Enzimologa 2010 EJERCICIOS DE CINTICA ENZIMTICA

Facultad de Ciencias

1. Se quiere medir la actividad de la enzima malato deshidrogenasa en un extracto bacteriano. tiempo absorbancia oxalacetato + NADH L-malato + NAD+ (s) Para ello, se coloca amortiguador fosfato pH 7.6, oxalacetato 0.6 0 0.635 mM y NADH 0.1 mM en un volumen total de 3 mL. Se dispara la 20 0.584 reaccin agregando 0.01 mL de extracto bacteriano. Este extracto 40 0.536 contiene 32 mg de protena/mL. Se observa la disminucin de 60 0.484 absorbancia a 340 nm debido a la desaparicin de NADH ( = 80 0.433 6.22 mM-1 cm-1). 100 0.385 a- Cul es la velocidad de reaccin? 120 0.356 b- Calcule la actividad de la enzima por mL de extracto. c- Calcule la actividad especfica de la enzima. 140 0.335 160 0.324 2. La enzima glutamato oxalacetato transaminasa (TGO) se libera a la sangre en el infarto de miocardio. Para analizarla, se mide su actividad siguiendo la desaparicin de NADH acoplndola a la malato dehidrogenasa:
TGO aspartato +-cetoglutarato glutamato + oxala ceto

oxalaceto + NADH malato + NAD +

MDH

En una mexcla de reaccin se coloca un exceso de aspartato (100 veces el Km), 0.1 mL de suero de un paciente, 0.3 moles de NADH y exceso de malato deshidrogenasa para un volumen de 0.9 mL. La reaccin se inicia agregando un exceso de cetoglutarato contenido en 0.1 mL. Luego de un perodo de latencia, se observa un decrecimiento en la absorbancia a 340 nm de 0.04 unidades de absorbancia por minuto siendo la cubeta de reaccin de 1 cm. Calcular la actividad de la TGO en unidades por mL de suero de paciente. 3. Se quiere medir actividad -galactosidasa en un extracto bacteriano que contiene 5 mg de protena por mL de extracto. Para ello, se incuban 0.25 mL de extracto en amortiguador con 3 x 10-3 M de p-nitrofenil -galactsido en un volumen total de 1 mL. Cada 90 segundos, se toman alcuotas de 0.1 mL y se agregan a 2.9 mL de NaOH 0.1 M. Se mide tiempo A400 la formacin de p-nitrofenol a 400 nm, siendo = 18300 M-1 cm-1 en NaOH 90 s 0.068 0.1 M. 180 s 0.135 a- Cul es la actividad de la enzima por mL de extracto? 270 s 0.202 b- Cul es la actividad especfica del extracto? 360 s 0.270 c- Qu controles deben realizarse? 4. Un extracto libre de clulas de Escherichia coli contiene 24 mg de protena por mililitro. Veinte microlitros de este extracto en un volumen estndar de incubacin de 0,1 ml cataliz la incorporacin de glucosa-14C a partir de glucosa-1-fosfato-14C hacia glucgeno a una velocidad de 1,6 nmol/min. Calcular la velocidad de la reaccin en trminos de: a. moles min-1 b. moles L-1 min-1 c. moles min-1 mg de protena-1 d. unidades mL-1 e. unidades mg de protena-1 5. Un extracto crudo libre de clulas contena 20 mg de protena por mililitro. Diez microlitros de este extracto en un volumen de reaccin de 0.5 ml cataliz la formacin de 30 nmoles de producto en 1 min bajo condiciones ptimas de ensayo (pH ptimo y condiciones saturantes de sustratos, coenzimas y activadores). a. Exprese velocidad en trminos de nmoles mL-1 min-1, nmoles L-1 min-1, moles mL-1 min-1,

M min-1. b. Cul sera el valor de la velocidad si los mismos 10 L de extracto fueran ensayados en un volumen total de 1 mL? c. Cul es la concentracin de la enzima en la mezcla de ensayo y en el extracto (en trminos de unidades mL-1)? d. Cul es la actividad especfica de la preparacin? 6. Una preparacin enzimtica tiene una actividad especfica de 42 unidades/mg de protena y contiene 12 mg de protena por mililitro. Calcule la velocidad inicial de la reaccin obtenida en una mezcla de reaccin estndar conteniendo: a. 20 L del preparado enzimtico. b. 5 L del preparado enzimtico. 7. Se ha realizado la purificacin de una enzima. En la tabla se presentan los datos experimentales obtenidos. Complete la tabla.
Protenas Etapa V (mL) 1000 250 Conc. (mg/mL) 12 3 masa total (mg) Actividad enzimtica Actividad (U*/mL) 5 8 Actividad especf. (U/mg) Actividad total (U) Rendimiento (%) Factor de purificacin

Extracto crudo Sulfato de amonio 30-50% DEAESephadex Gel Filtracin

25 30

2.5 1

70 50

* U: unidades de actividad enzimtica, moles de producto formado/min

a- Podemos afirmar que la enzima est pura? b- En qu etapa se logra la mayor purificacin? 8. Un gramo de msculo fresco contiene 40 unidades de una enzima. Estime la concentracin intracelular de la enzima asumiendo que un gramo de msculo fresco contiene 0.8 mL de agua intracelular. a. Sabiendo que el nmero de recambio de la enzima es de 6 x 104 min-1. b. Sabiendo que la actividad especfica de la enzima pura es de 500 unidades/mg y su peso molecular es 120.000. 9. Quince microlitros de una preparacin enzimtica catalizaron la produccin de 0.52 moles de producto en 1 min bajo condiciones ptimas de ensayo. a. Qu cantidad de producto se producir en 1 min por 150 l de la preparacin bajo las mismas condiciones de reaccin? b. Cunto tiempo demorarn 150 l de la preparacin para producir 0.52 moles de producto bajo las mismas condiciones de ensayo? 10. Para el siguiente esquema:

k1 E + S

k-1 a- Derive la ecuacin de Michaelis-Menten asumiendo: 1- equilibrio rpido entre el complejo enzima-sustrato y la enzima y el sustrato libres. 2- la hiptesis del estado estacionario para el complejo enzima-sustrato. b- Qu se asumi respecto a la velocidad, respecto a la concentracin de enzima y respecto a la concentracin de sustrato? c- Cul es el significado de los parmetros KS, KM, kcat y kcat/KM? d- Si k1 = 1 x 107 M-1.s-1, k-1 = 1 x 102 s-1 y k2 = 3 x 102 s-1, calcular KS, KM, kcat y kcat/KM. e- Puede ser k2 mucho mayor que k1? 11. Cmo vara la velocidad de una reaccin catalizada enzimticamente al aumentar la concentracin de sustrato? Y al aumentar la concentracin de enzima? 12. Para una enzima michaeliana, cunto debe aumentar la concentracin de sustrato para que la velocidad pase de 10 % de Vmax a 90 % de Vmax? Y si la enzima presenta cooperatividad positiva? 13. La hexoquinasa cataliza la fosforilacin de la glucosa con un KM de 0.13 mM. glucosa + ATP glucosa 6-fosfato + ADP. a. Qu fraccin de Vmax se observara cuando la concentracin de glucosa corresponde al valor fisiolgico de 5 mM? b. Cuando la glucosa se une a la enzima, sta sufre un cambio conformacional. Recin entonces puede unirse el ATP a la enzima. Qu sentido tiene este fenmeno? 14. Con respecto a las reacciones catalizadas por enzimas indique si las afirmaciones son verdaderas o falsas. a) Una enzima participa en la reaccin alterando la constante de equilibrio de la reaccin, sin alterar la barrera de activacin (Ea). b) El sustrato con menor valor de KM tiene la mayor afinidad aparente por la enzima. c) Una unidad de actividad enzimtica se define como la cantidad de enzima que cataliza la transformacin de un (1) micromol de sustrato por minuto bajo condiciones definidas. d) El nmero de recambio (kcat) es el nmero de moles de sustrato transformado por minuto por mol de centro activo. e) La catlisis puede ser explicada por una unin tipo llave y cerradura entre el sustrato y la enzima. f) La velocidad inicial de una reaccin catalizada enzimticamente es independiente de la concentracin de sustrato. g) La velocidad inicial aumenta proporcionalmente a la concentracin de enzima. h) El KM equivale a la concentracin de sustrato a la cual la velocidad es la mitad de la mxima. i) El KM vara con la concentracin de enzima. 15. Existen diferentes formas de linealizar la ecuacin de Michaelis-Menten: 1/v en funcin de 1/[S] (Lineweaver-Burk) v/[S] en funcin de v (Hanes) [S]/v en funcin de [S] (Hanes-Woolf) v en funcin de v/[S] (Eadie-Hofstee) a.- Reordenar la ecuacin de Michaelis-Menten para las diferentes linealizaciones. b- Cul es el significado de la pendiente, la interseccin con el eje de las y, y de la interseccin con el eje de las x para los diferentes grficos?

k2 ES E + P

16. Durante dao heptico severo se libera a la circulacin una enzima E1. Luego de realizar ejercicio fuerte, una enzima muscular E2, que cataliza la misma reaccin que E1, se libera a la circulacin sangunea. E1 y E2 se pueden diferenciar fcilmente pues los valores de KM son diferentes (KM para E2 es 2 x 10-5 M). El anlisis sanguneo de un paciente muestra los resultados que se muestran en la tabla. Podra decir si el paciente sufre de una enfermedad heptica o simplemente ha realizado mucho ejercicio? 17. La enzima -lactamasa hidroliza la penicilina dejndola inactiva. La cantidad de penicilina hidrolizada en 1 minuto fue medida en funcin de la concentracin de penicilina, en una solucin de 10 mL de volumen final, conteniendo 10-9 g de -lactamasa pura (29.6 kDa). Determinar los parmetros cinticos. Calcular el nmero de recambio. Cunto tiempo dura un ciclo cataltico?

[S] (M) 5.0 x 10-5 7.0 x 10-5 1.0 x 10-4 1.5 x 10-4 2.0 x 10-4 3.0 x 10-4 6.0 x 10-4

v ( mol/mL/min) 43 57 75 100 120 150 200

Penicilina (M) 0.1 x 10-5 0.3 x 10-5 0.5 x 10-5 1.0 x 10-5 3.0 x 10-5 5.0 x 10-5

Moles hidrolizados 0.11 x 10-9 0.25 x 10-9 0.34 x 10-9 0.45 x 10-9 0.58 x 10-9 0.61 x 10-9

18. La enzima fumarasa cataliza la hidratacin del fumarato para dar malato. Esta reaccin tiene un G de 3.8 kJ/mol. Para la enzima de corazn de chancho, se han reportado valores, para la reaccin directa, de KM = 1.7 mM y VMAX = 0.25 mM-1 s-1; y, para la reaccin reversa, de KM = 3.8 mM y VMAX = 0.11 mM-1 s-1. En cambio, para la enzima de una bacteria, se han reportado valores de KM = 1.6 mM y VMAX = 0.024 mM-1 s-1 para la reaccin directa, y KM = 1.2 mM y VMAX = 0.012 mM-1 s-1 para la reaccin reversa. Comente en la plausibilidad de estos reportes.