase de digesto so observadas as seguintes reaes: mat. orgnica R-NH2 + H2O R-CONH2 + H2O H3 + H2SO4
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H2SO4 H2SO4 [ H+]

SO2 + CO2+ H2O + R-NH2 R-OH + NH3 R-COOH2 + NH3 (NH4)2SO4

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Salienta-se que o ndice cido regula a perda do nitrognio, e para isso uma quantidade especfica de cido deve estar presente durante a digesto, a fim de evitar perda de nitrognio. Efetuada a digesto cida, o tubo levado para que o material resultante sofra destilao. Assim que esfriar transfira imediatamente o tubo para o conjunto de destilao, balo ou tubo digestor, e num erlenmeyer de 125 mL adicionar 20-50 mL de cido brico a 4% + indicador misto (ou volume estimado de cido sulfrico 0,2 N de acordo com a porcentagem de protena estimada e duas gotas de soluo de vermelho metila 0,1%). Adapte o erlenmeyer ao conjunto destilador para receber amnia. A ponta do condensador deve ser introduzida na soluo, a fim de evitar perda de amnia. Destile por arraste, mantendo a ponta do condensador na soluo ate que toda a amnia seja liberada, o volume destilado aproximadamente 75 mL. Retire o elernmeyer lave a ponta do condensador com gua destilada, assim como as paredes superiores do elernmeyer. Durante esta etapa o (NH)2SO4 formado na digesto sofre adio de NaOH, formando NH4OH + Na2SO4 em presena de aquecimento, sendo ento o produto destilado para o erlenmeyer contendo um composto de cor verde (cido brico) NH4H2BO3. (NH4)2SO4 + 2Na4OH NH4OH NH3+ H3BO3 2NH4OH + Na4SO4 NH3 + H2O NH4+ H2BO3

Obtm-se, ento, cerca de 75 ml deste composto, titula-se o mesmo com HCl de normalidade conhecida (0,005N ou 0,1N) com fator conhecido at viragem do indicador. Para se evitar perdas de NH4, a sada do condensador deve ficar imersa no cido brico.
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NH4+ + H2BO3 + HCl

H3BO3 + NH4Cl

Durante a titulao com HCl o indicador adquirir uma cor de verde para rosa, se a titulao for realizada com soluo de hidrxido de sdio 0,2 N a viragem do indicador, ser de vermelho para amarelo. aconselhvel fazer um teste em branco com o objetivo de eliminar qualquer interferncia do papel e/ou de reagente. A quantidade de HCl gasta na titulao da amostra em branco subtrada da quantidade gasta na titulao da amostra. Obs: Todos os reagentes para esta marcha so obrigatoriamente (P. A.). O clculo da % de Nitrognio obtido atravs da frmula:
% de N =

V x N x f x 14 x 100
peso da amostra (mg)

% de N x 6,25 = % de protena bruta,

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2,3864

2,3864

2,3864

PB MN (%)

Vt : volume total Br: Branco Vr: Volume real = Vt - Br Cte: (N*F*14*100) = 27,45 N = 0,02 F = 0,9804 Nitrognio: Mdia = 0,8732 %

6,2095 87,8888

6,2095 87,8888

ASE (%)

6,2095

PB MS (%)

0,8732

Quadro 3 - Determinao de nitrognio e da Protena bruta.

0,3782

N(%)

O clculo da porcentagem de Protena feito multiplicando-se o percentual de nitrognio pelo fator 6,25, que se originou da constncia nos teores de protena na maioria dos produtos, que est em torno de 16%. 3.6. Fibra bruta (FB) Representa o resduo de substncia da parede celular. Na fibra bruta encontram-se como constituintes fraes de celulose e de lignina insolvel em lcali, que estimada atravs do mtodo de Wendee. A FB a parte dos carboidratos resistentes ao tratamento sucessivo com cido e base diludos, e representa a grande parte da frao fibrosa dos alimentos. Constitui-se como uma amostra livre de umidade e aps a extrao por ter, digerida inicialmente com uma soluo

PB ASA (%)

5,4574 27,45 0,2 0,40 9,60 0,2847 1

5,4574 0,2966 0,2 0,40 9,60 27,45 2

Amostra

ASA (g)

HCl(ml) Br Vr Vt

Cte

Mdia

5,4574

29

de cido fraco e posteriormente com uma soluo cida fraca. O resduo orgnico coletado num cadinho filtrante, e a perda de peso aps a filtragem denominada Fibra Bruta. Procedimento para determinao da fibra bruta: Pese 2-3 gramas da amostra seca ao ar, desengordurada ou no, dependendo do seu teor de gordura (>1%). Digesto cida Coloque a amostra em um bquer de 600 ml, prprio para ser ajustado ao digestor, adicione 200 ml da soluo de cido sulfrico a 1,25%, fervente. Coloque no aparelho digestor, pode-se adicionar tambm algumas gotas de anti espumante. Deixe ferver por trinta minutos, aps o inicio da ebulio. Filtre em funil de Buchner com tela de nilon, fazendo lavagens sucessivas com gua destilada quente ou fervente at a neutralizao do material, que verificado com papel de tornassol azul. Digesto bsica O resduo retido na tela quantitativamente transferido para o bquer de 600 ml, utilizando-se para transferncia 200 ml da soluo de NaOH a 1,25%, fervente, e algumas gotas de anti espumante. Coloque o bquer no digestor. Proceda a digesto bsica por trinta minutos aps o incio da ebulio. Transfira o resduo (fibras + minerais), com o auxlio de gua quente para o cadinho filtrante (previamente seco em estufa de 105 C por duas horas) e lave at a neutralizao do material use o papel de tornassol azul. Aps a filtragem lave o material com lcool (20 ml) e posteriormente com ter (acetona) (20 ml) a fim de facilitar a secagem.

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Faa a secagem dos cadinhos durante uma noite em estufa a 105C (4-6 horas) e leve-os ao dessecador para esfriar e equilibrar com a temperatura ambiente. Pese e registre os pesos. Coloque os cadinhos filtrantes com resduos na mufla a 500C, durante duas horas, desligue a mufla e espere a temperatura baixar a 250C. Coloque no dessecador e espere at que a temperatura se equilibre com o meio exterior. Pese e registre o peso a diferena de peso antes e aps a queima nos fornece o peso da fibra bruta das amostras. A pesagem nos fornece o peso do cadinho, da fibra bruta e dos minerais.
Clculo:

P2 - peso final do cadinho mais fibra P1 - peso do cadinho A - quantidade de amostra % de Fibra Bruta =

p2-p1 X 100 A

3.7. O MTODO DE VAN SOEST NA DETERMINAO

DA QUALIDADE DE FORRAGEIRAS O mtodo de VAN SOEST se baseia na separao das diversas fraes constituintes da forrageira, por meio de reagentes especficos, denominados detergentes. Este mtodo apresenta vantagens em relao a outros em virtude de sua maior preciso, alm de fornecer informaes sobre importantes componentes FDN, FDA, celulose, lignina, cinza, slica, etc. Por meio do Detergente Neutro, possvel separar o contedo celular (parte das forragens solveis no detergente neutro) constitu-

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do de protenas, gorduras, carboidratos solveis em gua, da parede celular, tambm chamada Fibra em Detergente Neutro (FDN), que constituda basicamente de celulose, hemicelulose, lignina e protena lignificada. A fim de solubilizar o contedo celular e a hemicelulose, alm da maior parte da protena insolvel, VAN SOEST props um detergente cido especfico. Aps a digesto por este detergente, o produto resultante ser quase que na sua maioria lignina e celulose (lignocelulose), sendo este produto conhecido como Fibra em Detergente cido (FDA). Conhecendo-se a porcentagem dos constituintes da parede celular (FDN) e da FDA do material analisado, possvel calcular a frao de hemicelulose, apenas pela diferena entre aquelas fraes.
3.8. Determinao de fibra em detergente neutro

O mtodo Weende no parece satisfatrio para se obter informaes sobre os carboidratos, pois inclui no grupo da fibra bruta a celulose e somente a lignina insolvel em lcali. Parte da lignina passa a fazer parte do extrato no nitrogenado, calculado por diferena, alm de subestimar a fibra bruta. Por outro lado, no grupo dos extratos no nitrogenados encontram-se fraes de naturezas diversas como: amido, hemicelulose, pectina, lignina solvel em lcali e os carboidratos solveis em gua (amilose, frutasanas). Esta diviso pode ser insatisfatria sob o ponto de vista nutricional, visto que a hemicelulose, pectina e lignina solvel em lcali no apresentam as mesmas caractersticas nutricionais dos outros componentes sob o termo de extratos no nitrogenados. O detergente neutro separa o contedo celular composto pelas protenas, gorduras, carboidratos solveis, pectina e outros componen32
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tes solveis em gua presentes na parede celular (parte da forragem insolvel em detergente neutro), tambm chamado de Fibra em Detergente Neutro (FDN). Uma soluo em detergente neutra usada para dissolver substncias (pectinas) facilmente digeridas e o contedo celular das plantas (protenas, acares e lipdios), deixando um resduo fibroso (FDN). O detergente usado para solubilizar as protenas e o sulfito de sdio e ajuda tambm a remover alguns compostos nitrogenados.
3.8.1. Procedimento para amostras com baixo teor de amido Pese cerca de 0,5 / 1,0 g de amostra seca ao ar, previamente trituradas em moinhos com peneiras de 1 mm, coloque em bquer de 600 ml, adicione 100 ml do detergente neutro (temperatura ambiente). Aquea at ferver (cerca de 5 minutos), reduzindo a temperatura para evitar a formao de espuma, deixe em digesto durante 60 minutos, logo em seguida faa a filtragem em cadinho filtrante, previamente pesado, por suco a vcuo. Lave com gua quente o material dentro do cadinho filtrante e repita essa operao, certificando que todo material passou para o cadinho. Lave igualmente o cadinho, tomando cuidado de quebrar a crosta formada com ajuda de um basto de vidro, facilitando a lavagem e removendo todo complexo gelatinoso formado. Lave uma vez com 30 ml de acetona, leve os cadinhos para a estufa de 105C e deixe secar por uma noite ou por 8 horas temperatura de 105C. Esfrie em dessecador e proceda a pesagem. Considere fibra em detergente neutro a percentagem dos constituintes da parede celular, calculada pela diferena entre as pesagens. 3.8.2. Procedimento para alimentos

com alto teor de amido O procedimento para a anlise o mesmo para amostras com baixo teor de amido, o que muda que as amostras passam por um pr33

tratamento e por pequenas alteraes no procedimento: as amostras so tratadas inicialmente com 30 ml de soluo de uria 8M e 50 de amilase, estvel ao calor. Devem ser bem misturadas e aquecidas em banhomaria a 90C por cinco minutos, e levadas ao dessecador por quatro horas. A mistura deve ser diluda com 100 ml em detergente neutro, e na seqncia seguir o procedimento norma para estimar FDA. 3.9. Determinao da fibra em detergente cido A FDA a poro menos digestvel da parede celular das forrageiras pelos microorganismos do rmem. Constitui-se na sua quase totalidade por lignina e celulose. Para a determinao da fibra em detergente cido pode-se utilizar o mtodo sequencial aproveitando os resduos da determinao de fibra em detergente neutro, por ser mais rpido e permitir que se determine mais de uma frao com uma mesma amostra. Adicione 100 ml de soluo de detergente cido, levando os copos ao aparelho, deixando-os aquecer por cinco minutos a uma temperatura branda para evitar a formao de espuma. Aps iniciada a fervura, marcado o tempo de 60 min. para digesto. Aps este perodo, faa filtragem imediatamente em cadinho filtrante de vidro, previamente pesado, por suco a vcuo. Lave com gua quente o material dentro do copo certificando que todo material passou para o cadinho e tambm lave dentro do cadinho. Lave igualmente com acetona, levando, aps este procedimento, os cadinhos para estufa a 105C por 8 horas, deixando esfriar em dessecador, e depois pese os cadinhos. A diferena entre FDN e FDA fornece a Hemicelulose.

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3.10. Determinao de lignina

Na nutrio animal, a lignina exerce um influncia negativa sobre a digestibilidade de outros nutrientes, j que atua como barreira fsica na digesto dos nutrientes concentrados no interior da clula. A lignina pouco digervel, e seu contedo varia de quatro a 12%, podendo chegar at a 20% da MS das plantas mais fibrosas ou com avanada maturidade. Durante o processo da pr-secagem, a ao do calor pode elevar o teor aparente da lignina. Por isso importante que a temperatura de pr-secagem no seja superior a 55oC. Para se determinar a lignina parte-se da fibra em detergente cido, existindo dois mtodos: o do cido sulfrico 72% e o do permanganato de potssio. O mtodo do permanganato possui vantagens sobre o cido sulfrico: mais rapidez, menos corrosivo, menos afetado pelos danos da temperatura ambiente durante a secagem inicial da amostra. Entre as desvantagens cita-se: o tamanho da partcula da amostra deve ser inferior a 1 mm a fim de que haja melhor contato com os reagentes.
Procedimento:

Determinada a fibra em detergente cido, coloque os cadinhos contendo a fibra em uma bandeja de vidro, contendo gua. Adicione 30 ml de soluo de permanganato 2:1 em cada cadinho, colocando, em cada, um basto de vidro, para agitar o contedo e permitir que a soluo de 2:1 entre em contato com todas as partculas por mais ou menos 15 minutos. Faa filtrao por suco a vcuo. Renove a gua da bandeja e coloque a soluo 2:1 nos cadinhos, permanecendo ento por 1:30 horas. A cor prpura deve estar presente por todo o processo da oxidao.
35

Os cadinhos so ento novamente succionados a vcuo e colocados em bandeja limpa com gua, adicionando-se 30 ml de soluo desmineralizadora. Depois de 10 min., succione e renove a soluo desmineralizadora, a fim de que a fibra fique de cor clara. Lave os cadinhos com etanol e acetona e deixe-os secar em estufa a 105C. Calcule o teor de lignina pela diferena de peso.

Figura 2: Diagrama do mtodo seqencial na determinao dos componentes da parede celular. 36

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Quadro 4- Determinao dos Constituintes da Parede Celular ( C.P.C.)

Amostra 87,8888 87,8888 0,334 0,4526 834 29,942 30,265 0,323 0,4825 874 29,913 30,257 0,344 71,2953 71,3654 71,3304

ASA (g)

ASE %

MS (g) N Cad. Peso Cad. (g)

Cad. + resResduo (g) CPC MS (%) duo (g)

MN % 27,3999 27,4269 27,4134

0,549

0,515

Mdia

Contedo celular = 100 - FDN = 28.6696.

Quadro 5- Determinao de FDA, Lignina e Celulose

Amostra ASA (g)

ASE (%)

MS (g) 0,4825 0,4526 29,942 30,092 0,150 29,913 30,078 0,165

Cad. + Cel. + Lignina FDA MS Lignina Celulo- Celulose Peso Cad. Cad. +FDA FDA (g) (g) (%) (%) se (g) (%) Cinza (g) (g) (g) 30,046 0,032 34,1969 6,6321 30,033 33,1418 33,6694 6,6321 0,059 13,0358 13,0358

1*

0,549

87,888

2**

0,515

87,888

Mdia

Hemicelulose = FDN-FDA = 71,3304 33,6694 = 37,661 * mtodo do permanganato ** mtodo do cido sulfrico 72%

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37

3.11. Gordura ou extrato etreo

As gorduras ou lipdios so substncias insolveis em gua, mas solveis em solventes orgnicos chamados extratores, como ter, clorofrmio, benzeno, etc. A gordura constitui a frao mais energtica dos alimentos e composta de carbono, hidrognio e oxignio. Alm das gorduras existem muitos outros compostos intimamente ligados ou associados, tais como: fosfatdeos, esteris (colesterol), clorofila, leos volteis, resina, etc., que so arrastados na presena destes solventes orgnicos. Gorduras, leos, pigmentos e outras substncias gordurosas solveis contidas em uma amostra seca so dissolvidos atravs da extrao com ter, que ento evaporado desta soluo gordurosa. O resduo resultante pesado, sendo chamado de extrato etreo ou gordura bruta. O ter e as amostras devem ser livres de umidade, para evitar a co- extrao de componentes solveis em guas presentes na amostra, como carboidrato, uria, acido lctico, glicerol e etc. A riqueza em gordura pode influenciar o armazenamento de alguns produtos, uma vez que as gorduras dos alimentos constituem uma frao bastante instvel, pois os alimentos ricos em tal substncia rancificam facilmente. Os alimentos rancificados perdem grande quantidade de certos nutrientes essenciais, como as pr-vitaminas A e D, caroteno, complexo B, Tc..., e alguns cidos graxos podem sofrer oxidao oxidativa. O valor alimentar do extrato etreo no constante. Considera-se que um grama de gordura produz 9,35 Kcal de energia bruta, quando medida na bomba calorimtrica, o que corresponde aproximadamente a 9 Kcal de energia metabolizvel. Os alimentos com maior teor de gordura tm valores mais altos de NDT, pelo fato de a gordura fornecer 2,25 vezes mais energia que os carboidratos.
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Os reagentes usados devem ser puros para anlise (P.A.), para evitarmos que haja qualquer tipo de contaminao do material a ser analisado. Para se fazer a determinao de gordura existem dois mtodos, que se diferenciam quanto ao solvente utilizado: mtodo frio (usando ter sulfrico, cujo ponto de ebulio de 35 C e extrator Soxhlet), e quente (usando ter de petrleo, cujo ponto de ebulio de 60 C). O mtodo a frio leva em torno de 12-24 horas de extrao enquanto o mtodo a quente dura em torno de 04-06 horas. O mtodo quente mais rpido que o mtodo frio, e assim chamado pois a extrao feita com temperatura mais elevada, cujo ponto de ebulio esteja entre 40-65 C. Procedimento (Extrao e Destilao) Tome amostras de aproximadamente 2 gramas cada de ASA, em papel de filtro e faa cartuchos. Pese os papis usados antes de pesar a amostra e anote os dados em formulrio prprio. Coloque cada amostra em recipiente prprio do aparelho de extrao Godifish ou Soxhlet. Em um becker previamente limpo e de peso conhecido, em balana analtica, adicione 40 ml de ter de petrleo (P. A.) e coloque sob o condensador fixando-o ao anel de rosca. Ligue a gua do condensador e tome as devidas precaues para evitar o vazamento de ter durante sua fervura e condensao. O aparelho permanece ligado de 4 - 6 horas, com verificaes ocasionais. Aps completada a extrao, remove a amostra do recipiente e coloque o tubo coletor de ter sob o condensador. O becker reposto e o ter destilado. Antes que o ter do becker seque, retire do aquecimento e derrame o ter do tubo coletor em frasco apropriado. Complete a secagem do becker em estufa a 105C por 30 minutos. Aps este tempo, retire o becker e o coloque em dessecador para esfriar e posteriormente ser pesado. O peso da gordura extrada calculado pela diferena do becker vindo do dessecador menos o becker vazio.
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Copo + Gordura EE MS % EE MN % Gordura (g) (g)

0,4219

4. Avaliao da digestibilidade

in vitro da matria seca Na anlise de forragens a digestibilidade pode ser definida como sendo a quantidade de nutrientes consumidos que no aparece nas fezes. A tcnica tenta reproduzir em laboratrio o que acontece no animal, e consiste em deixar a amostra da forragem em contato com o lquido ruminal (inculo) em tubo de ensaio ou potes, para tentar reproduzir as condies que predominam no rmen-retculo, com presena de microorganismos, condio de anaerobiose, temperatura de 39 C, capacidade tampo, pH 6,9. Procura repetir o que acontece in vivo, aps 24 a 48 horas de digesto microbiana. Recomenda-se que a dieta do animal doador seja a mesma da amostra que se quer analisar, disponibilidade de animais para coleta e diversidade dos tipos de amostras. Para se ter confiana nos resultados obtidos, costuma-se fazer anlises com uma amostra ndice, s quais se conhece os seus valores. Caso haja algum resultado discrepante para a amostra ndice, sinal de que algum problema ocorreu invalidando os resultados obtidos com as amostras analisadas. Para a avaliao da digestibilidade in vivo, tem-se a tcnica de uma ou duas etapas, dependendo da riqueza em protena do material a ser utilizado (TILLEY e TERRY, 1963).

Peso Copo (g) Copo N

Quadro 6 Determinao da Gordura ou Extrato Etreo

ASA (g) Tara + ASA (g) Amostra Tara (g)

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03

0,8171

1,9314

2,4048

87,8888

ASE%

2,1135

MS (g)

03

144,0415

144,0647

0,0232

1,0977

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1a Etapa: para a avaliao da digestibilidade pese duas amostras com peso em torno de 1 g de ASA, que foram colocadas em tubos prprios ou potes para ensaio de digestibilidade, adicionando-se aos tubos 40 ml de saliva artificial (soluo tampo de Mc Dougall), e 10 ml de inculo de rmen. Passe CO2 sobre a superfcie do contedo dos tubos para eliminar o O2 presente e imediatamente feche com rolhas de borracha equipada com vlvula de Bunse. Incube os tubos por 48 h a 39 oC, em estufa de temperatura controlada sofrendo agitaes suaves (3 a 4 vezes ao dia). 2a Etapa: Aps essas 48 h de digesto microbiana, retire os tubos da estufa adicionando aos mesmos 6 ml de cido clordrico 20 % v/v, colocados (2 + 2 + 2 ml) para evitar a formao de bolhas de ar, e adicione tambm 2 ml de soluo de pepsina a 5 % p/v. Coloque os tubos (destampados) de volta estufa para nova incubao durante 48 h a 39 oC, fazendo agitaes ocasionais (3 a 4 vezes ao dia) como na 1a etapa. A pepsina promove uma digesto na segunda etapa, desdobrando a protena do substrato. Finalmente, retire os tubos, fazendo a filtrao do resduo, quantitativamente, com a ajuda de gua em piseta, para cadinhos filtrantes previamente pesados. Leve os cadinhos estufa a 105 oC, por uma noite, esfriando-os em dessecador e pesando-os. recomendado a incluso de tubos controles brancos em cada procedimento de anlise, afim de se conhecer a matria seca residual do lquido de rmen utilizado. A seguir, apresentada a frmula de como se calcula a digestibilidade in vitro da matria seca.
Clculo: DIVMS = 100 x g/MS amostra - (g/MS residual - g/MS branco) g/MS amostra

Os resultados esto no quadro 8.

41

4.1. Digestibilidade in vitro da matria seca (divms)

usando o instrumento daisy (in vitro true digestibility- ivtd)

4.1.1. Reagentes
soluo Tampo A: g/litro para 2 jarros (2660 ml) 1. KH2PO4 2. MgSO4.7H2O 3. NaCl 4. CaCl2.2H2O 5. Uria (grau de reativo) Soluo Tampo B: 10,0 0,5 0,5 0,1 0,5 g/litro 26,600 g 1,330 g 1,330 g 0,266 g 1,330 g para 2 jarros (532 ml) 6. Na2CO3 7. Na2S.9H2O 15,0 1,0 7,980 g 0,532 g

4.1.2. Procedimentos 4.1.2.1. Preparao das bolsas de filtro e amostras:

Um dia antes da incubao, pr-enxge as bolsas de filtro F 57 ou TNT (ver amostra) com acetona dentro de um recipiente de vidro durante trs a cinco minutos, depois escoe a acetona e leve para secar por completo durante dois minutos em estufa com ar seco (55 C). Retire e faa a marcao das bolsas com caneta permanente (no usar a de retroprojetor) ou lpis preto e coloque na estufa de 105C at o outro dia (uma noite). O enxge em acetona remove um surfactant que pode inibir a digesto microbiana.
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No dia seguinte coloque as bolsas no dessecador (dentro do recipiente) por 40 minutos. Pese cada bolsa de filtro e registre o peso (W1), uma a uma, sem toc-las antes da pesagem.Tare a balana e pese 0,25 g de amostra (W2), de preferncia diretamente na bolsa de filtro. Sele as bolsas e armazene-as adequadamente para que posteriormente (quando as solues tampes j estiverem preparadas) sejam colocadas no jarro do Fermentador Artificial de Rmen (DAISY). So feitas at 25 bolsas por jarro (24 amostras + 1 branco), colocadas equitativamente nos quatro jarros de digesto bem como dentro do jarro ocupar os dois lados. Inclua uma bolsa lacrada vazia (branco) em cada jarro que levar ao fator de correo (W4). As amostras so feitas em duplicata sempre. Quando a DAISY est comeando a ser utilizada (incio de operao) aconselhvel utilizar, alm do branco, duas bolsas lacradas com um testemunha (padro conhecido, valores de digestibilidade tabelados), que dependendo do material a ser analisado pode ser: feno de alfafa modo a 1 mm para volumosos, milho modo a 1 mm para concentrados energticos e farelo de soja modo a 1 mm para concentrados proticos). Isto feito somente para fins de comparao (valor conhecido com valor encontrado).
4.1.2.2. Preparao das Solues Tampes (para cada 2 jarros da DAISY): No dia da incubao (DAISY), prepare as solues tampes A e B, separadamente. O ideal que enquanto uma pessoa prepara as solues, outra coleta e prepara o incuo (lquido ruminal). Enquanto feito o preparo das solues, deve-se manter o copo do liquidificador, as provetas graduadas para o incuo e o funil tudo em banho-maria a 39C. Anote os pesos de cada reagente em copos plsticos separados (numere de um a sete os copinhos, um nmero por reagente, siga a

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ordem da marcha). Utilize dois recipientes grandes (soluo total com 3,2 litros) para preparar as solues A e B separadas. Anote em cada recipiente a soluo que ali ser feita. Adicione os reagentes lavando os copinhos com gua destilada morna (39C), complete com gua destilada morna at 2660 ml para a soluo A e 532 ml para a B, depois misture bem com o basto de vidro. Misture bem as solues A e B (relao 1:5) e leve ao pHmetro para aferir o pH da mistura, que dever ser 6,8 a 39C. Adicione a soluo resultante (A+B) nos jarros (distribua uniformemente entre os dois jarros, com 1600 ml para cada jarro da soluo A+B) e tambm nos outros dois jarros (outro preparo de solues). Coloque as bolsas com as amostras dentro dos jarros com a soluo A+B. Se a DAISY no for utilizada totalmente (100 bolsas, ou menos de 4 jarros), acrescente no(s) jarro(s) sem amostras o mesmo peso em gua, para que a mquina trabalhe a rotao adequadamente. Ative os botes de aquecimento e rotao, permitindo que a temperatura nos jarros da DAISY atinja o equilbrio pelo menos 20 minutos antes da incubao (incuo + CO2). Este tempo pode ser usado para o preparo do incuo.
4.1.2.3. Coleta e Preparao do Lquido Ruminal

e Incubao
Observaes: MANUTENO TEMPERATURA 39C (MATERIAIS E INCUO) INFUSO CONSTANTE DE CO2, NO BORBULHAR O LQUIDO DUAS PESSOAS (UM SE PREOCUPA S COM CO2)

Antes da coleta, aquea tudo com gua a 39 C (garrafa trmica com gua a esta temperatura e recipiente de coleta aquecido). Prepare a bomba de vcuo (tomada, mangueira do vcuo e mangueira coletora)
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e depois abra a fstula, introduzindo a mangueira coletora diretamente na fase lquida do material ruminal. Ligue a bomba at sugar cerca de 2/3 da capacidade do recipiente coletor para que no entre lquido no interior da bomba (perigo). Retire a gua a 39C da garrafa trmica rapidamente e adicione o lquido coletado, juntamente com infuso constante de CO2 antes, durante e depois dessa adio na garrafa, fechando-a gradativamente com a adio de + CO2. Repita as operaes acima com cuidado at completar o contedo da(s) garrafa (s) trmica(s) ser necessrio cerca de dois litros de lquido ruminal para cada utilizao completa da DAISY (quatro jarros x 400 ml = 1600 ml). Leve o material coletado na garrafa trmica rapidamente ao laboratrio onde j deve estar preparada e aquecida a soluo tampo A+B com as amostras nos jarros. Os materiais utilizados (liquidificador, funil, provetas) para preparar e medir o incuo devem estar no banho-maria a 39C. Esvazie ento os contedos inteiros da(s) garrafa(s) trmica(s) no liquidificador aquecido e com um pouco de CO2, acrescente rapidamente o CO2 e misture a uma velocidade alta durante 30 segundos. Espere um segundo para esvaziar o liquidificador no funil (para diminuir espuma formada). A ao de mistura serve para desalojar os micrbios que se prenderam nas fibras da massa do rmen e asseguram uma populao microbiana adequada para a anlise in vitro. Durante este tempo retire a proveta e o funil do banho-maria e arrume com o tecido para a filtragem (tecido da amostra dobrado ao meio, no reutilizar, somente um uso). Filtre a quantidade inteira no tecido e aperte com as mos; se sobrar lquido no liquidificador, infundir CO2 com ele quase fechado at terminar de filtrar e tambm na proveta onde est o incuo. Mea 400 ml deste lquido filtrado (incuo) em cilindro graduado (proveta) aquecido e com CO2 e remova um jarro por vez da DAISY
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ainda ligada (rotao e aquecimento), acrescentando este lquido e infundindo CO2 continuamente durante a colocao at fechar a tampa de forma segura (cerca de trinta segundos com CO2). Coloque de volta na mquina e repita o procedimento at o ltimo jarro, feche definitivamente a DAISY, abrindo-a ocasionalmente somente para checar rapidamente a rotao. Incube durante 48 horas para determinar a DIVMS; a DAISY manter uma temperatura de cerca 39,5C. Marque o horrio exato da incubao para que as prximas etapas (adio da pepsina + HCl, retirada das amostras incubadas e pesagem final das bolsas), sejam feitas neste mesmo horrio nos outros dias.
4.2. Segundo Estgio (Pepsina + HCl 6N)

Verifique se h disponibilidade do HCl 6N preparado. Cerca de 40 minutos a 1 hora antes do horrio marcado da incubao comece a preparar toda a soluo de pepsina em meio cido a ser usada para os quatro jarros. Use quatro bqueres de 250 ml, um para cada jarro. Pese quatro vezes 8 gramas de pepsina e dissolva em 35 ml de gua destilada misturando bem. Aquea moderadamente na chapa at ficar morno (dissoluo melhora, mas no deixe muito quente a temperatura para no desnaturar a enzima). De preferncia use o agitador magntico aps deixar morno. Leve prximo ao pHmetro regulado cada bquer um a um e deixe os outros na chapa (cuidado com temperatura). Pegue uma pipeta pequena plstica para gotejar o HCl 6N. Ajuste o pH at 2,9 a 3,1, e se necessrio acrescente gotas do cido com a pipeta, gota a gota, mensurando o pH at atingir o adequado citado acima. Se o pH passar um pouco, goteje soda custica moderadamente.
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Volte para a chapa e pegue o outro bquer, repetindo a operao acima at fazer todas as quatro solues. Espere o horrio (o mesmo da incubao) mantendo os bqueres na chapa morna e leve at a DAISY todos eles, acrescentando a soluo nos jarros, um a um, e mantendo o funcionamento da DAISY antes de retornar o jarro mquina agite-o um pouco. Deixe por mais 24 horas na mquina. No mesmo horrio do outro dia, pegue um recipiente para acomodar as bolsas e remova todos os jarros da DAISY, desligando-a. Descarte o lquido e apie as bolsas, retirando-as dos jarros, e lave-as at a gua ficar clara no recipiente. Remova o excesso de gua das bolsas e adicione acetona at cobri-las. Deixe por trs a cinco minutos na acetona com um pesinho em cima. Descarte a acetona e retire o excesso das bolsas. Leve o recipiente com as bolsas para a estufa a 55C por uns dois minutos e depois coloque na estufa a 105C por uma noite. No outro dia, no mesmo horrio da incubao coloque o recipiente com as amostras no dessecador por 40 minutos (usar luva) e depois desse tempo retire sem tocar nas bolsas (usar a pina) e pese uma a uma, registrando os pesos finais (W3). Descarte ou prepare as bolsas para serem reutilizadas (mais duas vezes apenas, porm no aconselhvel).
4.3. Clculos % DIVMN= 100 [(W3- (W1 x F)) x 100 / W2]
Onde:

peso da tara da bolsa (vazia) W2 peso das amostras (mais ou menos 0,25 g)
W1
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W3 peso da bolsa final aps 48 horas fermentando e 24 horas de

digesto com meio cido e pepsina F correo da bolsa em branco (peso final da bolsa em branco aps o processo todo/ W4) W4 peso da bolsa em branco antes da incubao (vazio) Faa a relao para encontrar o valor em base de MS.
% DIVMS = 100 -((W3 -(W1 x F )) x 100 / (W2 x MS)

4.4. Procedimentos de coleta,

preparo e incubao do incuo

Figura 8 : Procedimentos de coleta, preparo e incubao do incuo

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Quadro 7 - Digestibilidade In Vitro da Matria Seca

Amostra 1,0536 1,0792 87,8888 0,9260 87,8888 0,9485 0,4406 0,4598 0,5268 0,5301 0,5285

Brac. r. Brac. r. Mdia

N. tubo 3 4 Tubo ASA (g) ASE (%) MS (g) Resduo MS Digerida

MS (%) 56,89 55,89 56,39

32,0335 31,5414

Tubo + resduo 32,4741 32,0012

Res. Branco 0,3992 0,4184

Branco 1 2 3 33.8822 47.7505 26.7344 0.0542 0.0349 0.0351

B-1 B-2 B-3

33.8280 47.7156 26.6993

F. ndice 1 2 3 Mdia 1,0449 1,0328 1,1527 94,84 94,84 94,84 0,9910 0,9795 1,0932 36,8227 47,7399 27,6379

I-1 I-2 I-3

36,3802 47,2920 27,1539

0.4425 0.4479 0.4840

0.4011 0.4065 0.4426

0.5899 0.5730 0.6506

59.53 58.50 59.51 59.13

Mdia do Branco = 0,0414

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Bibliografia
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