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MICOLOGA 2004

PRCTICA N 1
PREPARACIN DE REACTIVOS: Aclarantes, Colorantes y Desinfectantes I. OBJETIVO Obtener conocimientos y destreza en la preparacin de reactivos usados en Micologa. II. INTRODUCCIN La identificacin fngica en la actualidad se basa principalmente en el mtodo morfolgico; el cual comprende la tcnica microscpica directa y se realiza a travs del montaje laminado y coloraciones. Los hongos son organismos eucariotes que se alimentan de queratina, mucus, elastina; habitan en la dermis y sus anexos (uas, pelos, escamas), tejido, esputo, sangre, secreciones, lquidos biolgicos, etc. Para poder observarlos es necesario tratar las muestras con reactivos que lisen la queratina, licuen el mucus y las secreciones, pero sin alterar las estructuras fngicas. El aclarante universalmente utilizado es el KOH, a concentraciones diferentes y con ciertas modificaciones. Si le adicionamos un colorante adecuado mejoramos la sensibilidad diagnstica. Aclarante: Sustancias mucolticas y queratinolticas; licuan y lisan tanto el mucus como la queratina, permitiendo evidenciar las estructuras fngicas en especimenes biolgicos. El ms usado es el KOH con sus variantes y modificaciones. Sustancias que tienen la propiedad de transmitir color a otras sustancias; actan selectivamente y no la pierden al ser lavadas con agua. El colorante est formado por: Molcula incolora + cromforo + auxocromo Desinfectante: Sustancias que tienen accin fungiosttica o funguicida. Son usadas para eliminar en forma inocua los especimenes biolgicos, limpiar utensilios, mesas

Colorante:

de trabajo y manos del operador. El ms comn es la leja. I. MATERIALES 1. Reactivos cido Fnico cido Lctico cido Sulfrico Azul de Algodn Bicromato Potasio Glicerina Yodo metlico Perlas de KOH

de

Leja ter Agua destilada Tween 80 Azul de metileno Sudan III Tinta china

2. Materiales de laboratorio 500 II. Balanzas Baguetas Erlermmeyer: 250 ml Esptulas Etiquetas Frascos de vidrio Frascos gotero Mechero de alcohol Papel filtro Papel kraft Pipetas graduadas de 10 ml Probetas graduadas de 100 y 200 ml Botellas de plstico de 1000 ml Algodn

PROCEDIMIENTO 3. Preparacin de Aclarantes: a. Lactofenol de Amann cido fnico cristalizado cido lctico Glicerina Agua destilada 10 g 10 ml 20 ml 10 ml

Preparacin: Disolver el fenol en agua destilada con ayuda de calor suave, aadir luego el cido lctico y la glicerina; envasar en frasco gotero color caramelo y etiquetar. b. Solucin de KOH al 40% Perlas de KOH Agua destilada 40 g 100 ml

c. Solucin acuosa Glicerina de KOH al 40%

Perlas de KOH 40 g Glicerina 20 ml Agua destilada 80 ml Preparacin: Disolver suavemente con ayuda de calor las perlas de KOH en agua destilada, envasar en frasco gotero color caramelo, etiquetar y guardar en un lugar fresco y sin luz. Estable 1 ao. d. Solucin KOH DMSO Dimetil Sulfxido (DMSO) Agua destilada Hidrxido de potasio 40 ml 60 ml 20 g

El dimetil sulfxido inicia la accin de la lisis de la queratina y de la licuefaccin del mucus a temperatura ambiente, evitando el calentamiento. e. Sulfito de sodio al 10% Sulfito de sodio Agua destilada Alcohol de 80 10 ml 75 ml 25 ml

El sulfito de sodio al 10% no da artefactos; es una solucin higroscpica, debe usarse antes de los 2 meses. f. Lauril sulfito de sodio al 5% Lauril sulfito de sodio Agua destilada 5g 95 ml

El lauril sulfito de sodio al 5% no tiene accin antifngica. La muestra biolgica se puede cultivar. El montaje hmedo se debe observar antes de las 3 horas. 4. Preparacin de Colorantes: a. Azul de lactofenol Empleado para el aclaracin y observacin microscpica de estructuras fngicas obtenidas por cultivo. El cido lctico acta como agente aclarante y ayuda a las preservacin de las estructuras micticas; el fenol acta como desinfectante y el azul de algodn colorea las estructuras fngicas. Agua destilada cido lctico 20 ml 20 ml

Azul de algodn Glicerina Fenol

0.05 g 40 ml 20 ml

Preparacin: Disolver el fenol en cido lctico, glicerina y agua calentando ligeramente (slo si se usa fenol en cristales). Despus aadir el azul de algodn, mezclndolo bien. b. Azul de Tripano Se emplea para colorear estructuras de levaduras en microcultivos. Azul de Tripano Agua destilada c. Colorante de KANE Se emplea para visualizar estructuras fngicas en raspados de piel; principalmente en lesiones provenientes de Pitiriasis versicolor. Glicerina Tween 80 Fenol Azul de metileno Agua destilada 10 ml 10 ml 2.5 g 1g 480 ml 1g 100 ml

Preparacin: Disolver el Tween 80 y el fenol en agua destilada, calentando ligeramente. Luego aadir azul de metileno hasta disolver. Conservar en frasco de color caramelo. d. Colorante GUEGUEN Se emplea en montajes semipermanentes, para la demostracin de estructuras fngicas provenientes de cultivos y especmenes biolgicos. cido lctico Sudan III Azul de algodn Solucin de Yodo alcohlica 100 g 0.1 g 0.1 g
(tintura)

10 a 30 gotas

Preparacin: Disolver el Sudan III con el cido lctico en un mortero. Luego someterlo en bao mara de 70 por unos minutos hasta que tome un color rojizo. Dejar en reposo por 24 horas, filtrar con papel filtro. Luego agregar el azul de algodn y la solucin de Yodo. Conservar en frascos color caramelo. El hongo aparece de color azul, ms intenso en la pared que en el protoplasma. Las inclusiones lipdicas se tien de color rosa o rojo y cuando hay glcidos se colorean de color marrn oscuro. Las clulas y los leucocitos se colorean de azul.

e. KOH Glicerina Tinta china Solucin de KOH Glicerina 2 ml Tinta china 2 ml f. Kinyoun modificado: Coloracin cida rpida de Hanks Solucin A Fucsina bsica Etanol al 95% 4g 20 ml

Solucin B Cristales de fenol Agua destilada 8g 100 ml

Mezclar la solucin A y B. Guardar a temperatura ambiente. Es estable por 1 ao. Decolorante: cido Sulfrico al 1% cido sulfrico concentrado Agua destilada 1 ml 99 ml

Azul de metileno Azul de metileno Etanol al 95% 2.5 g 100 ml

Fijador Metanol absoluto Etanol al 50% g. Colorante GIEMSA Solucin stock (Triton X-100, 10% en solucin acuosa) 1 ml Agua destilada bufferada ph 7.0 a 7.2 1000 ml

Guardar en botella oscura. Estable por 1 ao. Se utiliza para observar estructuras intracelulares. h. Colorante Wright Colorante Wright Alcohol metlico absoluto 0.9 g 500 ml

Guardar a temperatura ambiente en frasco de color caramelo. Es estable por 3 aos.

i. Tincin con Lactofenol Azul de Anilina Polivinil Alcohol Polivinil alcohol Agus destilada cido lctico Fenol derretido Azul de anilina 15 g 100 ml 39 ml 39 ml 0.1 g

Agregar el Polivinil alcohol al agua y llevar a bao mara a 80C. Agitar hasta homogenizar y que la solucin se aclare. Agregar el cido lctico y el fenol. Luego agregar 0.1 g de Azul de anilina (0.05%). El Polivinil alcohol minimiza la evaporacin, por cual se usa ms tiempo. Reacciona con el agar y no puede hacerse montaje laminado. 5. Preparacin de Desinfectantes: a. Alcohol ter Alcohol etlico ter 50 ml 50 ml

b. Solucin de Fenol al 5% cido Fnico Agua destilada 5g 100 ml

c. Alcohol yodado Alcohol corriente Yodo metlico 100 ml 2g

d. Solucin de Hipoclorito de sodio Hipoclorito de sodio Agua destilada 4a6g 1000 ml

Si se prepara de cojn y no indica la concentracin, hacer dilucin de 1 en 8. e. Solucin sulfocrmica

Bicromato de potasio cido sulfrico Tnico Agua destilada

50 g 100 ml 1000 ml

Preparacin: Diluir el bicromato de potasio en agua. Colocar el matraz en bao de agua fra o a chorro continuo. Agregar lentamente el cido sulfrico, homogenizar, etiquetar y colocar en un lugar seguro.