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Influenza Aviria

Nelson Rodrigo da Silva Martins

ndice
Definio, etiologia, nomenclatura e composio Definio Etiologia Nomeclatura de classificao Composio

Controle, erradicao e riscos Programa Nacional de Sanidade Avcola Office International des Epizooties Risco de Influenza Aviria no Brasil

Epidemiologia Epidemiologia Transmisso Mutaes

Doena Doena clnica Impacto econmico Zoonose Patognese Diagnstico Isolamento e identificao do vrus

Diagnstico sorolgico Diagnstico e identificao por gentica molecular

Medidas de controle Vacinas Biossegurana Desinfetantes Tratamento

Literatura Literatura consultada

Definio, etiologia, nomenclatura e composio


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Definio Etiologia Nomeclatura de classificao Composio

Definio
Doena infecciosa viral altamente contagiosa, causada pelos vrus da influenza aviria (AIV), integrantes de Orthomyxoviridae, do gnero Influenza A, de patogenicidade intravenosa maior que 1,2 (aves SPF de seis semanas), ou causada por AIV dos subtipos H5 ou H7, ou estirpes cuja glicoprotena da fuso (em HA2) apresente o stio de clivagem com seqncias de mltiplos aminocidos bsicos, extica para avicultura industrial brasileira, de notificao e erradicao obrigatrias, classificada no grupo A de doenas da O.I.E.

Figura 1 - Fotomicrografia eletrnica (Fonte: Linda M. Stannard, 1995)

Etiologia
Os vrus da influenza avirios (AIV) so classificados em Orthomyxoviridae no gnero Influenza A. Os gneros Influenza B e C da famlia ocorrem em humanos.

Nomeclatura de classificao
A identificao dos gneros de AIV (A, B ou C) seguem nomenclatura internacional, como segue: /espcie hospedeira/ localizao geogrfica/ nmero de referncia laboratorial/ ano de isolamento/ subtipo de HA e de NA (ex.: A/Environment/Hong Kong/437/99/H5N1).

Composio
Estes so os componentes ordenados de dentro para fora do vrion: cido nuclico RNA de fita simples, Nucleoproteina (forma o nucleocapsdio em torno do RNA) e M1 (forma pontes entre a nucleoprotena e as glicoprotenas do envelope). Como os demais integrantes de Orthomyxoviridae, os AIV tm envelope (Figura 1) de dupla camada lipdica que contm protenas inseridas. A hemaglutinina (HA; 500 unidades por vrion) tem funes de adsoro (rea antignica B de HA1, cabea da HA) aos receptores (cido N-acetil neuramnico ou silico da glicoprotena receptora) celulares e fuso (eixo ou haste de HA2) membrana citoplasmtica e neuraminidase (NA; 100 unidades por vrion). A NA tem a funo de liberao (remoo de cido silico da HA) das partculas de vrus que emergem da clula (brotamento), remoo de mucopolissacardios inibidores da HA e penetrao no muco epitelial. Na regio interna do vrion, o cerne, aproximadamente 1000 unidades da nucleoprotena formam um envoltrio protetor (capsdio) do genoma (RNA) (Figura 2).

Figura 2 - Estrutura do vrus da Influenza (Fonte: Revista Isto 1561, 01/09/1999)

Figura 3a Replicao dos influenza vrus: 1. Adsoro e endocitose; 2. Abaixamento do pH nos endossomos; 3. Ativao do poro inico; 4. Entrada dos ons H+; 5 e 6. Fragilizao dos contatos M1-RNP e M1-HA.

Figura 3a - Replicao

Figura 3b Mudana conformacional na HA; 8. Translocao da regio hidrofbica da HA2; 9. Fuso da HA e dupla camada lipdica do endossomo; 10. Liberao da RNP para o citoplasma; 11. Migrao da RNP para o ncleo; 12. Transcrio do RNA no ncleo celular; 13. Traduo do RNAm no retculo endoplsmico rugosos (RER); 14. Maturao no aparelho de Golgi; 15. Insero das protenas do envelope na membrana celular; 16. Brotamento.

Figura 3b - Mudana conformacional

Controle, erradicao e riscos


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Programa Nacional de Sanidade Avcola Office International des Epizooties Risco de Influenza Aviria no Brasil

Programa Nacional de Sanidade Avcola


A influenza aviria doena enquadrada no grupo A de epizootias da O.I.E. de notificao obrigatria no pas. A influenza aviria doena extica no Brasil e o Programa Nacional de Sanidade Avcola (PNSA) mantm monitorao permanente das aves das principais espcies domsticas e de explorao comercial mais recente (Struthio camelus ou Rhea americana). Os reprodutores so acompanhados por amostragens peridicas, conforme previsto no PNSA e preconizado pela O.I.E., em iniciativa da prpria indstria, beneficiada diretamente pela certificao de qualidade. A sade dos plantis de galinhas avaliada por monitorao permanente, por seus reflexos qualidade, neste contexto, quanto s respostas aos programas de vacinao, por exemplo, contra bronquite infecciosa, doena de Newcastle e doena infecciosa bursal, entre outras. O PNSA estabelece as normas de atuao para o controle e erradicao da AI (junto com a doena de Newcastle) no Projeto de Vigilncia Ativa (Projeto de Vigilncia..., 2001), que so:

1.Notificao de focos da doena (e confirmao laboratorial no LARA-Campinas); 2. Assistncia a focos; 3. Medidas de desinfeco; 4. Sacrifcio sanitrio; 5. Vazio sanitrio; 6. Vacinao dos plantis ou esquemas emergenciais; 7. Controle e fiscalizao dos animais susceptveis; 8. Outras medidas sanitrias. O atendimento ao foco, que segue as normas do PNSA, prev: 1. Interdio e coleta de materiais para exame laboratorial oficial; 2. Registro das aves por espcie(s), categoria(s) e nmero(s); 3. Manuteno de aves. utenslios e produtos no local; 4. Proibio de trnsito de e para a(s) propriedade(s) em um raio de 10 km; 5. Controle de todos os animais e materiais possveis fontes de propagao; 6. Desinfeco de vias de entradas e sadas (s) propriedade(s); 7. Inqurito epidemiolgico; 8. Confirmao laboratorial: isolamento de agente letal hemaglutinante em ovos embrionados de galinhas SPF, no inibido (inibio da hemaglutinao) ou no neutralizado (soroneutralizao) por soro especfico para o vrus da doena de Newcastle; 9. Caracterizao do agente como vrus da influenza aviria (AIV) por deteco de antgenos da nucleoprotena e/ou matriciais de AIV e de seu subtipo por ensaios especficos para a caracterizao da hemaglutinina e neuraminidase (imunodifuso, imunoenzimticos ou moleculares); 10. Abate e destruio imediata (cremao) de todas as aves, resduos, carnes e ovos da(s) propriedade(s) atingida(s) e vizinhas (raio de 3 km); 11. Limpeza e desinfeco das instalaes; vazio sanitrio (mnimo 21 dias); 12. Permitir o transporte para o abate ou incubao dentro da zona de vigilncia (raio de 10 km); 13. Proibir feiras, exposies, mercados na zona de vigilncia (10 km); 14. Aplicar estas medidas por mnimo de 21 dias aps a destruio das fontes de propagao e desinfeco das instalaes, proibir a retirada de aves e produtos na zona de proteo (3 km) por 21 dias e 15 dias na zona de vigilncia (10 km).

Office International des Epizooties


A certificao de rea livre segue as normas da OIE (e PNSA), considerando AI extica no Brasil (pas livre) e exige: 1. 2. AI de alta patogenicidade no diagnosticada pelo sistema de vigilncia pelos ltimos 3 anos; Um perodo de 6 meses aps o abate, destruio das aves e resduos e desinfeco aps surto.

Risco de Influenza Aviria no Brasil


A avicultura comercial predominante no Brasil (galinhas e perus) emprega a mais atual tecnologia e conhecimento cientfico na produo, na qual os plantis so gerenciados com biossegurana, avaliao permanente dos pontos crticos e sistema de qualidade total, incluindo programas de vacinaes que garantem a preveno de inmeros problemas sanitrios. A preveno de influenza aviria especialmente favorecida por estas caractersticas de manejo, onde a produo desenvolvida em instalaes (galpes), em que o alojamento dos plantis dificulta o desafio eventualmente imposto pelas aves de vida livre. As rotas migratrias das aves reservatrio podem tambm exercer papel no menor risco de influenza nas aves comerciais do Brasil. O baixo ndice de replicao dos AIV nas aves migratrias durante a passagem pela regio subtropical tambm pode influir para a menor ocorrncia. As espcies de aves domsticas de importncia comercial mais sensveis infeco e potencialmente envolvidas no papel de fonte de infeco, conforme citadas na literatura internacional, perus e patos, so mantidas em galpes industriais com sistema de biossegurana e com reas de produo de distribuio geogrfica bastante restrita, em contraste com as criaes pases com relatos de surtos, em que se associam as condies de

desafio naturais geogrficas ditadas pelas rotas migratrias, agravadas pela mais alta taxa de replicao de AIV na ave na estao de residncia nos pases temperados, alm da produo/criao destas espcies nestes pases ocorrer comumente em campo aberto.

Epidemiologia
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Epidemiologia Transmisso Mutaes

Epidemiologia
Inmeros diferentes isolados do AIV circulam entre diversas espcies animais ao redor do mundo. Embora AIV possa infectar enorme diversidade de espcies das classes de Aves e Mamferos, so tidas como reservatrios naturais as aves aquticas, aves habitantes das praias e gaivotas, sendo consideradas aberrantes as infeces em galinhas, perus, sunos, eqinos e humanos (Suarez, 2000). O alto nvel de recombinao gentica, observado especialmente entre integrantes dos AIV do tipo A, conseqncia do genoma segmentado, que permite permutaes de genes, em contraste com integrantes de Paramyxoviridae, por exemplo o vrus da doena de Newcastle, que no apresentam recombinao detectvel por apresentar genoma no segmentado (Kingsbury, 1990.) A baixa incidncia dos AIV nos perodos migratrios sub-tropicais das aves aquticas (Murphy & Webster, 1996) pode explicar a baixa ou rara ocorrncia no Brasil. As informaes sanitrias esto disponveis no Office International des Epizooties (http://www.oie.int/esp/info/hebdo/EIS_01.HTM). As fontes de transmisso para as aves industriais podem ser categorizadas por importncia em (1) outras espcies de aves domsticas (p. ex. patos para galinhas); (2) aves de companhia exticas; (3) aves selvagens e (4) outras espcies animais (suinos para perus) (Alexander, . As aves aquticas da ordem Anseriformes e de praia so consideradas fonte de infeco para as procelrias (Procellariidae, Puffinus sp.; Diomedeidae; Hydrobatidae; Pelecanoididae), gaivotas (Laridae, Larus sp.), passeriformes e mamferos (Murphy & Webster, 1996).

Transmisso

AIV so transmitidos de ave infectada para susceptvel principalmente de secrees dos sistemas respiratrio e digestrio, direta ou indiretamente, esta ltima especialmente por equipamentos contaminados com fezes (insetos, veculos de transporte, bebedouros, gua, comedouros, rao, gaiolas, pessoal por roupas, calados e botas, etc.) . As aves de vida livre podem transmitir diretamente a infeco ao inadvertidamente compartilharem o ambiente de criao.

Mutaes
Variaes pequenas, leves ou sutis nos genes que codificam a hemaglutinina e neuraminidase no resultam sempre em alteraes antignicas capazes de modificar stios antignicos relacionados induo de proteo, permanecendo a estirpe no mesmo subtipo de HA e/ou NA (antigenic drift). Estas modificaes podem acumular e resultar em mudana do subtipo de HA e/ou NA (antigenic shift), que ocasiona os surtos de influenza nas populaes animais e humanas. As grandes alteraes genticas (shift) resultam de mutaes, recombinao gentica e/ou adaptao ao hospedeiro (seleo natural do AIV vivel frente as barreiras da imunidade). A evoluo de variantes de AIV capazes de apresentar carter zoontico constante e tem sido demonstrada experimentalmente. As etiologias pelo menos das ltimas duas pandemias (1918-1919 e 1968) foram caracterizadas como estirpes hbridas que continham genoma recombinante de AIV de aves e humanos. A ameaa de pandemia por AIV em humanos preocupao permanente dos agentes de sade pblica uma vez que h evidncias dos vrus H5N1 e H9N2 terem sido transmitidos de aves para humanos nos mercados de aves de Hong Kong (Horimoto & Kawaoka, 2001). Alguns subtipos de AIV tm importncia direta em sade humana. O AIV H5N1 que ocasionou o bito de 6 pessoas em Hong Kong em 1997 foi transmitido diretamente de galinhas para humanos. A adaptao a novo hospedeiro significa principalmente alterao rpida das glicoprotenas da superfcie, especialmente da hemaglutinina (HA), embora o H5N1 tenha apresentado mudanas de aminocidos em outras protenas e no em HA, indicando que sua HA est altamente adaptada s aves, no necessitando mudar e que os outros genes podem advir de outras origens por recombinao gentica, inclusive com seqncias internas de consenso previamente encontradas em humanos, a exemplo de H5N1. As seqncias de aminocidos de origem humana obtidas por recombinao podem ter importncia como determinantes do aspecto zoontico (Zhou et al., 1999b). A recombinao gentica entre influenza de aves, sunos e humanos foi demonstrada, aps episdios de doena respiratria em plantis de sunos na Carolina do Norte (NC), Texas (TX), Minnesota (MN) e Iowa (IO) em 1998. O isolado da NC resultou de recombinao entre H3N2 de humanos com o clssico H1N1 de sunos e os demais de H3N2 humano, H1N1 clssico suno e genes de vrus de aves (AIV). A hemaglutinina dos quatro isolados obtidos derivou-se de H3N2 humano em circulao em 1995 (Zhou et al., 1999a).

Doena
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Doena clnica Impacto econmico Zoonose Patognese Diagnstico Isolamento e identificao do vrus Diagnstico sorolgico Diagnstico e identificao por gentica molecular

Doena clnica
A influenza aviria (AI) inclui amplitude de sndromes que se manifestam desde infeco subclnica, doena suave respiratria das vias superiores ou doena fatal generalizada em aves domsticas. Os perus e patos so considerados muito sensveis. Entretanto, os episdios de doena, especialmente em perus, tm tido relao com a criao a cu aberto (EUA e Europa), quando h risco maior imposto espcie, por AIV de aves Anseriformes migratrias. Os sinais clnicas so principalmente percebidos nos sistemas respiratrio, digestrio, nervoso e/ou reprodutivo. Em galinhas quadros respiratrios de leves a graves, com estertores, conjuntivite, corrimento nasal, edema da face e cabea acompanhados ou no de diarria e/ou quadro nervoso tm sido mais relatados. Em matrizes de frangos de corte criadas prximas de propriedade com patos foram descritos edema subcutneo, congesto circulatria na cabea e palidez no msculo do peito.

Impacto econmico
Os episdios em Minnesota nos EUA entre 1979 e 1981 resultaram em despesas anuais em torno de 1 milho de dlares (Davison et al., 1999a; Poss et al., 1982), relacionadas com perdas de produtividade em ganho de peso e produo de ovos. Os custos com indenizaes, diagnstico, suporte tcnico e comando ttico (Pennsylvania - sacrifcio de mais de 11,2 milhes de aves mais de 7,2 milhes de poedeiras e 3,6 milhes de frangos de corte em 278 propriedades) no programa de erradicao da AI (novembro de 1983) na Pennsylvania e Virginia, somaram US $ 33.468.891,00 (Avian Influenza Task Force, 1984)

Zoonose
A ameaa de pandemia por AIV em humanos preocupao permanente dos agentes de sade pblica. H recentemente evidncias dos vrus H5N1 e H9N2 terem sido transmitidos de aves para humanos nos mercados de aves de Hong Kong (Horimoto & Kawaoka, 2001). Alguns subtipos de AIV tm importncia direta em sade humana. O AIV H5N1 que ocasionou o bito de 6 pessoas em Hong Kong em 1997 foi transmitido diretamente de

galinhas para humanos. A adaptao a novo hospedeiro significa principalmente alterao rpida das glicoprotenas da superfcie, especialmente da hemaglutinina (HA), embora o H5N1 tenha apresentado mudanas de aminocidos em outras protenas e no em HA, indicando que sua HA est altamente adaptada s aves, no necessitando mudar e que os outros genes podem advir de outras origens por recombinao gentica, inclusive com seqncias internas de consenso previamente encontradas em humanos, a exemplo de H5N1. As seqncias de aminocidos de origem humana obtidas por recombinao podem ter importncia como determinantes do aspecto zoontico (Zhou et al., 1999b). Uma estirpe de AIV classificada como A/Hong Kong/156/97 (H5N1) de alta patogenicidade foi descrita em episdio fatal de influenza em criana com faringite, tosse seca e febre, estirpe que apresentava mltiplos aminocidos bsicos no stio de clivagem da HA, carter associado alta patogenicidade para galinhas, nas quais resultou na mortalidade de 15/16 aves inoculadas. Mais 12 casos humanos com estirpes de AIV semelhantes foram isoladas, 3 obtidas de casos fatais (Subbarao et al., 1997).

Patognese
AIV patognicos foram por algum tempo relacionados com a presena de HA do subtipo H7, embora existissem estirpes no virulentas do mesmo subtipo isoladas de aves normais. A terminologia de peste aviria (fowl plague), associada a H7 foi sendo abandonada e substituida adotando-se critrios de classificao levando em conta a virulncia (especialmente AIV de alta virulncia: HPAIV-High Pathogenicity Avian Influenza), conforme as recomendaes de: 1. Qualquer vrus de influenza letal a 6, 7 ou 8 de 8 galinhas com 4-6 semanas de idade em um perodo 10 dias, inoculadas via intravenosa com 0,2 ml de lquido alantide a 1:10 sem bactrias; 2. Qualquer vrus da influenza dos subtipos H5 e H7 que no atinja o critrio acima, mas apresente seqncia de aminocidos no stio de clivagem da HA compatvel com as estirpes de alta virulncia (mltiplos aminocidos bsicos); 3. Qualquer vrus da influenza no integrante dos subtipos H5 e H7 que cause a morte de 1 a 5 das galinhas de 4 a 6 semanas de idade via intravenosa (item 1), em 10 dias e seja replicado em monocamadas celulares na ausncia de tripsina (Proceedings..., 1994). As leses dos sistemas respiratrio incluem seios paranasais com secreo fibrinosa, mucopurulenta ou catarral, traquia com edema e secreo de intensidade varivel na mucosa, sacos areos espessados e com exsudato seroso, fibrinoso ou fibrinopurulento. Ovoposio ectpica em poedeiras pode resultar em peritonite por ovo ectpico e por contigidade dos sacos areos. Poedeiras podem ainda apresentar salpingite com acumulao de exsudatos no oviduto. Enterite hemorrgica, fibrinosa (graves) ou catarral (leve) pode ser observada e mais comum em perus (intestino delgado e cecos).

Diagnstico
O diagnstico de influenza aviria depende do isolamento e identificao do vrus, uma vez que os sinais clnicos e leses so muito variveis entre os episdios. O quadro clnico e patolgico est dependente da estirpe de AIV e das caractersticas do hospedeiro, como espcie de ave, status imune especfico e no especfico, estado nutricional, doenas concomitantes etc. O isolamento e identificao viral deve seguir as normas previstas pela O.I.E. e por centros internacionais de referncia para influenza (por exemplo, Central Veterinary Laboratory, no Reino Unido), no Brasil pelo Programa Nacional de Sanidade Avcola (PNSA). O laboratrio de referncia para a identificao de AIV no Brasil o LARA (Laboratrio de Referncia Animal) em Campinas, So Paulo.

O diagnstico diferencial para a distino de AI de outras enfermidades de quadro clnico e patolgico semelhante sempre necessrio, especialmente para doena de Newcastle, clera aviria, micoplasmose e clamidiose.

Isolamento e identificao do vrus


A amostragem oficial efetuada por fiscais do Ministrio da Agricultura ou Mdicos Veterinrios autorizados. As amostras independentemente colhidas e isoladas devem ser caracterizadas no Laboratrio de Referncia Animal (LARA, Campinas) e, se necessrio, a amostragem oficial implementada. Alguns detalhes de amostragem e ateno ao foco esto descritos no captulo sobre o Programa Nacional de Sanidade Avcola. O PNSA est implantando o projeto de vigilncia ativa da doena de Newcastle e influenza aviria, para o qual os abatedouros recebero materiais (kit) para a colheita de amostras, incluindo frascos, etiquetas, canetas, sacos plsticos, seringas, swabs, fitas colantes, gelo reciclvel e caixa isotrmica de transporte (Projeto de Vigilncia..., 2001). H vrios manuais de prtica laboratorial, entre estes, Isolation and Identification of Avian Pathogens da American Association of Avian Pathologists e livros-texto, Calnek et al. Diseases of Poultry e Jordan et al. Poultry Diseases, nos quais os detalhes para o diagnstico de AI podem ser encontrados. Muitos tecidos e secrees das aves infectadas ou doentes so fonte de vrus para replicao e isolamento em laboratrio. Os tecidos recomendados para amostragem refletem o quadro clnico ou sistemas mais comumente atingidos pela infeco, principalmente sistema respiratrio e digestrio. As estirpes de HPAIV tm grande pantropismo infeccioso, atingem virtulamente todos os tecidos e de quaisquer tecidos podem ser isoladas. Altos ttulos de excreo fecal, que garantem alta transmissibilidade d e aves reservatrio (Anseriformes, Procellariformes e Laridae) para domsticas, permitem o isolamento dos AIV das fezes ou por amostragem cloacal (swabbing). A infeco respiratria por sua constncia garante o sucesso de isolamento nasofarngeo (por exemplo, fenda palatina) e da traquia, mesmo na ausncia de sinais clnicos (Easterday et al., 1997). Os substratos celulares e animais de laboratrio devem ser livres de patgenos e anticorpos especficos - SPF (specific pathogen free), entre estes os mais comuns so ovos embrionados, pintinhos e frangas/frangos e galinhas (Gallus gallus formadomestica). Outros hospedeiros experimentais so os perus Meleagris gallopavo formadomestica) e patos (Anas) so utilizados. AIV tambm so replicados em mamferos como marta (ferret) e vison (mink) (musteldeos, marta Mustela putorius e vison Mustela vison), camundongos, hamsters, gatos e sunos. Embries de galinhas SPF podem ser inoculados entre 9 e 11 dias de incubao via cavidade alantide com material de macerado de tecidos ou excrees tratados com antibiticos e antimictico. Os lquidos alantides (LA) dos embries vivos, mortos ou com alteraes de desenvolvimento em at sete dias aps a inoculao so examinados para atividade hemaglutinante misturando-se LA e hemcias de galinhas SPF a 5% (50 l de cada), com a hemaglutinao visvel pela formao de grumos. O agente com atividade hemaglutinante no LA caracterizado em testes para a identificao de influenza A em reao contra anticorpos especficos para a NP (imunodifuso em gel de gar AGP), de inibio da hemaglutinao com anticorpos policlonais ou monoclonais especficos contra cada subtipo de AIV e para diferencial do vrus da doena de Newcastle (VDN). Cultivos primrios de fibroblastos, rins e fgado de embries SPF so tambm substratos para o cultivo de AIV, os quais estirpes patognicas podem infectar sem tratamento enzimtico prvio, enquanto estirpes no patognicas necessitam tratamento prvio com tripsina em pH cido, para a ativao da glicoprotena da fuso (poro da HA2). Cultivos de rgos, como anis de traquias, so tambm excelentes substratos por permitirem o isolamento e o desenvolvimento de ensaios de caracterizao especfica do subtipo (neutralizao da HA ou NA) sem necessidade de adaptao.

Diagnstico sorolgico
Pode-se empregar os testes de inibio da hemaglutinao, inibio da neuraminidase ou imunoenzimticos (ELISA) para a monitorao sorolgica. ELISA comerciais esto disponveis para a deteco de anticorpos contra a nucleoprotena (NP) de AIV do tipo A e outros para a caracterizao do subtipo de AIV quanto hemaglutinina (HA) durante a identificao de estirpes. Detalhes dos ELISA comerciais esto descritos nos manuais dos fabricantes ou nos manuais de diagnstico de doenas avirias. A deteco de anticorpos contra a NP permite a demonstrao de contato prvio com AIV do tipo A, grupo em que esto todos os AIV. A caracterizao da resposta quanto especificidade dos anticorpos para as diversas HA existentes (subtipos) mais complexa e pode requerer um ensaio de captura de glicoprotena de cada subtipo (H1 a H15) e/ou anticorpos monoclonais. H variaes na intensidade da resposta imune natural para a NP conforme a espcie de ave, sendo os ttulos em patos muito baixos ou no detectveis em comparao com altos ttulos em perus e faises (Easterday et al., 1997). O PNSA no projeto de vigilncia ativa da doena de Newcastle e influenza aviria (Projeto de Vigilncia..., 2001) prev, para a certificao do status de pas livre, a amostragem, na linha de abate, de 24 aves por lote para a sorologia, colhendo-se 2 a 3 ml de sangue por ave individualmente em tubos de plstico estreis e os soros separados, centrifugados e congelados.

Diagnstico e identificao por gentica molecular


Mtodos da biologia molecular para a deteco e caracterizao do genoma de AIV tm sido descritos na literatura. Por exemplo, a deteco de regio conservada do gene da nucleoprotena (N) e/ou matriz (M1 e/ou M2) garante o diagnstico amplo de quaisquer estirpes de quaisquer subtipos do tipo A. Ensaios para a deteco de seqncias genmicas que codificam as glicoprotenas do envelope tm a vantagem de permitir a classificao quanto ao subtipo (HA e NA) e a desvantagem de resultados falso-negativos, contornveis em parte pela utilizao de iniciadores para os principais subtipos prevalentes.

Medidas de controle
ndice
Vacinas Biossegurana Desinfetantes Tratamento

Vacinas
Nos Estados Unidos o controle de HPAIV tem sido atingido com programas de erradicao, a mesma estratgia para as formas velognicas do vrus da doena de Newcastle (Villegas, 1998). Entretanto, novas estirpes de influenza vrus esto constantemente emergindo na populao humana e animal. O controle ideal deve incluir preveno da exposio, biossegurana, vigilncia epidemiolgica e diagnstico, educao, quarentena e depopulao. Algumas tentativas de vacinao foram integradas a programas de controle e erradicao de AIV. Mtodos de controle que contam com a ocorrncia de infeco baixa nos plantis no so aceitveis por gerao de oportunidade de mutao e recombinao. HPAIV embora no estejam permanentemente infectando aves aquticas selvagens, estas aves so portadoras de AIV de baixa patogenicidade, que cruzam as barreiras especficas de hospedeiros, ocasionando doena leve em aves domsticas e podem evoluir para HPAIV por mutaes ou recombinao da HA. As estirpes de HPAIV de surtos em aves domsticas so comumente isoladas de aves selvagens durante o surto (Swayne & Suarez, 2000). Vacinas inativadas do subtipo H5 contendo vrus ntegro, hemaglutinina expressa em baculovrus ou recombinante em pox galinha expressando hemaglutinina foram eficientes em induzir proteo ao desafio com mltiplas estirpes de HPAIV de H5 de quatro continentes, de seis espcies hospedeiras diferentes e obtidas em um perodo de 38 anos. A proteo foi eficaz para sinais clnicos e mortalidade e reduziu o nmero de aves e o ttulo da excreo viral. A mudana gentica suave (drift) no interferiu na proteo geral, embora tenha sido descrita para vrus humanos (Swayne et al., 2000b). Grupos de galinhas de 4 semanas de idade foram vacinados com HA de uma estirpe do subtipo H5, uma heterloga H7 ou lquido alantide (controle) e desafiados com uma estirpe de HPAIV H5. Todas dez HA avaliadas resultaram em proteo contra doena e mortalidade, com anticorpos detectados por IH e imunodifuso em gar (Swayne et al., 1999). Falhas de vacinas recombinantes tm sido tambm relatadas. Uma vacina recombinante de pox galinha expressando a hemaglutinina de HPAIV do subtipo H5 foi aplicada aps uma vacina de bouba e teve sua eficincia limitada em aves previamente imunizadas contra a bouba aviria (Swayne et al., 2000a). Bifidobacterium breve foi descrito como adjuvante para vacinas avaliadas em camundongos, nos quais houve melhor uniformidade da expresso de anticorpos na mucosa e proteo s portas de entrada (Yasui et al., 1994). Uma vacina recombinante de vrus da bouba das galinhas contendo o gene da HA do subtipo H5 foi aplicada em pintinhos de 1 dia e nenhum pintinho apresentou converso sorolgica, no interferindo com o programa de monitorizao sorolgica por imunodifuso em gar de rotina para AIV dos EUA, mas com 8% de positividade de baixos ttulos em IH. Houve proteo contra a doena clnica e mortalidade, aps desafio com HPAIV H5N2 isolada de galinhas (90-100% entre 3 e 20 semanas ps vacinao, com reduo entre 50 e 75% da excreo intestinal e respiratria do AIV de desafio nos vacinados, assim como reduo da transmisso por contato (Swayne et al., 1997). A expresso de genes de AIV em vrus que infectam insetos, especialmente baculovirus, est tambm descrita na literatura. Larvas de bicho-da-seda (Bombyx) so comumente usadas. Baculovirus foram utilizados para a expresso da hemaglutinina (HA) de isolados dos subtipos H5 e H7 de AIV e os produtos mantiveram atividade hemaglutinante e formaram rosetas em soluo, tanto quando expressas inteiras como quando expressas em partes,

indicando que a conformao tridimensional foi obtida. As HA foram imunognicas per se, mas a melhor resposta foi obtida com preparaes oleosas (gua em leo), com ttulos de anticorpos IH comparveis queles derivados de inoculao com vrus completo, mais altos e uniformes em aves de 3 semanas que em aves de um ou dois dias de idade. A proteo foi total ao desafio com estirpe de alta virulncia do subtipo homlogo (H5 ou H7), com nenhuma ou reduzida excreo de vrus j em 3 dias aps o desafio. A vantagem da ausncia de resposta imune aos demais componentes estruturais dos AIV permite a diferenciao das respostas imunes derivadas da vacina recombinante e infeces naturais por AIV (Crawford et al., 1999). Uma preparao de vacina recombinante expressando uma insero de H5 em vrus da bouba aviria protegeu galinhas contra sinais clnicos, mortalidade e excreo de vrus aps o desafio com HPAIV. As comparaes das seqencias deduzidas de aminocidos da HA indicaram que houve drift antignico no AIV excretado ps-desafio (Swayne et al., 2000a), resultado que alerta para o risco da imunidade provocar seleo de mutantes. Uma vacina de ISCOM (immune stimulating complex) induziu imunidade protetora enquanto a preparao de vacina com subunidades e no adjuvantada no resultou em proteo (Rimmelzwaan et al., 1999). A produo de vacinas para as estirpes de AIV de alta patogenicidade (HPAIV) esbarra na virulncia destas para o embrio, resultando em mortalidade muito precoce e baixos ttulos, assim como na necessidade de rigorosa biossegurana laboratorial (Takada et al., 1999). Vacinao in ovo foi descrita para AIV. Embries (White Leghorn-WL ou White Rock-WR) de 18 dias de embriognese foram vacinados com vacina oleosa contra AIV in ovo em vrios volumes e concentraes de antgeno e anticorpos sricos IH foram detectados a partir de duas semanas ps-ecloso entre 85 e 100% dos pintinhos, com proteo ao desafio com AIV de alta patogenicidade aos 34 dias de idade. A eclodibilidade dos embries inoculados com 100 de vacina no foi diferente dos embries controles (Stone et al., 1997).

Biossegurana
O controle de AIV em regies de avicultura densamente povoadas difcil, especialmente onde j existe estirpe de HPAIV circulando e disseminada. A avicultura industrial deve ser planejada para impedir a concentrao de granjas em rea geogrfica com proximidade e multiplicidade de idades e tipos de aves. As estratgias de biossegurana so essenciais para a reduo da disseminao de doenas infecto-contagiosas, entre estas influenza, reduzindo as despesas com medicao e melhorando a qualidade dos produtos. A implementao destas estratgias, alm da ateno aos focos, conforme recomendada pela O.I.E. para a erradicao das doenas da lista A, nos episdios ocorridos na avicultura industrial americana (Davison et al., 1999; Avian Influenza Task Force, 1984; Lasley, 1987), europia (Capua & Marangon, 2000) e asitica (Wei-Hua, 1998) impediu maiores prejuzos econmicos.

Desinfetantes
Para reduzir o risco de congelamento e manuteno da atividade virucida contra o AIV produtos anticongelantes tm sido avaliados em pases com invernos frios. Compostos fenlicos e quaternrio de amnia puros foram eficientes enquanto a soluo em etilenoglicol de amnia quaternria-formaldedo e o hipoclorito de sdio foram afetadas, este tambm afetado em propileno glicol. Um lquido anticongelante de pararisas comercial

manteve a eficcia de todos os desinfetantes exceto a combinao AF (Davison et al., 1999b). Perxido de hidrognio em vapor foi avaliado na desinfeco de AIV e outros vrus exticos, em cabine de descontaminao em unidades de isolamento, sem efeitos adversos sobre os equipamentos (Heckert et al., 1997).

Tratamento
O interferon tem sido avaliado para a terapia anti-AIV. Entretanto AIV pode desenvolver resistncia temporria ao interferon (IFN) alfa em parte da populao viral quando cultivado em clulas de galinha (Gallus) ou codornas (Coturnix) enquanto o restante permanece sensvel (Sekellick et al., 2000). O cido 4 - guanidino - 2-4 - dideoxy - 2,3 - didehydro -N- acetilneuramnico (4-guaninoNeu5Ac-2en), Zanamavir, GG167, um inibidor especfico da neuraminidase dos vrus influenza, em avaliaes in vivo no apresentou efeito profiltico embora tenha retardado o surgimento de febre e mortalidade em ensaios com apenas uma estirpe e no em duas outras de AIV. Experimentos com a droga amantidina, bem estabelecida como antiviral para influenza, tm produzido inibio da febre e mortalidade em aves desafiadas via intratraqueal. A aplicao e ao local de drogas antivirais, entretanto, no impede a disseminao do vrus para stios no atingidos pela droga (McCauley et al., 1994; Thomas et al., 1994). Esto atualmente autorizados nos EUA para uso na profilaxia e teraputica de influenza A o hidrocloreto de amantadina e a rimantadina, indicadas na concentrao entre 0,2 e 0,4 /ml. Ambas drogas agem aps a adsorso viral e antes da replicao primria e prognie virais resistentes podem ser isoladas in vivo e in vitro. Estirpes de alta patogenicidade resistentes amantidina so transmitidas para hospedeiros sensveis sem reduo da virulncia. O mecanismo primrio de ao de amantidina e rimantadina baseado na interrupo do fluxo de ons H dos endossomas acidificados para dentro do vrion, um processo n ecessrio para a liberao do complexo de nucleoprotena e cido nuclico, que transportado ao ncleo para transcrio (Murphy & Webster, 1996). Oligopeptdeos com seqncias de aminocidos semelhantes ao N-terminal do polipeptdeo HA2 tm atividade antiviral in vitro. Outra estratgia emprega anlogos do cido silico, os quais diminuem a taxa de replicao dos influenza vrus por impedirem a remoo do cido neuramnico dos receptores da superfcie da clula e do envelope do vrus. O stio de reao do cido silico na NA tem a conformao de uma bolsa para cada uma das quatro subunidades, nas quais os aminocidos so conservados para todos os infuenza vrus (A e B). Dois compostos (4-amino ou 4 guanidino cido 2-deoxy-2,3 didehidro-D-Nacetilneuraminico e 4-amino ou guanidino-Neu 5Ac2en) so altamente eficientes inibidores da NA de influenza vrus. A e B. Entretanto, a gerao de resistncia tem sido preocupante, uma vez que a bolsa da NA no parece ser essencial para o substrato natural (cido silico) e vrions mutantes sem a cavidade podem eliminar a ao de bloqueio sobre a NA (Lamb & Krug, 1996). Vrus produzido em clulas cultivadas na presena de inibidores da neuraminidase no tem a remoo do cido silico aderido HA, NA e receptores da superfcie da clula, inibindo a atividade de adsoro do HA do vrus e receptor celular. Algumas drogas so desenhadas com o auxlio de computao grfica para definir, por exemplo, precisamente os stios relevantes na associao neuraminidase-cido silico (Lamb & Krug, 1996).

Literatura consultada
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