№4, 2012 Ведомости НЦЭСМП

ИЗУЧЕНИЕ ДНК ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ

НА ПРИМЕРЕ РОДА ANTHYLLIS L.

В.М. Баева1 , К.Э. Вальехо-Роман2, Т.Х. Самигуллин2

1
Московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова, Москва
2
Научно-исследовательский институт физической химии им. А.Н.Белозерского, Москва
verabaeva@mail.ru
Резюме: Изучена ДНК представителей рода Anthyllis L. для систематической характеристики перспективных лекар-
ственных видов по определенным критериям строения генома и описаны характеристики подлинности перспективного сырья
по определенным маркерам.
Ключевые слова: лекарственные растения, род язвенник, геном, полимеразная цепная реакция.

STUDYING MEDICINAL HERBS DNA AS EXEMPLIFIED BY ANTHYLLIS L.

V.M. Baeva, K. E. Vallejo-Roman, T.H. Samigullin
Abstract: The DNA of the representatives of Anthyllis L. has been studied for the purpose of the systematic characteristics of promising
medicinal species with certain genome structure criteria. The identity characteristics for certain markers of promising raw materials have
been described.
Key words: medicinal herbs, Anthyllis, genome, polymerase chain reaction.

В настоящее время возрождение интереса к ле-
карственным средствам природного происхожде-
ния поддерживается данными, полученными до-
казательной медициной за последние десятилетия.
Многие лекарственные растения, применяемые ве-
ками традиционной медициной, могут служить до-
полнительной сырьевой базой для получения новых
эффективных и безопасных лекарств.
Обширное семейство бобовые – Fabaceae вклю-
чает много пищевых и лекарственных растений,
синтезирующих разнообразные ценные биологи-
чески активные вещества, которые могут явиться
основой для перспективных лекарственных препа-
ратов. Представители семейства из рода язвенник
М А Т Е Р И А Л Ы
ловый наркоз, угнетает спонтанную двигательную
активность, повышает порог болевой реакции, т.е.
оказывает угнетающее действие на ЦНС [1].
Большинство авторов, в том числе и зарубеж-
ных, не дифференцирует виды рода. Поэтому для
выявления наиболее перспективных для отече-
ственной медицины растений нам представляется
целесообразным использование молекулярно-био-
логических методов, позволяющих характеризовать
их по определенным критериям строения генома
и описать характеристики подлинности сырья по
определенным маркерам. Систематические связи
рода Anthyllis L. активно изучаются по морфологиче-
ским признакам [2, 3] и представляется интересным

– Anthyllis L., такие как я. ранозаживляющий, я.
крупноголовчатый и я. опушенный имеют богатый
химический состав, включающий стероидные сапо-
нины, кумарины, дубильные вещества и флавонои-
ды, углеводы и их производные и др. В литературе
описаны лекарственные свойства трех видов язвен-
ника: я. крупноголовчатого, я. опушенного и я. ра-
нозаживляющего [1].
Трава и цветки язвенника в традиционной (на-
родной) медицине находят применение как успока-
М Е Т О Д И Ч Е С К И Е
и новым изучение ДНК видов этого перспективного
рода в сравнении.
Цель настоящей работы: изучение ДНК предста-
вителей рода Anthyllis L. для систематической харак-
теристики перспективных лекарственных видов по
определенным критериям строения генома и опи-
сание характеристики подлинности перспективного
сырья по определенным маркерам.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ивающее, при бессоннице и эпилепсии, противовос- Объектом исследования явились: Anthyllis

палительное и ранозаживляющее, при язве желудка,
ревматизме, бронхите, гриппе, кашле, бешенстве,
диаррее, острых энтеритах и энтероколитах, диабете.
Применение настоя надземной части язвенника при
язвенной болезни желудка и болях в нем, возможно,
обусловлено седативным и антибактериальным дей-
ствием и его положительным влиянием на трофику
тканей желудка. Имеются данные о возбуждающем
и тонизирующем действии препаратов язвенника.
В эксперименте показано, что сумма флавоноидов
(100 мг/кг) внутрибрюшинно продлевает барбами-
vulneraria L., − язвенник ранозаживляющий, а так-
же Anthyllis cornicina L., Anthyllis cytisoides L., Anthyllis
lagascana Benedí, Anthyllis lotoides L., Anthyllis hamosa
Desf., Anthyllis circinnata L., Anthyllis barbajovis L.,
Anthyllis hermanniae L., Anthyllis ramburei Вoiss., Anthyllis
tejedensis Boiss., Anthyllis terniflora (Lag.) Pau. [2], пред-
ставители других родов трибы Loteae [2].
Препараты ДНК получали СТАВ-методом [6] с
небольшими модификациями. Препараты ДНК хра-
нили при –20°С.
Методика проведения полимеразной цепной

54
Ведомости НЦЭСМП №4, 2012

Таблица 1. Последовательности использованных в работе

праймеров полученного продукта амплификации использова-
ли набор NucleoSpin® Extract II (Marcherey-Nagel
Название
праймера
Последовательность праймера Длина GmbH&Co).
Методика проведения секвенирования. Определение
L 5’-TCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG-3’ 23 н. нуклеотидных последовательностей ДНК проводили
2 5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’ 20 н. методом циклического секвенирования с использо-
ванием набора реагентов ABI Prism BigDye Terminator
3 5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’ 20 н.
v. 3.1. с последующим анализом продуктов на авто-
4 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGT-3’ 20 н. матическом секвенаторе ДНК ABI Prism 3100-Avant
(Applied Biosystems) в Межинститутском Центре кол-
F rps16 5´-AAACGATGTGGTAAAAAGCAAC-3´ 22 н.
лективного пользования «Геном» (Институт молеку-
R rps16 5´-GGATCATAAAAACCCACTTTCC-3´ 22 н. лярной биологии РАН им. В.А. Энгельгардта).
PI petB Для построения филогенетических деревьев ис-
5´-GCCGTMTTTATGTTAATGC-3´ 19 н.
1411 F пользовали метод объединения соседей NJ (neighbor-
PI petD
joining), метод максимальной экономии (maximum
5´-AATTTAGCYCTTAATACAGG-3´ 20 н. parsimony methods, MP). В качестве статистической
738 R
поддержки индивидуальных узлов при построении
реакции (ПЦР) подробно описана в нашей преды- филогенетических деревьев применялся метод бут-
дущей работе [2]. Для амплификации внутренних стрепа.
транскрибируемых спейсеров рибосомного оперона Байесовская реконструкция филогении (MB) была
ядДНК использовали праймеры, комплементарные L проведена с помощью программы MrBayes 3.1 [4].
и 4. При секвенировании ITS 1 и ITS 2 использова-
ли наряду с внешними праймерами пару внутренних РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
праймеров 2 и 3. Для амплификации хлоропластного (Молекулярный и филогенетический анализ)
участка pet B-petD были использованы праймеры: PI Нами было выделено 15 препаратов ДНК из гер-
pet B 1411 F и PI petD 738 R [12], для хлоропластно- барного материала СТАВ-методом [6]. Далее были
го участка интрона гена rps 16 праймеры: F rps 16 и R определены с прямого и обратного праймеров нукле-
rps 16. Последовательности использованных в работе отидные последовательности участка ITS1-2 яд-рДНК
праймеров представлены в таблице 1. у 25 таксонов трибы Loteae семейства Leguminosae.
Реакционная смесь содержала около 20 нг ДНК; Помимо этого, были получены последовательности
60 мМ трис-HCl (pH 8,5); 25 мМ KCl; 1,5 мM MgCl2; хлоропластных участков petB-petD и rps16 хпДНК у
10 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,1% Тритон Х-100; 200 25 таксонов этой же трибы [7, 8]. Данные о размерах
мкМ каждого dNTP; 12,5 пМ каждого праймера и 2,5 участков, нуклеотидном составе, объеме выборки ана-
ед. Taq ДНК-полимеразы («Сибэнзим»). лизируемых таксонов, длине выравнивания, а также

Условия проведения реакции амплификации (ав-
томатизированный вариант). Амплификцию про-
водили в термоциклере фирмы Biometra (Göttingen,
Germany) модель Т3000 по схеме: ITS 1-2 [5].
Методика очистки амплификата. Для очистки
М А Т Е Р И А Л Ы
количестве вариабельных и информативных позиций
в каждом исследуемом участке генома приведены в та-
блице 2.
Всего при анализе участка ITS 1-2 были выявле-
ны 281 постоянная позиция и 318 вариабельных из

Таблица 2. Характеристики длины, нуклеотидного состава и выравнивания изученных последовательностей в рассма-

триваемой группе Leguminosae

Нуклеотидный состав, % Число позиций М Е Т О Д И Ч Е С К И Е

Число
Размер Длина вы-
Информативных

Участок таксонов в
участка, равнива-
Вариабельных

генома выравни-
п.н. ния, п.н.
вании А С G Т

ITS 1-2 25 452-618 689 22,8 26,1 226,5 24,6 214 104

petB-petD 25 847-955 1082 32,6 15,1 18,8 33,5 88 144

rps16 25 838-931 1029 33,5 13,4 19,7 33,4 89 167

55
 №4, 2012
них: 104 неинформативных и 214 информативных; на
участке petB–petD выявлено 682 постоянных позиции
и 232 вариабельных из них: 144 неинформативных и 88
информативных; в интроне гена rps16 615 постоянных
позиций и 256 вариабельных: 167 неинформативных и
89 информативных [9, 10]. Уровень различий в нукле-
отидных последовательностях участка ITS 1-2 внутри
рода Anthyllis семейства Leguminosae составил 14,4%,
для участка petB-petD – 3,7%, для участка rps16 – 3,9%.
Нами были отмечены значительные различия
между ядерными и хлоропластными участками по ну-
клеотидному составу: для ядерного участка ITS 1-2 в
целом характерно довольно высокое содержание GC-
пар (52,5%), в то время как хлоропластные участки
petB-petD (33,9%) и rps16 (33,1%) богаты АТ-парами.
Для участка ITS 1-2 обнаружена вариабельность по
длине, которая обусловлена инделями [5, 6], дуплика-
циями и амплификациями отдельных фрагментов из
1-59 п.н. общим числом 39, возникновение которых,
вероятно, связано с механизмом «проскальзывания»
при репликации. На участке petB-petD число инделей
составило 34, а их размер варьировал от 1-145 п.н., на
участке rps16 – число инделей – 43, длина – 1-48 п.н.
Для всего рода Anthyllis характерны: вставка из трех ну-
клеотидов (GTG) на участке ITS1-2 и вставка (AAGТ)
в интроне гена rps 16. При анализе участков ядерной
ДНК построено филогенетическое дерево методом NJ
по участку ITS 1-2 [5]. Распределение видов на фило-
генетическом дереве и маркирование согласуется с
системой Д.Д. Соколова [3], в которой подрод Anthyllis
sensu Akulova разделен на три самостоятельных под-
рода [3]: Anthyllis s.str, Terniflora и Barba-Jovis. Эти рас-
тения похожи на представителей подрода Terniflora
элементарными соцветиями с предлистом, располо-
М А Т Е Р И А Л Ы
женным в их верхней или средней части (особенность,
не отмеченная у других видов трибы). В то же время,
ось элементарного соцветия у видов подрода Anthyllis
укороченная, а не удлиненная в нижней части, как у
видов подрода Terniflora. Помимо строения соцве-
тий, виды подрода Anthyllis отличаются от других ви-
дов рода по строению (в том числе анатомическому)
плодов и чашечки [3]. Изолированное положение на
филогенетическом дереве вида Аnthyllis vulneraria, ха-
рактеризуемого рядом уникальных морфологических
М Е Т О Д И Ч Е С К И Е
особенностей и помещаемого в отдельный подрод
Anthyllis, подтверждается также данными об инделях:
вставка из 6 п.н. (ATAACA) на участке petB-petD.
К подроду Terniflora относят два вида (A. terniflora и
A.cytisoides), которые резко отличаются от всех осталь-
ных видов Loteae листорасположением в 1/3 или 2/5 (а
не в 1/2) и элементарными соцветиями – кистями (а
не головками или зонтиками) [3]. Их отличие от других
видов подтверждает и анализ молекулярных маркеров:
делеция двух нуклеотидов (АТ) на участке ITS 1-2 и две
вставки в интроне гена rps 16 длиной 9 (TTTTTTCTA)
и 6 (ATCATA) п.н.
56
Ведомости НЦЭСМП
Большинство видов рода включают в подрод
Barba-Jovis. В пределах этого подрода выделяют 5 сек-
ций [3]. Следует отметить, что подрод Barba-Jovis рода
Anthyllis, не имеющий специфических инделей, и на
морфологическом уровне характеризуется только ком-
плексом симплезиоморфий [3] и колозиоморфий [3].
Для всех видов подрода Cornicina на участке ITS 1-2
характерна делеция 7 п.н. (CACCATG).
Анализ полученных данных о последовательностях.
Набор из 25 выравненных последовательностей участ-
ка ITS ядДНК содержит 689 позиций, из которых 90
позиций были удалены из анализа, поскольку пред-
ставляли собой области неоднозначного выравни-
вания. Таким образом, в анализ было включено 599
позиций, из которых 281 были постоянными, 214 пар-
симонно-информативными и 104 парсимонно-неин-
формативными. Набор последовательностей участка
petB-petD содержит 1082 позиции, из которых 168 были
исключены из анализа. Следовательно, в анализ было
включено 914 позиций: 682 постоянные, 88 информа-
тивных и 144 неинформативных. Набор интрона гена
rps16 содержит 1029 позиций, 158 были исключены из
анализа. Анализ включал в себя 871 позицию: 615 –
постоянных, 89 – информативных и 167 – неинфор-
мативных.
Филогенетические деревья строили с помощью
методов ближайшего связывания, максимальной эко-
номии и методом Байеса (NJ, MP и MB). Деревья, по-
строенные разными методами, имеют не идентичные,
но не противоречащие друг другу топологии [4].
Согласно новейшей системе трибы Loteae [3] род
Anthyllis делится на несколько подродов: Barba-Jovis,
Terniflora, Cornicina и Anthyllis. Анализ с использовани-
ем участка ITS 1-2 подтвердил наличие четырех под-
родов, при этом подрод Terniflora имеет уровень под-
держки бутстрепа 100%, подрод Barba-Jovis – 100%,
подрод Cornicina – 93%, подрод Anthyllis становится
сестринской группой для всех остальных видов рода
(71%).
На основании участка ITS 1-2 выделяется четы-
ре клады подродов: Barba-Jovis, Terniflora, Cornicina
и Anthyllis. Клада подрода Barba-Jovis пропадает на
остальных деревьях, построенных по участкам petB-
petD, rps16 и объединенном дереве. Подрод Anthyllis не
имеет четкого родства и в зависимости от участка, на
основании которого строилось дерево, занимает раз-
личные положения.
На всех построенных деревьях род Anthyllis вы-
является как монофилетическая группа (1.00 на всех
четырех деревьях). Независимо от участка, по которо-
му строили дерево, стабильно выделяются две клады:
подрод Terniflora и Cornicina, апостериорная вероят-
ность 1.00 для обеих клад. Подрод Anthyllis группиру-
ется с представителями подрода Barba-Jovis с довольно
высокой вероятностью (0.82 по участку ITS 1-2, 0.99 по
участку rps16 и на объединенном дереве).
Ведомости НЦЭСМП
В пределах рода Anthyllis нами были обнаружены
интересные комбинации инделей, которые достаточ-
но хорошо согласуются с распределением видов на
филогенетических деревьях и маркируют выделяемые
в пределах каждого рода подроды, согласно системе
Д.Д. Соколова [3]. Следует отметить, что подрод Bаrba-
Jovis рода Anthyllis, не имеющий специфических инде-
лей, и на морфологическом уровне характеризуется
только комплексом симплезиоморфий [3]. Изолиро-
ванное положение на филогенетическом дереве вида
Anthyllis vulneraria, характеризуемого рядом уникаль-
ных морфологических особенностей и помещаемого
в отдельный подрод Anthyllis, подтверждается также
данными об инделях. Сравнение топологий деревьев,
построенных разными методами и по разным иссле-
дуемым участкам, показывает, что род Anthyllis выяв-
ляется как монофилетический. В том случае, когда
виды одного подрода не формируют самостоятельную
группировку со значимым уровнем поддержки, как,
например, в случае представителей подрода Barba-
Jovis на деревьях, построенных при помощи метода
максимальной экономии, максимальной экономии с
использованием бутстреп-анализа и метода Байеса по
всем участкам, кроме ITS 1-2, то их расположение на
дереве, однако, не противоречит гипотезе о монофи-
лии подрода.
На основании филогенетического анализа уста-
новлено, что род Anthyllis проявляет себя как монофи-
летическая группа с высокими уровнями поддержки
при анализе как ядерных, так и хлоропластных марке-
ров. Изолированное положение на филогенетических
деревьях вида Anthyllis vulneraria L., характеризуемого
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический
состав, использование. Т.3. Л.: Наука, 1987. 326 с.
2. Баева В.М., Вальехо-Роман К.Э., Самигуллин Т.Х. Изучение расте-
ний рода язвенник с использованием секвенирования ДНК. Фарма-
ция, 2009. № 3. С. 23-26.
3. Соколов Д.Д. Морфология и система трибы Lotеae DC. семейства
Leguminosae. Диссертация докт. биол. наук. М., 2003. 466 с.
4. Alfaro M.E., Zoller S., Lutzoni F. Bayes or bootstrap? A simulation study
comparing the performance of Bayesian Markov chain Monte Carlo
sampling and bootstrapping in assessing phylogenetic confidence //
Mol. Biol. Evol. 2003. Vol. 20. P. 255-266.
№4, 2012
рядом уникальных морфологических особенностей
и помещаемого в отдельный подрод Anthyllis, под-
тверждается также полученными данными об инделях:
вставка из 6 п.н. (ATAACA) на участке petB-petD.
Эти молекулярные маркеры (индели) могут быть
рекомендованы для изучения лекарственных растений
молекулярно-филогенетическими методами.
Язвенник ранозаживляющий заслуживает при-
стального дальнейшего фармакогностического из-
учения, поэтому выявленные молекулярные маркеры
могут быть рекомендованы также при установлении
подлинности нового вида перспективного лекарствен-
ного сырья.
ВЫВОДЫ
1. Распределение видов на филогенетическом де-
реве согласуется с системой Д.Д. Соколова, и род
Anthyllis разделяется на четыре подрода: Anthyllis
s.str, Terniflora, Cornicina и Barba-Jovis, что под-
тверждается данными об инделях в различных
участках генома.
2. Для всего рода Anthyllis свойственны: вставка
из трех нуклеотидов (GTG) на участке ITS 1-2 и
вставка (AAGТ) в интроне гена rps16.
3. Виды, родственные связи которых не выявляются
однозначно по молекулярным данным, нередко не
находят однозначного места в системе и по дан-
ным морфологии (например, Anthyllis vulneraria).
4. Все выявленные молекулярные маркеры (индели)
могут быть рекомендованы для идентификации
ЛРС молекулярно-филогенетическими методами.
М А Т Е Р И А Л Ы
5. Álwares I., Wendel J.F. Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic
inference // Mol. Phylogenet. Evol. 2003. Vol. 29. P. 417-434.
6. Edgar R.C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy
and high throughput // Nucleic Acids Res. 2004. Vol. 32. № 5. P. 1792-
1797.
7. Kelchner S.A. The evolution of non-coding chloroplast DNA and its
application in plant systematics // Ann. Missouri Bot. Gard. 2000. Vol. 482-
498.
8. Löhne C., Borsch T. Molecular evolution and phylogenetic utility of the
petD group II intron: a case study in basal angiosperms // Mol. Biol. Evol.
2005. Vol. 22. № 2. P. 317-332.
М Е Т О Д И Ч Е С К И Е
57