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Anticuerpos Los anticuerpos son molculas de peso molecular aproximado de 150 kDa, pertenecientes al grupo de las inmunoglobulinas (Ig).

Son molculas capaces de reconocer otras molculas, los antgenos. La capacidad de reconocimiento de un anticuerpo radica en las secuencias variables de sus cadenas proteicas, generadas por recombinacin de una serie de 'gene cassettes" en el proceso de produccin de los linfocitos B durante el desarrollo embrionario. La combinatoria de estas secuencias puede producir ms de un billn de secuencias diferentes. Esta informacin es almacenada en el 'pool' de linfocitos B presentes en nuestro tejido linftico.

La estructura bsica de un anticuerpo se esquematiza en la figura: formado por dos cadenas proteicas pesadas y dos ligeras, unidas por puentes disulfuro. Se dividen en varias clases que se identifican segn el tipo de cadena pesada en: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. La accin de enzimas proteolticas sobre los anticuerpos permite obtener fragmentos que presentan actividades biolgicas diferenciales. Los fragmentos obtenidos son:

Fc. Corresponde al extremo C-terminal de las dos cadenas pesadas. Este fragmento est constituido por la regin constante de la cadena pesada y es caracterstica de cada clase de inmunoglobulinas. Es en esta regin

donde radican las funciones efectoras de la molcula como son la fijacin del complemento, la interaccin con los receptores celulares de monocitos y macrfagos, la interaccin con la protena A de S. aureus y G de Streptococcus sp. etc... La regin Fc es caracterstica de especie. F(ab')2. Corresponde al extremo N-terminal de las dos cadenas pesadas y a las dos cadenas ligeras. Se obtiene por digestin con pepsina. Tiene reconocimiento divalente del eptope. F(ab). Corresponde al extremo N-terminal de una cadena pesada y a una cadena ligera, unidas por puentes disulfuro. Se obtiene por digestin con papaina. Tiene reconocimiento monovalente del eptope.

De las distintas clases de inmunoglobulinas las que se encuentran predominantemente en el suero de animales inmunizados son las IgM y las IgG. Las IgM se sintetizan durante la respuesta primaria y se asocian en una estructura pentamrica. Su capacidad de reconocimiento de eptopes es por ello de 10. Las IgG se sintetizan tanto durante la respuesta primaria como secundaria, siendo en esta ltima donde se consiguen los mayores niveles de produccin. Su accin bivalente les permite interactuar con ms de una molcula de antgeno.

Antgenos, Antigenicidad e inmunogenicidad. Virtualmente toda molcula ajena a un determinado organismo se comporta frente a ste como un antgeno, Se pueden diferenciar dos caractersticas primordiales en un antgeno. Por una parte la inmunogenicidad o capacidad que presenta una molcula para generar una respuesta inmune en un organismo dado y la antigenicidad o particularidad del antgeno que hace que ste sea reconocido por un determinado anticuerpo. Ambas propiedades pueden o no estar presentes en un determinado antgeno. Molculas de pequeo tamao (haptenos o pptidos) son poco inmunognicas y por ello se asocian a protenas transportadoras de alto peso molecular o 'carriers' para inducir una respuesta inmune adecuada. Macromolculas ubcuas (albminas, citocromos, etc...) o de especies filogenticamente relacionadas, son poco inmunognicas. En estos casos, para obtener una respuesta adecuada es aconsejable utilizar como animal husped una especie filogenticamente alejada a la del antgeno a inocular. Habitualmente se emplean como antgenos puros o previamente enriquecidos mediante tcnicas de concentracin o de separacin electrofortica. Uno de los criterios de mayor importancia en la obtencin de un suero monoespecfico es la inmunizacin con antgenos puros. A la regin del antgeno reconocida por un anticuerpo se le denomina eptope o determinante antignico. Un antgeno puede presentar un nmero variable de eptopes de estructura nica o repetitiva. La complejidad estructural de las protenas favorece que stas presenten por lo general un nmero elevado de

eptopes distintos, mientras que los cidos nucleicos y los polisacridos, dada su repetitividad estructural, poseen un nmero escaso de eptopes diferentes.

Inmunizacin y preparacin del antgeno El proceso de inmunizacin es aquel en el que se inyecta al animal el antgeno en condiciones adecuadas de cantidad, sustancias acompaantes, y nmero de veces, que sean necesarias para conseguir una buena respuesta inmune. En general se divide en dos fases: inmunizacin primaria, en la cual se administra una determinada cantidad de antgeno en presencia de adyuvante, e inmunizacin de recuerdo ('booster'), en la que el antgeno es administrado en forma soluble o bien con adyuvante. Existen numerosos protocolos de inmunizacin, con una duracin variable. Cuando se inmuniza un animal con un antgeno y se provoca una respuesta inmune aumenta notablemente en el suero del animal la cantidad de Ig especficas del antgeno empleado. Esto es la consecuencia de la seleccin clonal de los limfocitos B que producen anticuerpos contra el antgeno. Como hemos visto un antgeno puede presentar diferentes eptopes, y cada uno de ellos ser reconocido por un clon de linfocitos B que producir molculas Ig con una secuencia caracterstica. Por ello en el suero de un animal inmunizado se acumulan un nmero desconocido, posiblemente elevado, de diferentes molculas de Ig especficas en mayor o menor medida de nuestro antgeno. Se trata de un suero producido por la accin de sntesis de numerosos clones de linfocitos B y por ello se ha denominado policlonal.

Interaccin primaria antgeno-anticuerpo. Afinidad y avidez La interaccin entre antgeno y anticuerpo se estabiliza mediante enlaces dbiles, como puentes de hidrgeno, fuerzas de Van der Waals e interacciones electrostticas e hidrofbicas. La suma de todos estos enlaces genera una interaccin estable entre el lugar de unin del anticuerpo (paratope) y el lugar de unin del antgeno (eptope). Estas fuerzas son inversamente proporcionales a una potencia de la distancia entre los grupos interactuantes, lo que implica que eptope y paratope deben presentar estructuras complementarias para obtener una energa de unin suficiente como para resistir la disrupcin termodinmica. La suma de estas fuerzas de atraccin y de repulsin se conoce como afinidad del anticuerpo. Los anticuerpos son molculas multivalentes en su interaccin con el antgeno. Las molculas de inmunoglobulina presentan un mximo de 10 (IgM) y un mnimo

de 2 brazos de unin con el antgeno. En el caso de que este ltimo tambin sea multivalente, presentar un mnimo de dos puntos de anclaje para el anticuerpo correspondiente. Esta interaccin multivalente entre antgeno y anticuerpo permite introducir el concepto de avidez o afinidad funcional.

Especificidad y reaccin cruzada La complementariedad existente entre eptope y paratope condiciona la relacin especfica entre antgeno y anticuerpo. Dicha complementariedad afecta tanto a una relacin espacial entre los grupos qumicos reaccionantes, a la relacin complementaria de cargas netas como a la relacin estrica entre las estructuras reaccionantes. En general los anticuerpos son altamente especficos, siendo capaces de discernir entre pequeas variaciones del antgeno, tanto a nivel de estructura primaria como de conformacin estrica o configuracin ptica del mismo.

Interaccin secundaria antgeno-anticuerpo. En la interaccin in vitro de un antgeno con su correspondiente anticuerpo se distinguen dos etapas, la reaccin primaria no visualizable y la reaccin secundaria, que sigue a la anterior y se caracteriza por la aparicin de un fenmeno visible como la aglutinacin, la precipitacin, etc. Los complejos iniciales que se forman rpidamente, sobre los que dentro de ciertos limites las variaciones de temperatura y concentracin salina tienen poca influencia, se agregan luego para dar diferentes fenmenos visibles cuyas caractersticas dependen en gran parte del estado fsico del antgeno. Esta etapa se acelera con la temperatura, la agitacin y es electrolitodependiente. Es importante separar las etapas de la reaccin antgeno-anticuerpo. Puede ocurrir que se demuestre la presencia de anticuerpo por interaccin primaria, pero que este no sea detectable por interaccin secundaria o terciaria. Esto puede ser consecuencia de variaciones cuantitativas, ya que para conseguir fenmenos visibles son indispensables determinadas concentraciones de anticuerpo, y cualitativas inherentes a las propiedades de la clase de inmunoglobulina comprometida en la respuesta inmune, as como de las caractersticas del ligando. Si bien es posible detectar un anticuerpo mediante estudios de interaccin primaria, ello no significa que siempre deban ocurrir reacciones secundarias o terciarias. Precipitacin

Cuando una anticuerpo, excepcin hecha de los bloqueantes y no precipitantes, es puesto en contacto con una solucin de macromolculas que lo origino, se forman complejos Ac/Ag que se insolubilizan luego en su mayor parte dando una reaccin de precipitacin, que puede ser total o zonal. Es una propiedad de la mayor parte de los anticuerpos y no una caracterstica particular de un determinado tipo al que originalmente se lo llamo anticuerpo precipitante. Precipitacin en medios lquidos Esta reaccin se produce en dos etapas. En la inicial, que se desarrolla rpidamente y es influida muy poco por la temperatura y los electrolitos, se forman los complejos Ac/Ag primarios. A medida que el tiempo transcurre, esos complejos iniciales se agregan, originando micelas de diferentes tamaos, las que finalmente precipitan. Algunos complejos no alcanzan a hacerlo y quedan en solucin. La temperatura acelera esta segunda etapa, siendo adems electrolitodependiente. Es mucho ms lenta que la inicial, puede durar minutos, e incluso horas, para que se complete. La formacin de agregados es una consecuencia de la bivalencia de los anticuerpos y la multivalencia de los antgenos. Con haptenos monovalentes o antgenos que poseen un solo determinante antignico por molcula, la precipitacin no se produce. Un hecho muy particular lo constituyen los anticuerpos monoclonales, que en su mayor parte no muestran actividad precipitante. Ello se debe a que en muchos casos, especialmente cuando estn dirigidos contra macromolculas en solucin, reconocen a un nico epitope no repetido, lo que les impide formar agregados. La formacin de estos diferentes complejos ha sido explicada mediante la llamada teora del enrejado, que considera que la composicin del precipitado formado es una consecuencia del modo en que anticuerpo y antigeno se han unido. Dada la bivalencia del anticuerpo y multivalencia del antigeno, las posibilidades de combinacin varan segn que en la mezcla exista exceso de antigeno, exceso de anticuerpos o equivalencia de ambos. En la zona de exceso de antigeno, los complejos son solubles. Si bien la precipitacin en medios lquidos es muy til para la identificacin de antgenos y anticuerpos, teniendo en cuenta lo anteriormente expuesto en lo relativo a la formacin de los precipitados, la misma puede usarse con fines cuantitativos y constituye un buen mtodo para la medida de la concentracin de los anticuerpos presentes en un suero. Puede usarse tambin para medir niveles de antgeno. Precipitacin en medios gelificados Las macromolculas pueden difundir libremente a travs de geles; dicha difusin esta limitada por la concentracin del gel. Empleando soportes adecuados, en

especial aquellos que como base tienen agar disuelto en electrolitos, es posible hacer migrar antgenos y anticuerpos de modo que al encontrarse interaccionen. Pueden utilizarse tambin geles con base de pectina, alginatos, pliacrilamida y aun tiras de acetato de celulosa gelatinizado. Los precipitados que se originan se visualizan como ntidas bandas de precipitacin, que permanecern estables mientras un mayor aflujo de molculas de los reactivos no provoquen su redisolucin. Se han descripto numerosas tcnicas cualitativas y cuantitativas basadas en este principio, entre las que pueden citarse la difusin simple monodimensional, difusin doble monodimensional, difusin doble bidimensional, difusin radial, etc.. Difusin simple monodimensional Se coloca en un tubo de ensayo pequeo agar fundido, solucin al 1% en cloruro de sodio 0,15 M, mezclado con un volumen igual del antisuero para analizar. Producida la solidificacin, se aade la solucin de antigeno. Por difusin a travs del gel el antigeno va penetrando, creando un gradiente de concentracin. En la interfase gel-liquido no se forman precipitados, dada la alta concentracin antignica, y aparecen con la forma de bandas cuando la concentracin del antigeno que ha difundido es la optima. Si en el suero haba mas de un anticuerpo y en la solucin aadida mas de un antigeno que se correspondan, se formara tantas bandas de precipitacin como sistemas hayan interaccionado. Esto no es exacto, pues si se tiene en cuenta que dichas separaciones dependen de las velocidades de difusin de las diferentes molculas antignicas, solo ser cierto si aquellas son distintas. El numero de bandas de precipitacin nos indica la cantidad mnima de sistemas reaccionantes presentes. Esto tambin es relativo, ya que es indispensable que los reactivos no estn en concentraciones inferiores a las necesarias para que la reaccin ocurra. Difusin doble monodimensional En este caso la reaccin se efecta colocando en la parte inferior del tubo un volumen de agar al 1 % fundido, mezclado con partes iguales del antisuero. Producida la gelificacin, se agrega agar al 0,5 % en solucin salina, en un volumen igual a la mitad del anterior. Despus de la solidificacin se cubre todo con un volumen de agar al 1 % fundido, mezclado con igual volumen de la solucin antignica. Antgenos y anticuerpos migrarn hacia la zona media e interaccionarn desencadenndose la precipitacin cuando las concentraciones sean las ptimas. Estando la difusin en relacin directa con la concentracin de la sustancia que difunde, la banda de precipitacin estar ms prxima a la zona del antgeno cuando hay exceso de anticuerpo, y ocurrir lo inverso en caso contrario.

Este es un buen mtodo cualitativo que permite demostrar varios sistemas reactivos simultneos, cosa que no ocurre en la precipitacin en medios lquidos. Pueden detectarse hasta 10 g/ml de anticuerpo.

Difusin doble bidimensional Un interesante mtodo de doble difusin en placas fue descripto por Ochterlony. Consiste en enfrentar en pequeas perforaciones efectuadas en el agar, y a

distancias convenientes, las soluciones de antgeno y de anticuerpo. Al difundir ambos y ponerse en contacto, producirn una banda de precipitacin cuando estn en la relacin ptima. Con esta tcnica puede tenerse una idea de las relaciones entre los pesos moleculares de los antgenos y anticuerpos reaccionantes. Trabajando con concentraciones ptimas de Ag y de Ac, si la banda de pecipitacin formada es recta, indica que los pesos moleculares de ambos son muy prximos. Si la banda es cncava con especto al reservorio del antgeno, seala que el peso molecular de ste es superior al del anticuerpo, siendo menor en el caso en que la banda presente convexidad. Todo esto es una consecuencia de las leyes generales de la difusin, que establecen que la distancia a la que una sustancia difunde est en relacin directa con su concentracin y en relacin inversa con su peso molecular. Mediante esta metodologa, es posible identificar varios sistemas reaccionantes simultneamente, pues cada uno de ellos dar una banda de precipitacin especfica y, adems, investigar reacciones cruzadas, pues en estos casos habr fusin de bandas. Originariamente Ochterlony describi, de acuerdo a este hecho, tres tipos de reacciones. Fueron denominadas como reacciones de identidad, no identidad e identidad parcial. En el primer caso, los dos sistemas reactivos se funden en una nica banda de precipitacin. Si los sistemas no son iguales (reacciones de no identidad), cada uno reacciona independientemente originando bandas de precipitacin que se cruzan. Cuando uno de los antgenos analizados tiene algn componente capaz de dar una reaccin cruzada con el anticuerpo elaborado por el otro (identidad parcial), las bandas de precipitacin de ambos sistemas se unen y funden parcialmente en una banda, apareciendo una prolongacin o espoln en la correspondiente al antgeno que se emple para la obtencin del antisuero. Esto indica que en este antgeno hay componentes antignicos no compartidos con el restante.

Difusin radial (Tcnica de Mancini) Cuando un antgeno es colocado en un orificio circular practicado en una placa de agar, al cual se adicion anticuerpo monoespecfico, difunde en forma radial y, de acuerdo con los principios bsicos de la difusin, el dimetro del halo de precipitacin est en relacin directa con su concentracin. Si a esta operacin se la efecta colocando en varios orificios de la placa cantidades variables conocidas del antgeno especfico para el antisuero mezclado con el agar y se lo deja a temperatura ambiente hasta que el halo de precipitacin no se modifique, con los resultados obtenidos se puede confeccionar una curva relacionando el dimetro de los halos de precipitacin con las correspondientes concentraciones antignicas. Esta curva permite calcular la concentracin de ese mismo antgeno en cualquier muestra desconocida. La difusin radial se utiliza en la cuantificacin de protenas que se encuentran presentes en mezclas complejas como lo son los componentes del suero humano. Es indispensable disponer para ello de antisueros monoespecficos destinados a los antgenos que se quieren valorar.

Bibliografa http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/anticuerpos.htm#arriba Inmunologa e Inmunoqumica. Margni, R. A., 5 edicin Editorial Mdica Panamericana 1996.