PRCTICAS DE GENTICA DEL DESARROLLO

Curso 2007-2008

Profesores: Elisa Gmez Snchez Joaqun Royo Crcamo

INTRODUCCIN GENERAL

Una vez que se obtienen mutantes que afectan al desarrollo de un organismo es preciso caracterizar los problemas que presentan, bien para descartar aquellos mutantes que no afecten a las estructuras o momentos del desarrollo que nos interesen, bien para comprender mejor lo que est pasando en ellos y tratar de determinar cmo tiene lugar ese desarrollo. Esta caracterizacin puede ser nicamente del aspecto externo (por ejemplo microscpica) o bien puede hacerse de la actividad de genes que sabemos se expresan en determinadas regiones y momentos. El grano de maz contiene diversos tejidos que aparecen en posiciones muy concretas y en momentos bien definidos de su desarrollo. Cada uno de esos tejidos se puede caracterizar no slo por un aspecto peculiar de sus clulas al microscopio sino tambin por expresar grupos particulares de genes que no lo hacen en otros: son los denominados genes marcadores. Por ello, una manera de identificar con precisin la aparicin de esos tejidos durante el desarrollo, sobre todo en aquellos casos en que las diferencias morfolgicas no son especialmente claras, es mediante el seguimiento de la expresin de tales genes, ya sea a travs de sus RNAm, ya de sus protenas. En mutantes en los que el desarrollo del grano se vea alterado cabe esperar que se produzcan modificaciones en el patrn de expresin (espacial o temporal) de los genes marcadores de algunos de esos tejidos. Por consiguiente, el anlisis de la expresin de estos genes puede ser un sistema eficaz para hacer un cribado de mutantes que afectan al aspecto externo del grano pero que no estamos seguros de que lo hagan como consecuencia de alteraciones en su desarrollo, o que no sabemos en qu parte concreta de ellos estn realmente afectados. En esta prctica vamos a emplear dos mtodos para estudiar la expresin de estos genes marcadores: aislamiento del RNA total del grano como paso previo para el anlisis de los cambios de expresin a lo largo del tiempo de los genes de inters (bien mediante RT-PCR en tiempo real, o bien mediante Northern), e inmunolocalizacin de las protenas que se expresan desde estos genes en cortes de granos (un mtodo que permite detectar cambios de expresin no slo temporales sino tambin espaciales). Los resultados de este doble anlisis sobre diversos mutantes que parecen afectar al desarrollo del grano de maz nos permitirn extraer conclusiones sobre los efectos que realmente estn causando esas mutaciones y determinar si merece o no la pena proseguir su anlisis y tratar de identificar el gen o genes afectados en ellos.

I) PREPARACIN DE RNA El RNA es por lo general ms sensible que el DNA a la degradacin por nucleasas. Las nucleasas que actan especficamente sobre el RNA, las RNAsas, son abundantes en las muestras biolgicas y tambin estn presentes en las manos y en general por toda la superficie de nuestros cuerpos. Adems, muchas RNAsas son enzimas bastante estables y difciles de inactivar, incluso autoclavando las soluciones. Por ello, a la hora de extraer RNA de un material biolgico hay que procurar eliminar rpidamente las que estn presentes en el material de partida con soluciones desnaturalizantes en el tampn de extraccin y a partir de ese momento evitar que se introduzcan nuevas RNAsas procedentes de nosotros mismos o presentes en las soluciones que empleemos. Las precauciones de orden general a tomar durante la extraccin y manipulacin del RNA son: a) usar siempre guantes y cambiarlos cada vez que se ensucien, b) no hablar cuando se estn pipetendo soluciones con RNA o manipulando material o reactivos que se vayan a emplear en su preparacin. En la saliva hay RNAsas, c) emplear tubos eppendorf y puntas de micropipeta que no se hayan tocado con las manos desnudas y que hayan sido convenientemente tratadas para eliminar restos de RNAsas, d) usar material de vidrio tratado con soluciones inactivadoras de RNAsas y manipularlo a partir de ese momento siempre con guantes y cuidando de no contaminarlo con RNAsas, e) emplear soluciones preparadas con H2O-DEPC en vez de H2O normal. El DEPC (dietil pirocarbonato) es un inhibidor de RNAsas. Se vende como una solucin que tiene que aadirse al H2O a una concentracin final del 0.1%. Tras ello, se deja una noche agitando para que se mezcle bien e inactive por completo las RNAsas y despus, y antes de usarlo, se autoclava (120C 2030 minutos) un par de veces el H2O-DEPC para eliminar el DEPC que ya ha cumplido su misin (el DEPC produce modificaciones qumicas en el RNA que lo degradan pero se elimina con facilidad al autoclavar). En esta prctica se extraer RNA de granos de maz en desarrollo de diversos genotipos a fin de comprobar posteriormente, mediante RT-PCR en tiempo real, la expresin de una serie de genes marcadores de diversos compartimentos del grano (es decir, que se expresan especficamente y de un modo conocido en cada uno de esos compartimentos). La comparacin entre los patrones de expresin de estos genes en los diferentes genotipos nos permitir determinar si en alguno de ellos hay alteraciones o problemas en el desarrollo de tales compartimentos. Para la extraccin se emplear un sistema de extraccin rpida en tubos eppendorf llamado FastRNA Pro Green Kit de la empresa Q-Biogen.

PROCEDIMIENTO A SEGUIR: 1) Pulverizar 100-300mg de material vegetal congelado en N2 lquido y pasar a tubos de tapa verde con tapn de rosca que contienen la Matriz D (una especie de bolas que pulverizan ms an el material al poner los tubos en una mquina agitadora especial). Evitar en todo momento que el material se descongele antes de aadir la solucin de extraccin RNAproTM en el paso 2 ya que en el material descongelado comienza inmediatamente la degradacin del RNA. 2) Aadir al tubo 1ml de solucin RNAproTM y tapar bien el tubo. Es importante que queden unos 5mm de espacio libre en la parte superior del tubo para que en el paso siguiente se mezcle bien su contenido y evitar posibles fugas o roturas del tubo. Si el volumen final es demasiado grande no se debe procesar toda la muestra en un solo tubo sino en varios. 3) Poner los tubos en la mquina homogenizadora FastPrep y tenerla en funcionamiento 40 segundos a una velocidad de 6. Si tras este paso se comprueba que la muestra no est completamente homogeneizada dejar el tubo en hielo al menos 2 minutos antes de repetir el proceso. De este modo se evita que las muestras se calienten en exceso, lo que puede degradar el RNA. 4) Sacar los tubos de la mquina y centrifugarlos a no menos de 12000 x g durante 5 minutos a 4C o a temperatura ambiente. 5) Pasar el lquido (aproximadamente 750l) a un tubo eppendorf. Es importante pasar slo el lquido dejando atrs partculas slidas del material vegetal y la Matriz D. El tubo eppendorf al que pasamos el lquido tiene una resina especial que ayudar a que en el paso 10 sea ms fcil recoger la fase acuosa. 6) Dejar el tubo con el lquido a temperatura ambiente 5 minutos. Este paso aumenta el rendimiento de RNA extrado. 7) Aadir 300l de cloroformo (SIN alcohol isoamlico) y mezclar con vortex durante unos 10 segundos. 8) Dejar 5 minutos a temperatura ambiente para que se separen bien las protenas del RNA. 9) Centrifugar los tubos a no menos de 12000 x g durante 5 minutos a 4C. 10) Pasar el lquido de la fase SUPERIOR (la fase acuosa que contiene el RNA) a un nuevo tubo eppendorf. Hay que tener cuidado de NO pasar nada del material que queda entre las dos fases ya que se trata de buena parte de las protenas que queremos eliminar. Si a pesar de nuestras precauciones arrastramos al nuevo tubo parte de ese material habr que repetir la centrifugacin cuidando esta vez de no volver a arrastrarlo. 11) Aadir a la muestra recogida en el paso 10 500l de etanol absoluto fro, mezclar bien invirtiendo el tubo unas 5 veces (hasta que no se note que haya dos fases en el lquido) y dejar a -20C durante al menos 30 minutos para que precipite el RNA.

12) Centrifugar los tubos a no menos de 12000 x g durante 15 minutos a 4C y quitar el lquido (sobrenadante) que se desecha. El RNA aparece como un precipitado blanco (pellet) pegado a la pared inferior del tubo. Si el pellet no se queda fijo sobre la pared sino que flota en el lquido conviene centrifugar de nuevo para evitar perderlo al extraer el lquido. 13) Lavar el pellet de RNA aadiendo 500l de etanol al 75% fro. De este modo se eliminan sales que pueda contener. 14) Quitar el etanol dejando lo menos posible, pero con cuidado de no perder el pellet, y dejar secar al aire unos 5 minutos a temperatura ambiente para que se evapore el restante. Cuanto ms se haya quitado previamente, ms rpido se secar lo que quede. No conviene, de todos modos, dejar secar el pellet de RNA demasiado tiempo porque un RNA demasiado seco se disuelve en H 2O con dificultad. Tras haberlo dejado secar, aadir al tubo 50l de H2O-DEPC y mezclar bien con vortex para que ayudar a que el pellet de RNA se disuelva. 15) Para determinar la concentracin de RNA se mide la absorbancia a 260, OD260. Para ello usaremos un volumen de entre 1 y 5l que mediremos en un espectrofotmetro. Como blanco se usa el H2O-DEPC en que hemos disuelto el RNA. Para calcular la cantidad de RNA hay que tener presente que OD260 = 1 indica una concentracin de RNA de 40g/ml. 16) Para determinar el estado del RNA obtenido, si est degradado o no, conviene correr una alcuota de aproximadamente 1g en una electroforesis en agarosa en condiciones desnaturalizantes. Se usan esas condiciones desnaturalizanes, y no las normales en geles de agarosa para DNA, porque las molculas de RNA tiene tendencia a formar estructuras secundarias intracatenarias que si no se eliminan corren mal en la electroforesis y no forman bandas ntidas. Esto supondra un problema ya que nuestro criterio para determinar que el RNA obtenido no est degradado es observar bandas ntidas del RNA ribosomal en vez de manchas difusas. Para la electroforesis se emplea un gel de agarosa al 1.5% que contiene formaldehdo (eso es lo que lo hace desnaturalizante): para 200ml de gel de agarosa pesar 1.5gr de agarosa, aadir 32 ml de formaldehdo y 20ml de tampn 10xMEN (MOPS 200mM, Acetato sdico 50mM, EDTA 20mM, llevado a pH=7 con NaOH). El tampn de electroforesis ser 1xMEN. A las muestras de RNA se les aade un volumen igual al de muestra de formamida, 3/10 de formaldehdo, 1/4 de tampn 10xMEN y 1l de bromuro de etidio (para detectarlo por fluorescencia al iluminar con luz UV). El conjunto se calienta a 65C durante 10 para que el RNA quede desnaturalizado y se carga en los pocillos del gel. 17) El RNA en H2O se guarda a -80C. A esta temperatura es perfectamente estable si no hemos contaminado la solucin con RNAsas durante el proceso.

II) INMUNOLOCALIZACIN EN PREPARACIONES MICROSCPICAS En esta prctica vamos a analizar cortes histolgicos de granos en maz en desarrollo de diversas edades procedentes de una lnea portadora de una mutacin que afecta al aspecto externo del grano. Estos granos proceden de plantas heterocigotas para la mutacin, de modo que tendremos tanto wt como mutantes, y vamos a tratar de determinar si los mutantes muestran alteraciones en dos tejidos importantes del grano, las clulas de transferencia y la aleurona, siguiendo la acumulacin de las protenas producto de tres genes marcadores: BETL1 y BETL2, especficos de las clulas de transferencia, y SBT, de la aleurona, mediante anticuerpos especficos de cada una de ellas. En la prctica pondremos a incubar cortes de estos granos de diferentes edades y genotipos con anticuerpos para las tres protenas (por separado, unos portas con un anticuerpo, otros con otro, nunca ms de uno en cada porta), anticuerpos obtenidos de conejos (anticuerpos primarios). Tras lavar el anticuerpo primario de las zonas del grano donde no se haya unido especficamente a su protena diana, se detecta el que permanece unido mediante un anticuerpo secundario que se ha preparado en un animal que no sea un conejo (generalmente una cabra) y que reacciona con los anticuerpos de conejo, sean cuales sean estos. Este anticuerpo secundario lleva unida la molcula biotina y quedar en los cortes slo donde haya presente anticuerpo primario. A continuacin, se aade el estreptavidina-peroxidase conjugate, una molcula que lleva conjugadas estreptavidina y el enzima peroxidasa y que se une slo donde est el anticuerpo secundario (por la interaccin estreptavidina-biotina). Su presencia en partes concretas de la preparacin puede ser detectada mediante una reaccin enzimtica de la peroxidasa (tincin con diaminobencidina, DAB) que deja un precipitado oscuro slo all y que puede verse al microscopio.

PROCEDIMIENTO A SEGUIR: INMUNOLOCALIZACIN POR DAB (DIAMINOBENCIDINA) (SIGMA FAST) Los cortes son de un tejido que est incluido en parafina, pero en esas condiciones no puede tener lugar la interaccin antgeno-anticuerpo por lo que primero hay que quitar la parafina y rehidratar el tejido presente en los cortes. Estos pasos se hacen secuencialmente en las preparaciones que estn pegadas sobre los portas incubndolos primero en xilol para quitar la parafina y despus en soluciones de alcohol progresivamente ms diluidos hasta llegar a una solucin del tampn PBS donde puede tener lugar sin problemas la interaccin antgeno-anticuerpo. 1. DEPARAFINIZAR: 2 x 10 en xilol 2 x 10 en alcohol 100% 1 x 5 en alcohol 70 % 1 x 5 en alcohol 50 % 1 x 5 en alcohol 30 % 1 x 5 en PBS Una vez que las soluciones estn hidratadas se trata de bloquear los posibles sitios donde haya actividad peroxidasa endgena del tejido (ya que para la deteccin final, paso 11, slo queremos que haya actividad peroxidasa donde tengamos el anticuerpo terciario) y los sitios inespecficos de unin a anticuerpos, de modo que los que usemos luego se unan slo donde estn sus antgenos especficos. 2. 1 x 20 de bloqueo peroxidasa (0.3% en H2O de una solucin de agua oxigenada al 30%) 3. 1 x 5 en PBT (PBS con 0.1% Tween 20) 4. 1 x 20 Bloqueo en 2% suero de burro en PBT/BSA (PBT con 1% BSA). Se trata de suero de burro diluido al 2% en ese tampn. Ahora se van a incubar las preparaciones con el anticuerpo primario (el que reconoce las protenas que queremos detectar). Cada anticuerpo se usa ms o menos diluido en PBT/BSA segn los resultados de experimentos previos de puesta a punto que dependen en buena medida de la fuerza de la respuesta inmune que haya tenido el conejo del cual se ha obtenido y de si se ha purificado ms o menos desde su suero. Como regla general, puede decirse que si un anticuerpo se diluye demasiado poco puede dar reaccin con antgenos inespecficos. Por otro lado, si se diluye demasiado puede llegar a no detectarse nada aunque haya protena presente. Del anticuerpo diluido se ponen unos 200 l por cada porta de modo que cada corte quede completamente baado (si un corte quedara seco no habra reaccin). A continuacin se pone sobre cada porta un cubre, las preparaciones se guardan en cajas de modo que se minimice la evaporacin y se incuban un periodo de tiempo que puede variar segn las condiciones. Nosotros lo dejaremos toda la noche (O/N) a 4C.

5. 2 h a RT, 1h. a 37C, u O/N a 4C Anticuerpo primario diluido en PBT/BSA (clculos de 200 l/porta) El da siguiente se quitan los cubres con cuidado para no arrancar los cortes de los portas y se lava el anticuerpo que no se haya unido especficamente con PBT. Tras ello, se incuba primero con el anticuerpo secundario, se lava el unido no especficamente con PBT, se incuba luego con el estreptavidina-peroxidase conjugate y se lava el unido no especficamente con PBT. Para cada una de estas incubaciones el anticuerpo secundario y el estreptavidina-peroxidase conjugate se aaden como se hizo con el primario, aunque sin poner los cubres. A continuacin se procede a la reaccin de deteccin de la peroxidasa con DAB (diaminobencidina). El substrato se prepara a partir de dos pastillas de producto concentrado (Sigma Fast) que se disuelven en 5 ml de H 2O ultrapura y se aade sobre los cortes, dejndose hasta que empiece a verse la aparicin de color sobre partes de ellos (por lo general en menos de 10). Inmediatamente, se lava con PBS para detener la reaccin y evitar que se acabe ennegreciendo toda la preparacin de forma inespecfica. 6. 2 x 5 PBT 7. 30 Anticuerpo secundario en PBT/BSA (Ab2 unido a biotina diluido a 1:800) 8. 2 x 5 PBT 9. 30 estreptavidina-peroxidase conjugate en PBT/BSA (diluido a 1:750) 10. 2 x 5 PBT 11. Substrato hasta tincin DAB (<10): mezclar las 2 pastillas en 5 ml agua ultrapura 12. 1 x 5 PBS 13. 1 x 3 Azure B 14. 3 x 1 H2O y dejar secar. Una vez secas, las preparaciones se montan con cubres para poder observarlas al microscopio ptico y buscar alteraciones en los patrones espacial y/o temporal de expresin de los genes marcadores al compararlos con los de granos wt. Preparacin de las soluciones (clculos para 25 portas): 1. 2. 3. Preparar 2 litros de PBS (NaCl 0.13M; Na2HPO4 7mM; NaH2PO4 3mM), Preparar 1,6 litros de PBT (1,6 litros PBS + 1,6 ml Tween) Preparar 200 ml de PBT y BSA al 1% (2 gr de BSA), de ellos:

Llevar a 185 ml de volumen final 3,70 ml de suero de burro 5 ml con el Ac 1ario (La dilucin a emplear es de 1:400 para los de las protenas BETL1, BETL2 y SBT) 5 ml con el Ac 2ario 5 ml con el estreptavidina-peroxidase conjugate