DEMOSTRACION DEL PROCESO DE UREOGENESIS: ACCIN DE LA ARGINASA

I.

INTRODUCCIN :
Cuando la llegada de aminocidos al hgado es alto. Como sucede despus de la ingesta de de uno como una dieta rica en protenas. Parte del exceso de aminocidos gracias al aumento de la sntesis proteica as como por el incremento de su degradacin a urea y sustrato glucognico o cetogenico dependiendo de cada aminocido y su va oxidativa Junto con el catabolismo del . esqueleto de cada aminocido, es necesario disponer de un medio eficaz de eliminacin del nitrgeno de los grupos aminos para evitar la acumulacin hasta niveles txicos de amoniaco y para que el hgado proceda a la sntesis de urea, requiere de cantidad estequiometrias de amoniaco (en forma de carbamil-P) y de aspartato. El hombre y mamferos la sntesis de urea (ureognesis) se realiza a partir del amoniaco (NH3) resultante de la desanimacin de los aminocidos y el C02 proveniente de las descarboxilaciones (ciclo de Krebs). La hidrolisis de la arginina es la fuente de la urea aunque este aminocido se encuentra en todas las clulas. La formacin de urea est particularmente limita al hgado; ya que es el nico tejido que posee arginasa. La arginasa (PM: 120.000) est constituida por cuatro subunidades, cada de las cuales est unido un tomo de Mn2+. 1. La ortina producto del desdoblamiento de la arginina, puede ser utilizada de manera cclica al reaccionar con otra, molcula de carbamil P y as formar citrulina a nivel mitocondrial en la primera reaccin de la secuencia que conduce finalmente a la sntesis de urea. 2. Citrulina (citoplasma) 3. Hidrlisis de Arginina ornitina + urea Se ha estudiado que las enzimas del ciclo de la urea muestran tambin respuestas adaptativas a los cambios en la ingesta proteica guardando relacin con la excrecin urinaria de urea y a hormonas como el glucagon y los glucocorticoides. El objeto de esta prctica es de mostrar la accin de la arginasa sobre la arginina para la sntesis de urea.

II.

MATERIAL : A) Material Biolgico Homogenizado heptico de rata al 20% en sacarosa 0.25 M. B) Reactivos: - Buffer fosfato 0.05 M, Ph 7.2 - Solucin de arginina 0.3 M

III.

Ureasa en polvo Acido sulfrico 2/3 N Tungstato de sodio al 10% Reactivo de Nessler

PROCEDIMIENTO :
La preparacin del homogenizado heptico de rata al 25% en sacarosa 0.25 M, se realiza tomando 10ml de homogenizado en un tubo de ensayo y dejar en bao de agua a 60C durante 15 minutos (tener cuidado en que no se eleve la temperatura a 60C). La arginasa es estable bajo este tratamiento mientras que las dems enzimas del hgado son precipitadas. Cumplidos los 15 minutos, enfriar el tubo bajo un chorro de agua. Enseguida desechar, el precipitados y quedara una solucin de co rojo lor ligeramente turbia en donde se encuentra la enzima. Armar los siguientes sistemas:

A.- Produccin de urea utilizando arginina (sustrato)

COMPONENTES Buffer fosfato 0.05 M pH702 Sol. Arginina 0.3 M Agua destilada Pre-incubar a 37 C por 5 minutos Homogenizado heptico(arginasa) Ureasa en polvo Incubar a 37 C por 30 minutos H2SO4 2/3 N Tungstato de sodio 10 % agua destilada TUBO I 1.0ml 0.5ml ----0.5ml Una pizca --1.0ml 1.0ml 6.0ml TUBO II 1.0ml --0.5ml --0.5ml Una pizca --1.0ml 1.0ml 6.0ml

Mezclar y filtrar; el filtrado debe ser transparente; de lo contrario volver a filtrar

B.- Determinacin de la urea mediante reactivos de Nessler COMPONENTES

Filtrado I Filtrado II agua destilada Reactivo de Nessler

TUBO B
----9,0ml 1,0ml

TUBO I
0,1ml --8,9ml 1,0ml

TUBO II
--0,1ml 8,9ml 1,0ml

En esta etapa se utiliza nuevos tubos de ensayo, a los cuales les agrega el filtrado de la anterior. Los que no debern presentar opalescencia ni turbidez.

IV.

RESULTADOS :

Figura n 1: Tubos sistema B: de izquierda a derecha; TUBO B; TUBO I; TUBO II

V.

DISCUSIN :
El ciclo de la urea est dirigido por enzimas tal como la Arginasa; en los tubos de los sistemas: Tubo I: se agrego sustrato (Arginina), enzima (homogenizado heptico-Arginasa) por lo que se obtuvo ornitina y urea la que se degrado por accin de la ureasa liberando amoniaco siendo reconocido por el reactivo de Nessler dando la coloracin que se observa en la figura n 1 Tubo II: al no agregarle sustrato no se vio accin de la Arginasa, por lo tanto no se obtuvo urea; ni coloracin.

VI.

CONCLUSIONES :
La Arginasa cumple una funcin crucial en el ciclo de la Urea, convirtiendo la Arginina en Ornitina y Urea, a travs de una hidrlisis. La urea (conteniendo dos grupos amino; siendo perjudicial su acumulacin en iones amonio NH4+) resultante se excreta mientas la ornitina vuelve nuevamente al ciclo.

VII.

BIBLIOGRAFIA: Stryer, L.; Bioqumica; 2002; Edit. Reverte. Espaa